Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы 11
Глава 1. Роль микроорганизмов в круговороте фосфора 11
Глава 2. Поглощение фосфата микроорганизмами 17
Глава 3. Формы и способы резервирования фосфата у микроорганизмов 22
3.1. ПолиР - основной резерв фосфата в клетках микроорганизмов 22
3.2. PPL в качестве фосфорного резерва 30
3.3. Полимерные ортофосфаты металлов (ПОщ) 31
3.4. Минерализация цианобактерий - необычный способ резервирования фосфата 33
3.5. Накопление ортофосфата 35
3.6. Резервирование фосфата в виде органических соединений 35
Часть 2. Материалы и методы исследования 40
1. Объекты исследования 40
2. Состав сред культивирования 40
3. Подготовка биомассы для анализов 42
4. Разрушение биомассы 42
5. Экстракция фосфорсодержащих фракций из биомассы 44
6. Экстракция полимерного ортофосфата Ms 2+ (ПОм^ 46
7. Осаждение полифосфатов 47
8. Хроматография полифосфатов на бумаге 47
9. Электрофорез полифосфатов в ПААГ 47
10. Очистка полифосфатов от примесей ортофосфата и пирофосфата 48
11. Определение Фосфогидролазных активностей 48
12. Ультратонкие срезы 49
13. Аналитические методы 50
13.1. Определение общего фосфора 50
13.2 Определение ортофосфата 50
13.3. Определение пирофосфата 51
13.4. Определение элементного состава водонерастворимых осадков 52
13.5. Определение белка 52
13.6. Определение ДНК 53
Часть 3. Результаты исследования и их обсуждение 54
3.1. Поглощение фосфата клетками галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum 54
3.1.1. Поглощение фосфата галофильными археями Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum 54
3.1.2. Влияние концентрации P, нарост галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum 56
3.1.3. Поглощение Pt галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum 59
3.1.4. Влияние концентрации P, нарост галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum в среде с нормальной и
повышенной соленостью 61
3.2. Влияние некоторых эффекторов на процесс поглощения Pi галофильными археями Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum 63
3.2.1. Влияние протонофора карбонилцианид - (трифторметокси) фенилгидразон (ФКФ) 63
3.2.2. Влияние М и ЭДТА на поглощение Pi галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum 66
3.3. Содержания некоторых фосфорных соединений в биомассе галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum 73
3.4. Получение водонерастворимого осадка фосфата из биомассы и его анализ 11
3.5. Изменение морфологии клеток галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum и галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum в процессе накопления Pi 80
3.6. Использование фосфата магния в качестве фосфатного резерва изучаемыми микроорганизмами при росте на Pj-дефицитной среде 88
3.7. ПолиРи некоторые фосфогидролазы у галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum 93
3.7.1. Доказательство наличия полиР 94
3.7.2. Динамика содержания полиР в проиессе роста галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum на средах с различной начальной концентрацией Р, 95
3.7.3. Изменение длины цепи полиР у галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum в процессе роста на среде с начальной концентрацией фосфата 2,3 мМ 99
3.7.4. Влияние начальной концентрации Р, в среде на активность некоторых фосфогидролаз в процессе роста галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum 101
3.8. Влияние условий повышеной солености на полиРи экзополифосфатазную активность у галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum 105
3.8.1. Сравнение содержания различных фракций полиР в процессе роста Brevibacterium antiquum в отсутствии и в присутствии 3MNaCl в среде культивирования 105
3.8.2. Свойства экзополифосфатазы галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum 108
3.8.3. Влияние условий культивирования на экзополифосфатазную активность галотолерантной эубактерии Brevibacterium antiquum 111
Заключение 115
Выводы 118
Список литературы 119
- Минерализация цианобактерий - необычный способ резервирования фосфата
- Влияние концентрации P, нарост галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum
- Влияние М и ЭДТА на поглощение Pi галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum
- Влияние начальной концентрации Р, в среде на активность некоторых фосфогидролаз в процессе роста галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сравнительное изучение поглощения и резервирования фосфата клетками микроорганизмов, относящихся к различным систематическим группам, является актуальным с точки зрения понимания того, как происходит их приспособление к изменяющимся условиям окружающей среды, в том числе и к выживанию в средах с избыточным или недостаточным количеством фосфора. Такие исследования важны также для разработки биотехнологии очистки окружающей среды от избытка фосфата.
У большинства изученных к настоящему времени микроорганизмов накопление фосфора в клетках в первую очередь осуществляется в виде неорганических полифосфатов (полиР), линейных полимеров ортофосфорной кислоты (Кулаев, 1975; Kulaev & Vagabov, 1983; Kornberg 1995, 1999; Kulaev et al., 1999). Однако, у микроорганизмов, стоящих на различных стадиях эволюционного развития, а также обитающих в различных природных условиях, способы резервирования фосфора могут весьма существенно отличаться. Известны такие формы запасания этого компонента, как полимерный ортофосфат металлов у грибов (Окороков и Кулаев, 1968; Окороков и др., 1971), тейхоевые кислоты клеточных стенок у некоторых бактерий (Grant, 1979), накопление пирофосфата в специальных органеллах -ацидокальцисомах у некоторых водорослей и простейших (Moreno & Docampo, 2001) и хроматофорах у фотосинтезирующих бактерий (Baltscheffsky, 1968). У цианобактерий обнаружено накопление ортофосфата в виде минеральных чехлов на поверхности клеток (Герасименко и др., 1998).
В настоящее время процесс накопления фосфата и участие в нем полифосфатов в наибольшей степени изучены у Escherichia colt, дрожжей и обитающих в сточных водах бактерий рода Acinetobacter. Значительное разнообразие фосфорного метаболизма у микроорганизмов делает актуальным расширение спектра объектов, у которых изучается эта проблема. Поэтому изучение механизмов реализации способности к накоплению фосфата у галофильных архей и галотолерантных бактерий, совершенно не изученных в этом отношении, представляется перспективным^как^сточки зрения сравнительной биохймииТтак и в свете решения биотехнологических задач.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение особенностей поглощения и резервирования фосфата галофильными археями Halobacterium salinarium ЕТ 1001 и Halonibrum distributum BKM В - 1739, a также галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum BKM Ac - 2118.
Были поставлены следующие задачи:
Изучить способность к поглощению фосфата из культуралыюй среды клетками Н. salinarium, Н. distributum и В. antiquum в различных условиях культивирования и выяснить, является ли это поглощение энергозависимым процессом;
Определить, какой компонент является у данных микроорганизмов основным резервом фосфата;
Опредечить содержание полифосфатов и активность некоторых
рис, национальная]
БИБЛИОТЕКА I
СПетербург^Л
фосфогидролаз в клетках указанных культур в процессе роста и оценить возможную роль полифосфатов в резервировании фосфата;
4) Изучить влияние условий повышенной солености на накопление фосфата и метаболизм полифосфатов у галотолерантной эубактерии В. antiquum.
Научная новизна работы. Одним из основных результатов выполненной работы является выявление новых высокоэффективных поглотителей фосфата, которыми оказались галотолерантная эубактерия Brevibacterium antiquum, способная к росту, как в отсутствие, так и в присутствии 3 М NaCl, и галофильные археи Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum, растущие только в присутствие 3-4 М NaCl. Клетки этих прокариот поглощали свыше 90% фосфата из среды культивирования в диапазоне концентраций от 2,3 до 11,5 мМ посредством энергозависимого транспорта.
В клетках указанных микроорганизмов впервые обнаружена новая форма запасания фосфата в виде водо-нерастворимых фосфатов магния. Накопление этих соединений приводит к значительным изменениям морфологии клеток Н. salinarium, Н. distributum и В. antiquum. Накопленный резерв может составлять до 80 % от всего фосфата, поглощенного клетками и расходоваться в условиях недостатка фосфата в среде культивирования.
Показано, что условия повышенной солености (ЗМ NaCl) приводят к существенным изменениям в обмене полифосфатов у В. antiquum: исчезает экзополифосфатазная активность, которая имеется при росте в отсутствие соли в среде, а также увеличивается содержание полифосфатов. На основании этих данных предположено, что у В. antiquum полифосфаты могут выполнять функцию осмопротекторов и увеличивать способность В. antiquum к выживанию при солевом стрессе.
Научно-практическое значение работы. В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды избытком фосфата приобрела большое значение вследствие широкого применения фосфорных удобрений и моющих средств. Для решения этой проблемы в мировой практике широко применяются процессы удаления фосфата из сточных вод за счет поглощения его различными микроорганизмами и микробными сообществами. Для понимания биохимических основ таких процессов и их дальнейшего усовершенствования необходим сравнительный анализ механизмов транспорта и накопления фосфата в клетках микроорганизмов, а также отработка удобных экспериментальных моделей для таких исследований. Выявленные в данной работе микроорганизмы, высокоэффективные поглотители фосфата, могут служить хорошей экспериментальной моделью, а также в перспективе быть использованы при разработке микробиологических основ подобных процессов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит таблиц и рисунков. Библиографический указатель содержит источника литературы.
Минерализация цианобактерий - необычный способ резервирования фосфата
В работах Герасименко и коллег показана возможность прижизненного образования минеральных фосфатных чехлов на нитях (трихомонах) цианобактерий и определены концентрации фосфатов в среде, необходимые для этого процесса (Гончарова и Герасименко, 1993; Тихомирова и Орлеанский, 1994). Эти концентрации намного выше тех, которые обычно встречаются в современных водоемах (0,1-40 мкг/л или 0,003-1,3 мкМ) (Батурин, 1978), хотя и находятся в пределах содержания фосфора в поровых водах морских илов (10-40 мг/л или 0,32-1,3 мМ) (Савенко, 1988). Кроме того, было показано, что при разложении цианобактериального природного мата в среду выделяется такое количество РІ (до 1,7 мМ), которого достаточно для минерализации как самих цианобактерий, так и минерализации окружающих организмов (Гончарова и Герасименко, 1993).
Фосфор в клетках Microcoleus chthonoplastes, при его оптимальной концентрации в среде (0,125 мМ) распределяется по известным из литературы фракциям полиР (Кулаев, 1975). Увеличение начальной концентрации РІ в среде культивирования приводит к изменению морфологии клеток М. chthonoplastes (рис. 5),
Различное распределение полиР в клетках ЬА. chthonoplastes при росте на средах с разной концентрации фосфата, объясняет дальнейшее морфологическое изменение клеток, связанное с их минерализацией. Появление гранул волютина при концентрации РІ 0,58-1,2 мМ согласуется с высоким содержанием кислоторастворимой фракции полиР. Высокое содержание данной фракции, полиР которой локализованы на периферии клетки, вблизи от ее поверхности (Кулаев, 1975), приводит в дальнейшем к минерализации клеточных чехлов (рис. 5а) (Герасименко и др., 1998). Увеличение концентрации до 2,5 мМ Pj оказывается губительной для клетки, что связано с накоплением РІ И это ведет к минерализации самих трихомонов (рис. 56). Микрозондовый качественный анализ минеральных чехлов трихомонов М. chthonoplastes показал наличие Са и Р, а количественный - накопление Pj (1,6 мг/г от абсолютно сухого осадка) (Гончарова и
Герасименко, 1993).В заключение следует сказать, что концентрация Р; в среде культивирования влияет как на рост цианобактерий, так и на их минерализацию (Гончарова и Герасименко, 1993; Тихомирова и Орлеанский, 1994; Герасименко и др., 1998). При этом распределение полиР внутри клеток характеризует ход событий, по которому пойдет минерализация Увеличение кислоторастворимой фракции ведет к образованию биомассы, разложение которой способствует созданию локальных условий, благоприятных для минерализации микроорганизмов. Увеличение кислотонерастворимой фракции предшествует образованию минеральных чехлов, а накопление в клетке Pj ведет к минерализации цианобактерий. Таким образом, в процессе минерализации у некоторых цианобактерий происходит гидролиз полиР и образование минеральных чехлов, содержащих нерастворимые соли ортофосфата. 3.5. Накопление ортофосфата Хотя ортофосфат является компонентом, содержание которого в клетках микроорганизмов строго регулируется (Кулаев, 1975), тем не менее, в некоторых случаях, возможно, его накопление в определенных клеточных компартментах. Так, у дрожжей показано высокое содержание РІ в вакуолях Saccharomyces cerevisiae (около 20 мкмоль Р/г сырого веса) и оно возрастает при культивировании микроорганизма на среде, богатой по фосфату (до 150 мкмоль/г сырого веса). Следует отметить, что при последующем выращивании Saccharomyces cerevisiae на фосфат-дефицитной среде, количество Р; в вакуолях снижается (Личко, 1980). По-видимому, в ацидокальцисомах, кроме РРІ и полиР, также присутствует ортофосфат в виде солей кальция или магния (Seufferheld et al., 2003). В ряде работ состав фосфор-содержащих гранул у цианобактерий (Jensen, 1974; Jensen et al., 1977) и некоторых грибов (Seufferheld et al., 2003) исследовался методами рентгеноструктурного анализа, который позволял определить только элементный состав гранул, содержащих в основном фосфор и катионы металлов. Поэтому, нельзя исключить, что в их составе наряду с полиР и PPj, также присутствует определенное количество ортофосфата в виде солей магния или кальция. Резервирование фосфата в виде органического соединения - фитина (Са - Mg - соль инозитолфосфата) характерно для растений (Кулаев, 1975). Однако микроорганизмы тоже могут иметь фосфорные резервы в виде органических соединений. Наиболее ярким примером являются тейхоевые кислоты. Тейхоевые кислоты (от греческого teichos - стенка) были найдены впервые в 1958 году группой английских исследователей, возглавляемой Бэддели, в клетках лактобацилл, бацилл и стафилококков (Armstrong et al., 1958). К настоящему времени они обнаружены у представителей многих других групп грамположительных бактерий: пневмо- и стрептококков, листерий, некоторых коринеформных бактерий и актиномицетов. Изученные вначале тейхоевые кислоты (ТК), представляющие собой цепи полиольных остатков, объединенных фосфодиэфирными связями, стали считать истинными ТК (Наумова, 1979). Известны также полимеры атипичной структуры, в основную цепь которых входят гликозильные или гликозилфосфатные остатки. Более широкое определение ТК включает все поверхностно-связанные полимеры, имеющие полиолфосфаты в своем составе (Ward, 1981). К настоящему времени известны 4 типа полиолов ТК - глицерин, рибит, маннит и эритрит. Их гидроксильные группы, не участвующие в образовании фосфодиэфирной связи, могут остаться свободными или замещаться в различной степени гликозильными и /или О-ацильными остатками. Длина цепей ТК варьирует от 10 до 40 и более полиольных единиц, что зависит как от микроорганизма, так и от условий экстракции (Wicken, 1985). Структуру полимеров устанавливают химическими способами, изучая полученные под действием различных агентов фрагменты цепей. С 1976 года для этих целей применяется также спектроскопия С (а позже и НЬЯМР (De Boer et al., 1976). В нашей стране этот метод используется для изучения ТК с 1978 года А.С. Шашковым (Наумова и др., 1978). В экспериментах Гранта (Grant, 1979) с Bacillus subtilis 168 было показано
Влияние концентрации P, нарост галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum
Представляло интерес выяснить, как влияет концентрация фосфата в среде на рост указанных культур. Обычным способом оценки роста культуры является величина сухой биомассы. Однако эту оценку не представляется возможным применить к Н. salinarium и Н. distributum, так как их биомасса содержит значительное количество соли и это дает существенные погрешности. Попытка использовать метод, разработанный Плакуновым и Кокоевой (Плакунов и Кокоева, 1994), по определению сухой биомассы у некоторых представителей рода Halobacteria посредством поэтапной промывки сырой биомассы кислотой с понижающейся концентрацией и дальнейшим её высушиванием, при использовании наших условий выращивания не удалась, так как уже на первом этапе промывки происходил лизис клеток.
Поэтому для оценки роста культур Н. salinarium и Н. distributum мы использовали величину сырой биомассы. При этом оказалось, что прирост сырой биомассы Н. salinarium и Н. distributum в значительной степени зависит от начальной концентрации Р; в среде культивирования (рис. 10 А). Время, в течение которого происходит прирост величины сырой биомассы оказывается тем больше, чем больше начальная концентрация Р! в среде.
При начальной концентрации Р; в среде 2,3 мМ увеличение количества биомассы Н. salinarium наблюдалось в течение 5 суток культивирования. К концу культивирования количество биомассы достигало 5 г/л. На среде с 11,5 мМ Pi прирост биомассы был значительным и достигал к 6 суткам роста 11,9 г/л.
При начальной концентрации Pi в среде 2,3 мМ, увеличение количества биомассы Н. distribuium продолжалось до 5-х суток, и достигало к концу культивирования 10,5 г/л. Более высокая начальная концентрация РІ в среде 7,8 мМ приводила к увеличению количества биомассы по сравнению с 2,3 мМ Р; примерно в 2,5 раза и к 5 суткам составляла 25 г/л. Таким образом, количество биомассы к стационарной стадии роста увеличивалось с увеличением начальной концентрации Р; в среде.
Однако если провести оценку роста указанных культур с помощью определения содержания белка в биомассе, то получается иная картина. Было определено содержание белка в бесклеточных экстрактах, полученных, как описано в Методах. Оказалось, что увеличение начальной концентрации Р; в среде не повлияло на содержание белка в биомассе обоих микроорганизмов (рис. 10 Б). Если судить о росте культур по содержанию белка, то стационарная фаза наступает к 3 суткам культивирования, независимо от содержания Pi в среде. Интересно отметить, что на среде с 2,3 мМ Pi именно с началом стационарной фазы связано резкое увеличение поглощения этого компонента (рис. 9 А). На среде с 11,5 мМ Pj увеличение скорости поглощения фосфата при переходе к стационарной стадии роста выражено в меньшей степени (рис. 9 Б)
Кроме того, мы изучили влияние начальной концентрации Р; в среде культивирования на содержание бактериородопсина в клетках Н. salinarium в процессе роста на среде с начальной концентрацией фосфата 2,3 и 11,5 мМ (рис. 10 ВУ Возрастание количества бактериородопсина проходило на обеих средах в течение 3-х суток, т.е. за тот же период, что и увеличение содержания белка. При росте на среде с начальной концентрацией фосфата 11,5 мМ количество бактериородопсина было ниже, чем при культивировании Н. salinarium на среде с 2,3 мМ Р;.
Таким образом, увеличение концентрации Р; в среде от 2,3 до 11,5 мМ не приводит к увеличению содержания белка и бактериородопсина в биомассе. Если построить кривую роста по содержанию белка (или бактериородопсина), то стационарная стадия наступает к 3 суткам культивирования. Следовательно, рост Н. salinarium и Н. distributum замедляется уже к 3 суткам, а дальнейшее увеличение биомассы, по-видимому, обусловлено поглощением Pj и значительным содержанием его в биомассе. Не исключено, что повышенное содержание РІ в среде культивирования является неблагоприятным фактором для жизнедеятельности Н. salinarium и Н. distributum.
В качестве объекта для сравнения была выбрана галотолерантная эубактерия В. antiquum, которую ранее совершенно не изучали в отношении фосфорного метаболизма. Однако эта культура обладала важной особенностью - способностью выживать в условиях повышенной солености, с концентрацией NaCl ЗМ, которая близка к оптимальной концентрации соли в среде культивирования для изучаемых галофильных архей Н. salinarium и Н. distributum.
Было обнаружено, что В. antiquum, также как и Н. salinarium и И- distributum способна поглощать Pj из среды (рис. 11 АУ К стационарной стадии роста В. antiquum в среде без ЗМ NaCl с начальными концентрациями фосфата 2,3 и 11,5 мМ оставалось 0,5 и 1,15 мМ Pj соответственно (рис. 11 А, кривые 1 и 2У
Так как эубактерия В. antiquum является галотолерантным микроорганизмом и может выдерживать различные концентрации NaCl в среде культивирования (Гавриш, 2002), то были проведены эксперименты, по изучению способности к поглощению Pi при 3 М NaCl (максимально возможная концентрация соли в среде культивирования).
На среде с З М NaCl и начальными концентрациями Pj 2,3 и 11,5 мМ к стационарной стадии роста В. antiquum оставалось 1,27 и 2,87 мМ Р; соответственно (рис. 11 А, кривые 3 и 4). Способность к поглощению РІ у данной культуры на среде с повышенной соленостью оказалась заметно ниже, чем на бессолевой среде при низкой начальной концентрации фосфата (2,3 мМ). Однако при начальной концентрации Pi 11,5 мМ способность клеток к его поглощению мало изменилась в присутствии ЗМ NaCl (табл. 2).
Условия повышенной солености (ЗМ NaCl) оказывали существенное влияние на рост В. antiquum (рис. 11 Б). Кривые роста, построенные по величине сырой биомассы для среды в отсутствии и в присутствии ЗМ NaCl, существенно различались. Как скорость роста, так и количество биомассы к стационарной фазе на среде с З М NaCl были ниже, чем когда культура росла в условиях отсутствия данной соли в среде культивирования. Уменьшение скорости роста культуры, по всей видимости, связано с тем, что клетки этой бактерии должны реализовать адаптационные механизмы, ответственные за приспособление к росту в условиях повышенной солености и преодоление солевого стресса. Интересно отметить, что при росте В. antiquum на среде З М NaCl, увеличивается содержание белка в биомассе и соответственно возрастает отношение величины сухой биомассы к сырой биомассе (табл. 1). При этом содержание ДНК в пересчете на величину сырой биомассы примерно одинаково на обеих средах, что указывает на то, что количество клеток остается тем же самым. Не исключено, что увеличение содержания белка может быть связано с адаптацией клеток к условиям повышенной солености.
Влияние М и ЭДТА на поглощение Pi галотолерантной эубактерией Brevibacterium antiquum
Можно видеть, что основная часть накопленного Pj представляет собой оротофосфат. У Н. salinarium на средах с начальной концентрацией Р; 2,3 и 11,5 мМ в виде ортофосфата обнаруживается около 65 % и 90 % соответственно, от количества фосфата поглощенного клетками из среды культивирования. У Н. distributum на средах с начальной концентрацией Р; 2,3 и 7,8 мМ в виде ортофосфата резервируется около 70 % и 90 % соответственно, от количества фосфата поглощенного клетками из среды культивирования (табл. 4). Даже наиболее значительная, кислоторастворимая фракция полиР содержала существенно меньшую долю фосфора, чем ортофосфат. Количество фосфора в виде полиР кислоторастворимой фракции у Н. salinarium и Н. dislributum на среде с 2,3 мМ Р; составляло 20 % и 28 % от Pi обнаруженного нами в клетках (табл. 4). Более того, при увеличении концентрации РІ в среде, доля кислоторатсворимых полиР в общем содержании фосфора уменьшается. ПолиР у Н. salinarium в кислоторастворимой фракции с начальной концентрацией фосфата 11,5 мМ составляют 9 % от Р; обнаруженного в клетках. У Н. distributum полиР в кислоторастворимой фракции при начальной концентрации фосфата в среде 7,8 мМ составляют 10 % от Pj обнаруженного в клетках (табл. 4).
В целом, данные таблиц 3 и 4 указывают на то, что уже концентрация 2,3 мМ Р; является избыточной для изучаемых галофильных архей. При этом большая часть поглощенного РІ не используется для биосинтеза, а накапливается в биомассе в виде ортофосфата.
Переходя к рассмотрению данных, полученных для В. antiquum, следует отметить, что для этой культуры концентрация фосфата 2,3 мМ не является избыточной при росте в отсутствие ЗМ NaCl в среде культивирования. При этих условиях какого-либо существенного резервирования Pj ни в виде орто-, ни в виде полиР не наблюдается (табл. 3 и 4). В виде Pj обнаруживается лишь около 8 %, от общего количества фосфата поглощенного культурой, а в виде полиР 9 %. Следует отметить, что в указанных условиях больше всего полиР содержится во фракции горячего хлорнокислого экстракта, очень мало в щелочерастворимой фракции. В отличие от Н. salinarium и Н. distributum, у В. antiquum в данных условиях количество полиР горячего хлорнокислого экстракта превышает количество полиР кислоторастворимой фракции.
Иная картина наблюдается при росте В. antiquum на среде в отсутствии ЗМ NaCl и с начальной концентрацией Р; 11,5 мМ. В этих условиях в виде ортофосфата резервируется не менее 70 % от всего количества Pi поглощенного культурой, т.е. данная концентрация Pi является избыточной и поглощенный фосфат не используется полностью для биосинтеза. Хотя в данных условиях содержание полиР возрастает, в виде этих биополимеров аккумулируется лишь 13 % от поглощенного Pj.
При росте В. antiquum на среде с 3 М NaCl уже при 2,3 мМ РІ в среде наблюдается увеличение содержания ортофосфата в 15 раз по сравнению с бессолевой средой, несмотря на то, что уровень поглощения его из среды снижается (см. рис. 11 А, кривая 3). Доля ортофосфата возрастает до 35 % от всего поглощенного клетками фосфора. Кроме того, увеличивается содержание полиР кислоторастворимой фракции 4,5 раза. Можно предположить, что для В. antiquum накопленный ортофосфат и кислоторастворимые полиР важны в качестве дополнительных осмопротекторов в указанных условиях.
Как видно из таблиц 3 и 4 концентрация 11,5 мМ Р; является избыточной для В. antiquum как в отсутствии, так и в присутствии ЗМ NaCl. При этой концентрации РІ в виде ортофосфата было обнаружено около 70- 80 % от всего количества Pj поглощенного культурой (табл. 4). Доля полиР оказалась невелика (табл. 4).
Таким образом, у Н. salinahum, Н. distributum и В. antiquum при избытке Pi основная его часть, накопленная в биомассе резервируется в виде ортофосфата, что является весьма неожиданным и необычным, т.к. для всех ранее изученных в плане фосфорного метаболизма микроорганизмов, основная часть поглощенного РІ накапливается в виде полиР (Несмеянова и др., 1973; Вагабов и др., 1998; Мино, 2000).
Оказалось, что РІ из биомассы изучаемых культур можно извлечь в виде нерастворимого осадка. Из биомассы Н. salinahum и Н. distributum такой осадок извлекается путем лизиса клеток дистиллированной водой, а из биомассы В. antiquum после разрушения клеток методом экструзии при высоком давлении, и в обоих случаях, последующего дифференциального центрифугирования, как описано в Методах. С наибольшей эффективностью такой способ может быть применен к биомассам, выращенным на среде с высокой начальной концентрацией Pj.
У Н. salinarium и Н. distribution осадок составлял около 50 % от массы сырой биомассы, а после его высушивания при 100 С в течение 6 часов, его масса составляла около 40 % от массы сухой биомассы. Выделенный осадок был водо-, хлороформ-нерастворимый, но растворялся в 6N НС1 при комнатной температуре.
В предварительных опытах, был определен элементный состав осадка, полученного из К salinarium. Он был следующим (%): Mg - 12,1; Р - 14,3, С - 2,82; N - 0,49, Н- 5,76. В полученном растворе было проведено определение отофосфата и лабильного фосфора. Был обнаружен только ортофосфат, а лабильный фосфор полностью отсутствовал. Количество РІ в осадке составляло от 80 до 95 % от поглощенного из среды, что согласуется с данными, полученными методом экстракции.
Полученные данные указывали на то, что основную часть осадка должна составлять неорганическая соль - фосфат магния. Для более точного определения состава осадка в лаборатории химического анализа, РНЦ «Курчатовский Институт», Середой А.Е. был проведен анализ процентного соотношения элементов в фосфат-содержащих осадках, из биомассы изучаемых архей и эубактерии методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (1СР-АЕ8) (табл. 5). Данным методом было подтверждено, что основными компонентами осадка были магний и фосфат.
Влияние начальной концентрации Р, в среде на активность некоторых фосфогидролаз в процессе роста галофильных архей Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum
В результате проделанной работы было показано, что изучаемые культуры являются уникальными поглотителями фосфата. Halobacterium salinarium, Halorubrum disthbutum и Brevibacterium antiquum были способны к концу периода культивирования накапливать 0,9, 0,5 и 0,65 ммоль Р/г сырой биомассы, соответственно. По эффективности поглощения Pi эти культуры сравнимы с эубактериями, выделенными из установок EBPR, такими как A. johnsonii 210 А (0,8 ммоль Р;/г сырой биомассы) (van Niel et al., 1999), представители рода Rhodocyclus (0,6 ммоль Р;/г сырой биомассы) (Zilles et al., 2002) и Microlunatus phosphovorus (1,0 ммоль Р/г сырой биомассы) (Santos et al., 1999), а также с рекомбинантными штаммами Е. coli, которые путем введения мультикопийных плазмид были специально адаптированы для повышения способности к поглощению фосфата (0,4 ммоль Р{/г сырой биомассы) (Kato et al., 1993).
В данной работе, у высокоэффективных поглотителей Р;, каковыми оказались галофильные археи Н. salinarium и Н. distributum, а также галотолерантная эубактерия В. antiquum, впервые изученные в этом отношении, обнаружено накопление фосфата в виде новой формы - неорганического фосфата магния. Следует отметить, что изучаемые микроорганизмы относятся к разным доменам - архей и эубактерий, что свидетельствует в пользу того, что данный способ резервирования фосфата очень древний и может быть распространен у микроорганизмов стоящих на разных стадия эволюционного развития. Способность образования данного резерва не может быть соотнесена с такими свойствами культур, как галофильность и галотолерантность, так как на примере В. antiquum показано, что как поглощение Pj, так и запасание фосфата магния происходит как в отсутствии, так и в присутствии ЗМ NaCl.
Особенностью изучаемых культур является резервирование РІ в виде водонерастворимых фосфатов, в которых основным катионом является магний.
В отличие от полиР создание такого резерва клеткой требует значительно меньше энергии, чем накопление полиР, так как не сопровождается образованием макроэргических связей и энергия тратится только на поглощение Р;. Не исключено, что такой способ резервирования может быть свойственным для микроорганизмов, обитающих в средах с недостаточным обеспечением энергией. Ранее было показано, что в активированных илах поглощенный Pj может аккумулироваться либо преимущественно в виде ортофосфата, либо в виде полиР в зависимости от состава сточных вод (Imai et al., 1988; Rickard & McClintock, 1992; Roske et al., 1995; Schonborn et al., 2001).
Следует отметить, что в большинстве работ, где изучалось накопление Pi рядом прокариот, в том числе и в виде метахроматических гранул (Seufferheld et al., 2003), применялись такие методы, как рентгеноструктурный анализ, ЯМР и электронная микроскопия, которые не позволяли оценить количественное соотношение в содержании полиР и ортофосфата в указнных гранулах. Кроме того, как уже говорилось в обзоре литературы, у цианобактерий наблюдалось накопление нерастворимых фосфатов в виде минеральных чехлов (Гончарова и Герасименко, 1993; Тихомирова и Орлеанский, 1994; Герасименко и др., 1998). Поэтому, нельзя исключить, что обнаруженный в данной работе способ резервирования является достаточно распространенным.
Хотелось бы отметить тот факт, что у Н. salinarium, Н. distributum накопление Pj в виде его нерастворимой соли хотя и является неблагоприятным фактором для жизнедеятельности отдельных клеток, однако может быть полезным для выживания популяции в целом при дальнейшем существовании на Р,-дефицитной среде.
Несмотря на то, что среди функций полиР у этих микроорганизмов резервная функция не является определяющей, их клетки содержат данные биополимеры в значительном количестве. Сходные количества полиР обнаружены у Corynebacterium xerosis и Staphylococcus albus (Kulaev, 1979), а также у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces marxianus (Schuddemat et al., 1989). У дрожжей содержится от 11 до 240 мкмоль Р/г сырой биомассы полиР в пересчете на лабильный фосфор (Kulaev, 1979; Вагабов и др., 2000). Особенно следует отметить увеличение содержания полиР в клетках В. antiquum при повышенной солености. Возможно, полиР обладают свойством осмопротекторов и увеличивают способность В. antiquum к выживанию при повышенной солености (Shiba et al., 1997; Blum et al., 1997; Romberg, 1995, 1999; Tsutsumi et al., 2000; Шиба и др., 2000).
Вопрос о наличие и свойствах ферментов метаболизма полиР у архей несомненно представляет интерес с точки зрения эволюционной биохимии и требует дальнейших исследований.
Таким образом, изучение особенностей резервирования Pj у таких совершенно неизученных объектов как галофильные археи Halobacterium salinarium и Halorubrum distributum, а также галотолерантная эубактерия Brevibacterium antiquum, позволило с одной стороны обнаружить новую форму резервирования фосфата, а с другой стороны изучить особенности метаболизма полиР в условиях повышенной солености, что открывает новые возможности для понимания функций этих биополимеров.