Пигмент-белковые взаимодействия в фотосинтетическом реакционном центре пурпурных бактерий Васильева Людмила Григорьевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

1.1 Состав и структура бактериальных реакционных центров 12

1.2 Последовательность и скорости переноса электрона 13

1.3 Генетика фотосинтеза и модификации белка РЦ

1.3.1 Фотосинтетический генный кластер и/?и/ перон 15

1.3.2 Системы для направленного мутагенеза РЦ 17

1.3.3 Экспрессионные вектора для пурпурных бактерий 18

1.3.4 Изменение состава и свойств кофакторов РЦ

1.3.4.1 Симметрия комплекса и мутации по ее восстановлению 19

1.3.4.2 Удаление кофакторов 21

1.3.4.3 Замещение кофакторов 22

1.3.4.4 Модификации белкового окружения димераБХл 24

1.3.4.5 Перенос электрона поВ-цепи 28

1.3.4.6 Направленные мутации вблизи хинонов 29

1.3.4.7 Модификации участка взаимодействия РЦ с цитохромом с 30

1.3.4.8 Мутации, затрагивающие молекулы воды 31

1.3.4.9 Изучение эволюционной связи между РЦ и ФС 2 33

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 35

2.1 Микроорганизмы и культивирование 35

2.2 Генетические и молекулярно-биологические подходы 37

2.3 Биохимические и биофизичекие методы 41

2.4 Кристаллизация РЦ и рентгеноструктурный анализ 45

Результаты и обсуждение 46

ГЛАВА 3. Генетические конструкции на основе puf-оиерояа Rhodobacter sphaeroides

3.1 Плазмиды для направленного мутагенеза L- и М-субъединиц реакционного центра 46

3.2 Экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе puf промотора 50

ГЛАВА 4. Получение и характеристика рекомбинантных штаммов Rba. sphaeroides 54

4.1 Получение и фенотипы рекомбинантных штаммов 54

4.2 Тестирование экспрессионного вектора в периодических и непрерывных условиях культивирования Rba. sphaeroides 56

ГЛАВА 5. Влияние белкового окружения димера БХл на его свойства 60

5.1 Влияние аминокислотного замещения Ile-His в симметричных позициях L177 и М206 60

5.2 Изучение прочного связывания БХл с белком в РЦ I(L177)H 64

5.3 Пространственная структура РЦ I(L177)H 73

5.4 Исследование природы ковалентной связи БХл с белком в РЦ I(L177)H 77

5.5 Замена и смещение гистидиновых лигандов бактериохлорофиллов димера 80

5.6 Выяснение причин разных последствий одинаковых симметричных мутаций 88

ГЛАВА 6. Особенности лигандирования мономерных БХл Вд и Вв 97

6.1 Замена БХл Вв на БФео в результате мутации Н(М182)L 97

6.2 Перенос лиганда БХл Вв с а-стороны макроцикла на Р-сторону 98

6.3 Замещение гистидинового лиганда БХл Вд на цистеин, метионин, лейцин или тирозин 103

Приложение 111

Заключение 117

Выводы 120

Список литературы

• Последовательность и скорости переноса электрона
• Генетические и молекулярно-биологические подходы
• Экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе puf промотора
• Тестирование экспрессионного вектора в периодических и непрерывных условиях культивирования Rba. sphaeroides

Введение к работе

Актуальность темы исследования

Фотосинтез является глобальным биологическим процессом превращения солнечной энергии в энергию химических связей и одним из основных факторов, ответственных за поддержание жизни на Земле. Процесс фотосинтеза в клетках растений, водорослей и фототрофных бактерий начинается с поглощения квантов света в светособирающих комплексах с последующей передачей энергии возбуждения на реакционные центры (РЦ). В результате серии сверх-быстрых реакций переноса электрона в РЦ происходит первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов с квантовой эффективностью, близкой к 100%. Такая высокая эффективность улавливания и передачи световой энергии без разрушения молекул, включенных в этот процесс, и без нежелательных побочных реакций достигается путем тонкой регулировки свойств кофакторов через их взаимодействия друг с другом и с окружающим белком. В связи с этим исследование пигмент-белковых взаимодействий в бактериальных РЦ фотосинтеза является актуальной задачей, направленной на выяснение детальных механизмов первичного преобразования световой энергии.

РЦ пурпурных бактерий относительно просто организованы и стабильны, известна пространственная структура этих комплексов с высоким разрешением. Бактериальные РЦ многие годы служат моделью для исследования направления и скоростей первичного фотопереноса электрона, а также изучения механизмов его отдельных стадий. В настоящее время особое внимание уделяется конформационным изменениям белка РЦ в процессе фотохимического разделения заряда, в значительной степени определяющим эффективность этого процесса. Перспективным подходом для изучения взаимодействий кофакторов РЦ с их белковым окружением является использование сайт-направленного мутагенеза в сочетании с современными биохимическими, спектральными и кристаллографическими методами. Определение структуры модифицированных РЦ необходимо для корректной оценки изменений белкового окружения кофакторов, происходящих в результате аминокислотных замещений и оказывающих влияние на свойства и функциональную активность РЦ. Данная работа посвящена созданию системы для направленного мутагенеза РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides и изучению влияния отдельных аминокислотных остатков и участков полипептидов РЦ, находящихся в непосредственной близости от молекул бактериохлорофиллов, на оптические, фотохимические и другие свойства РЦ, их пигментный состав и пигмент-белковые взаимодействия, а также получению кристаллов и расшифровке пространственной структуры природных и мутантных РЦ методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением. Кроме того, в данной работе представлен вектор для гетерологической экспрессии генов, имеющий потенциал для использования в биотехнологии. Цели и задачи исследования

Целью работы было создание генетической системы для мутагенеза и экспрессии реакционного центра Rba. sphaeroides in vivo и исследование влияния ближайшего белкового окружения бактериохлорофиллов на пигмент-белковые взаимодействия, на свойства и фотохимическую активность этого комплекса.

В связи с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Провести анализ последовательности ДНК puf-опероиа из пурпурной бактерии Rba. sphaeroides штамм RV в сравнении с/?и/-оперонами других известных штаммов.

2. Создать серию плазмидных векторов для внесения направленных мутаций в L и М белковые субъединицы реакционного центра Rba. sphaeroides и дальнейшей экспрессии мутантных комплексов in vivo.

3. Сконструировать экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе puf-промотора и протестировать его в периодических и непрерывных условиях культивирования Rba. sphaeroides.

4. Путем комбинации разных родительских штаммов Rba. sphaeroides и плазмид для комплементации получить рекомбинантные штаммы с фенотипами РЦ⁺ССК1⁺ССК2⁺, РЦ⁺ССК1⁺ССК2" и РЦ+ССКГССК2".

5. Исследовать особенности координирования центрального атома магния мономерных бактериохлорофиллов со стороны белка с помощью аминокислотных замещений H(L153)L, H(L153)Y, H(L153)C, H(L153)M, H(M182)L, H(M182)L+ H(L153)Y, H(M182)L+I(L177)H.

6. Исследовать влияние белкового окружения димера БХл Р на свойства первичного донора электрона, пигмент - белковые взаимодействия и стабильность комплекса, используя широкий спектр подходов, включая кристаллизацию РЦ.

7. Исследовать возможность смещения гистидиновых лигандов каждого из бактериохлорофиллов димера на один виток а-спирали белка и влияние этого переноса на свойства первичного донора электрона.

Научная новизна работы

Впервые получены и охарактеризованы РЦ Rba. sphaeroides с одиночными, и двойными аминокислотными замещениями в L- и М-субъединицах: I(M206)H, I(L177)H, H(L173)L+I(L177)H, H(L173)L+I(L177)T, I(M206)H+H(M202)L, H(M182)L+I(L177)H, H(L153)M, H(L153)Y, а также с заменами фрагментов М-субъединицы вблизи димера БХл на симметричные им фрагменты из L-субъединицы. Получена новая информация о влиянии ряда консервативных аминокислотных остатков из белкового окружения бактериохлорофиллов на оптические свойства этих кофакторов, на пигментный состав, стабильность и фотохимическую активность РЦ. Получены мутантные РЦ с пигмент-белковыми взаимодействиями, нетипичными для бактериальных фотосинтетических комплексов.

Впервые показана возможность смещения гистидиновых лигандов бактериохлорофиллов специальной пары с позиций L173 (лиганд Рд) и М202 (лиганд Рв) на позиции L177 и М206, соответственно. Показано, что в спектре поглощения РЦ H(L173)L+I(L177)H наблюдается беспрецедентный 46 нм коротковолновый сдвиг Qy полосы поглощения первичного донора электрона, свидетельствующий о значительном изменении экситонного взаимодействия внутри димера БХл.

Проведено исследование свойств РЦ с аминокислотными замещениями изолейцинов на гистидины в симметричных позициях L177 и М206. Впервые установлено, что аминокислотное замещение I(L177)H влияет на координирование центрального атома магния двух ближайших бактериохлорофиллов: БХл В в становится 6-координированным, а координирование БХл Рд со стороны белка значительно

усиливается. Проведен анализ причин различного влияния этих замещений на свойства ближайших БХл и пигмент-белковые взаимодействия.

Получены экспериментальные доказательства того, что мутация I(L177)H приводит к прочному ковалентному связыванию БХл Рд с L -субъединицей. Исследована природа и проанализированы возможные причины нового вида взаимодействия БХл с белком. Впервые получена пространственная структура мутантного РЦ I(L177)H с разрешением 2.5 А. На основе рентгеноструктурных данных построена молекулярная модель, показывающая, что в мутантном РЦ возникает новая цепочка из координационной, водородной и ковалентной связей, соединяющих бактериохлорофиллы Вв и Рд. Обнаружено, что электронные плотности С -метильной группы первого кольца БХл Рд и азота имидазольной группы объединены, что указывает на вовлеченность этих групп в образование ковалентной связи. Предложена химическая реакция, которая могла привести к ковалентной связи между белком и БХл.

Впервые установлено, что в РЦ с двойным замещением H(M182)L+I(L177)H координирование атома магния БХл Вв осуществляется с Р-стороны макроцикла. Модель Р-координирования, построенная на основе кристаллической структуры РЦ I(L177)H предполагает участие в качестве лиганда молекулы воды, обнаруженной в структуре и связанной водородной связью с остатком гистидина L177.

Впервые показано, что в мутантном РЦ H(L153)Y отсутствует мономерный бактериохлорофилл активной цепи переноса электрона. В этом РЦ наблюдается значительное замедление скорости переноса электрона и снижение квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами Р Qa" до 7%.

Сконструирован новый экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе сильного и хорошо регулируемого /^-промотора из Rba. sphaeroides RV и показано, что использование непрерывного культивирования рекомбинантного штамма может многократно повысить выход экспрессируемого белка. Научная и практическая значимость

Сконструирована генетическая система для направленного мутагенеза, позволяющая вносить направленные контролируемые аминокислотные замещения в L- и М-субъединицы реакционного центра Rba. sphaeroides, а также в а- и Р-субъединицы корового светособирающего комплекса, ССК1. В рамках данной системы можно получать рекомбинантные штаммы Rba. sphaeroides с разными сочетаниями фотосинтетических комплексов РЦ, ССК1 и ССК2. Штамм с фенотипом РЦ ССКГССК2" позволяет исследовать свойства нестабильных мутантных РЦ без их выделения из мембран. В работе получено более 15 мутантных РЦ с аминокислотными замещениями вблизи бактериохлорофиллов. Получены новые данные о влиянии ряда консервативных аминокислотных остатков из белкового окружения бактериохлорофиллов на оптические и окислительно-восстановительные свойства этих кофакторов, а также на пигментный состав и фотохимическую активность РЦ. Получен мутантный РЦ H(L173)L+I(L177)H, в оптическом спектре которого наблюдается коротковолновый сдвиг Qy полосы поглощения первичного донора электрона на 46 нм, свидетельствующий об изменениях экситонных взаимодействий внутри димера БХл. Мутантные РЦ с замещениями в позициях H(M202)L, H(L173)L, H(L173)L+I(L177)H были использованы для получения приоритетной информации о ранних стадиях процессов преобразования световой энергии

в энергию состояний с разделенными зарядами. Впервые показано, что в мутантном РЦ H(L153)Y отсутствует первичный акцептор электрона, мономерный бактериохлорофилл активной цепи. В этом РЦ наблюдается значительное замедление скорости переноса электрона и снижение на порядок квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами PQa В РЦ с двойным замещением H(L153)Y+H(M182)L наряду с потерей БХл Вд происходит замена БХл Вв на БФео Фв, что приводит к переносу электрона с Р* в неактивную В-цепь на Фв и полному блокированию переноса электрона в А-цепь. Установлено, что одиночное замещение I(L177)H приводит к ковалентному связыванию БХл Рд с L -субъединицей. С помощью ряда биохимических подходов и анализа кристаллической структуры РЦ I(L177)H исследована природа и возможные причины возникновения нового взаимодействия, установлены боковые группы, участвовавшие в реакции. Предложен механизм химической реакции, в результате которой образовалась ковалентная связь БХл с белком. Исследованы участки РЦ, критичные для стабильного функционирования комплекса, что представляет интерес для практических задач использования РЦ. Сконструирован и протестирован новый вектор для гетерологической экспрессии генов в пурпурных бактериях. Полученные экспериментальные данные имеют приоритетный характер, находятся в русле мировых исследований и вносят существенный вклад в решение фундаментальных задач, связанных с исследованием механизмов преобразования световой энергии при фотосинтезе. Созданная в работе генетическая система для направленного мутагенеза пигмент-белковых комплексов пурпурных бактерий может найти применение при моделировании живых систем и создании преобразователей солнечной энергии. Вектор для гетерологической экспрессии имеет потенциал для использования в биотехнологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основе /л/^-оперона Rba. sphaeroides штамм RV получена серия плазмидных векторов для внесения направленных мутаций в L и М белковые субъединицы реакционного центра и в а- и Р-субъединицы светособирающего комплекса ССК1. Получены рекомбинантные штаммы Rba. sphaeroides, экспрессирующие фотосинтетические комплексы в следующих сочетаниях: РЦ ССК1 ССК2 , РЦ ССК1⁺ ССК2", РЦ⁺ ССКГ ССК2".

2. Сконструирован и протестирован экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе /л/^-промотора. Максимальный 700-кратный уровень индукции puf-промотора в новом экспрессионном векторе для Rba. sphaeroides может быть достигнут при переходе из аэробных хемогетеротофных условий выращивания клеток к анаэробным фототрофным условиям. Время гетерологической экспрессии гена люциферазы под контролем /л/^-промотора многократно повышается при переходе от периодического к непрерывному культивированию рекомбинантного штамма.

3. Внесено более 15 направленных аминокислотных замещений в L- и М-субъединицы реакционного центра вблизи молекул БХл. С помощью направленных мутаций показано, что закономерности координирования центрального атома Mg в бактериальном реакционном центре не являются строгими. Ряд мутантных РЦ обладают уникальными свойствами и представляют

интерес для исследования пигмент-белковых взаимодействий, а также механизмов первичных процессов фотосинтеза.

4. Гистидиновые лиганды бактериохлорофиллов специальной пары могут быть перемещены с позиций L173 (лиганд Рд) и М202 (лиганд Рв) на позиции L177 и М206, соответственно. Такое перемещение лигандов в РЦ H(M202)L+I(M206)H и H(L173)L+I(L177)H приводит к значительным коротковолновым сдвигам Qy полосы поглощения первичного донора электрона, что свидетельствует об изменении экситонного взаимодействия внутри димера БХл.

5. Путем модификации белкового окружения мономерного БХл Вв возможно провести замещение этого БХл на БФео в РЦ H(M182)L, получить альтернативное лигандирование БХл Вв с Р-стороны макроцикла в РЦ I(L177)H+H(M182)L или его 6-координирование в РЦ I(L177)H. В случае с мономерным БХл активной цепи Вд возможна лишь замена лиганда с гистидина на цистеин или метионин. При замещении гистидина L153 на лейцин происходит значительная дестабилизация РЦ, а в случае замещения его на тирозин в РЦ H(L153)Y не происходит встраивания БХл Вд в комплекс РЦ.

6. Одиночное аминокислотное замещение I(L177)H приводит к 6-координированию БХл Вв и ковалентной связи между БХл Рд и L-субъединицей РЦ. Согласно кристаллической структуре РЦ I(L177)H, полученной с разрешением 2.5 А, в мутантном РЦ образуется цепочка новых связей, соединяющих атом магния БХл Вв, молекулу воды с Р-стороны БХл Вв и имидазольное кольцо гистидина L177. Благодаря этой цепочке связей обеспечивается шестое координирование атома магния Вв. В структуре РЦ I(L177)H электронные плотности имидазольного кольца гистидина L177 и метильной группы первого кольца БХл Рд объединены, что согласуется с образованием ковалентной связи между ними. По аналогии с гистидил-флавинами, предложена реакция ковалентного взаимодействия этих групп с участием молекулы кислорода и образованием гистидил-БХл.

Апробация результатов.

Материалы диссертации были представлены на Ежегодной конференции японского биотехнологического общества (Япония, 1998), 10-м Международном симпозиуме по фотосинтезирующим прокариотам (Испания, 2000), Международной научной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» (Пущино, 2001), XVII Пущинских чтениях по фотосинтезу (Пущино, 2002), Международной конференции "Фотосинтез и урожай" (Киев, 2002), 11-м Международном симпозиуме по фотосинтезирующим прокариотам (Япония, 2003), 6-й Международной конференции по морской биотехнологии (Япония, 2003), Международной конференции по первичным процессам фотосинтеза (Пущино, 2004), 29-м Конгрессе ФЭБС (Польша, 2004), 13-м Международном конгрессе по фотосинтезу (Канада, 2004), 3-м съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу "Преобразование энергии света при фотосинтезе" (2005), Международном биофизическом конгрессе (Франция, 2005), XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе (Пущино, 2005), Международной конференции «Фотосинтез в постгеномную эру» (Пущино, 2006), Международном

конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Япония, 2006), Международном симпозиуме по фотосинтетическим прокариотам (Франция, 2006), Международной конференции по тетрапиррольным фоторецепторам фотосинтетических организмов (Япония, 2007), Европейской биоэнергетической конференции (Ирландия, 2008), Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), Гордоновских чтениях по фотосинтезу (США, 2008), Конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), XIII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Италия, 2009), 15-м Международном конгрессе по фотосинтезу (Китай, 2010), Международной конференции "Исследование фотосинтеза для устойчивого развития" (Азербайджан, 2011 и Пущино, 2014), VI и VII съездах Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011 и 2014), Международной конференции по тетрапиррольным фоторецепторам фотосинтетических организмов (Китай, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ (17 статей в реферируемых журналах, 2 обзора, 5 глав в книгах и сборниках и 15 тезисов докладов). Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы работы изложены на 146 страницах машинописного текста, включая 58 рисунков и 10 таблиц. Список литературы содержит 236 библиографических ссылок.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследований, разработке подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций совместно с соавторами. Результаты, обсуждаемые в работе, были получены либо лично автором, либо руководимыми им аспирантами.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту Шувалову В. А. и коллегам, участвовавшим в проведении исследований и/или обсуждении результатов: Фуфиной Т.Ю., Леоновой М.М., Хмельницкой Т.И., Хатыпову Р.А., Хмельницкому А.Ю., Шкуропатову А.Я., Забелину А.А., Каминской О.П., Шкуропатовой В.А., Христину A.M., Цыганкову А.А., Проскурякову И.И., Яковлеву А.Г., Габдулхакову А.Г. (ИБ РАН), Хреновой М.Г. (Химфак МГУ), а также Волщуковой Т.С, помогавшей в проведении исследований. Работа финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований, грантами Президента РФ, Программой Президиума РАН МКБ, государственными контрактами с Минобрнауки.

Последовательность и скорости переноса электрона

Гетерологическая экспрессия белков в Е. coli находит широкое применив в биотехнологии. Однако этот подход имеет серьезные ограничения, связанные с низкой эффективностью экспрессии, деградацией, токсичностью и нерастворимостью некоторых белков после их экспрессии в этой бактерии. Нередко сложные белки, состоящие из нескольких субъединиц и содержащие кофакторы, нуждаются в пост-трансляционных модификациях, таких как процессинг сигнальных последовательностей, фолдинг белка, включение простетических групп и др. [Makrides, 1996]. Благодаря способности использовать энергию света и гибкости метаболизма пурпурные несерные бактерии обладают значительным потенциалом для биотехнологии. Эти бактерии - факультативные фотогетеротрофы, способные жить в самых разных условиях окружающей среды. Они могут востанавливать азотные соединения, фиксировать СОг, расти на органических субстратах в аэробных условиях или фототрофно в анаэробных условиях, могут также расти анаэробно в темноте в присутствии экзогенных акцепторов электрона [Imhoff, 1995]. На свету при пониженном давлении кислорода поверхность внутриклеточных мембран многократно возрастает, также как и количество встраиваемых в них светособирающих комплексов и РЦ [Niederman et al., 1976]. Это обстоятельство делает бактерии рода Rhodobacter привлекательными хозяевами для гетерологической экпрессии белков, и прежде всего для трудно экспрессируемых мембранных комплексов [Laible et al., 2009]. Сочетание одновременной индукции синтеза мембран и экспрессии чужеродного белка позволяет избежать деградации последнего или образования нерастворимых агрегатов за счет своевременного встраивания белка в мембраны [Columbus et al., 2006]. Для такой экспрессии необходимо поместить экспрессируемый ген под контроль сильного и хорошо регулируемого промотора, отвечающего за синтез компонентов фотосинтетического аппарата. Поскольку большинство промоторов из неродственных бактерий, таких как Escherichia coli и представители рода Pseudomonas не узнаются видами Rhodobacter, рядом лабораторий был предпринят поиск сильных и хорошо регулируемых промоторов для гетерологической экспрессии в этих бактериях [Williams and Taguchi, 1995]. Несмотря на это, известно немного экспрессионных векторов, подходящих для пурпурных бактерий. Значительный вклад в генную инженерию пурпурных бактерий внесли работы сотрудников кафедры генетики МГУ [Зинченко, 1988]. В частности, было проведено исследование гетерологической экспрессии NIF и NTR генов Klebsiella pneumoniae в клетках Rba. sphaeroides [Зинченко и др., 1988]. Показано также, что экспрессия метиламин-дегидрогеназы Paracoccus denitrificans, не имевшая успеха в Е. coli, была осуществлена в Rba. sphaeroides [Graichen et al., 1999]. Был создан вектор для экспрессии в пурпурных бактериях флавоцитохром с-сульфиддегидрогеназы на основе rbcK промотора (ген РуБисКо) из Allochromatium vinosum. Показано, что наибольший уровень экспрессии наблюдается во время фототрофного роста на малате или ацетате в присутствии сульфида [De Smet et al., 2001]. В работе Фодор и соавторов [Fodor et al., 2004] были сконструированы экспрессионные вектора для широкого спектра хозяев с возможностью вставок различных промоторов и вариаций ряда свойств белка. В частности, были использованы тандем с тагами FLAG и Strep, а также различные промоторные области из Thiocapsa roseopersicina, Rba. capsulatus и Methylococcus capsulatus. Сообщалось об успешной экспрессии и очистке белкового комплекса HynL-HypC2, участвующего в созревании гидрогеназы Т. roseopersicina.

Фотосинтетические промоторы относят к сильным бактериальным промоторам, которые регулируются кислородом и, в меньшей степени, интенсивностью света. Множество фрагментов фотосинтетических оперонов в составе плазмидных векторов было использовано в работах, касающихся генетики фотосинтеза. Однако большинство из них было создано для изучения структуры, функции и регуляции генов, а не их экспрессии [Bylina et al., 1986]. Известны экспрессионные системы на основе puf-промотора из Rba.capsulatus, однако степень их регулируемости ограничена в связи с неполной репрессией этого промотора в присутствии кислорода [Johnson et al., 1986; Bauer et al., 1988]. Активность /л/ промотора из Rba. sphaeroides больше зависит от парциального давления кислорода, что делает этот промотор более подходящим для конструирования экспрессионного вектора [Laible et al., 2009]. Литературные данные, касающиеся времени экспрессии чужеродных генов в перпурных бактериях, достаточно ограничены. Известно, например, что экспрессия Р-галактозидазы под контролем fru-промотора в фотогетеротрофной культуре Rba.capsulatus наблюдалась в течение нескольких часов после индукции [Duport et al., 1994].

Одной из важных особенностей РЦ является сочетание относительной структурной симметрии и строгой функциональной асимметрии. Эти два свойства, очевидно, взаимосвязаны, так как степень гомологии аминокислотных последовательностей L- и М-субъединиц, связывающих кофакторы, невысока и составляет около 30% [Williams et al., 1984]. Считается, что именно различие белкового окружения кофакторов в двух ветвях переноса электрона лежит в основе функциональной активности А-ветви и неактивности В-ветви. В недавней работе с использованием атомной силовой микроскопии и ориентированных на поверхности золота мембран-связанных РЦ, было показано, что при подключении внешнего электрического тока электроны по В-цепи не идут даже если А-цепь заблокирована в результате удаления хинона QA [Kamran et al., 2015]. Известен ряд работ, направленных на искусственную «симметризацию» РЦ, повышение гомологии отдельных участков L- и М-субъединиц. В рамках данной темы наиболее изучен РЦ так называемого DLL мутанта Rba. capsulatus, в котором 27 аминокислотных остатков М-субъединицы (Ml92-217) замещены на симметричный им в структуре РЦ участок L-субъединицы, L165-190 [Robles et al. 1990]. Каждый из этих параллельных участков М- и L-полипептидов содержит часть а-спирали D и петлю, выходящую на периплазматическую поверхность комплекса. Полученные РЦ характеризуются повышенным уровнем окислительного потенциала Р/Р и не содержат БФео Нд. В результате потери Нд, в DLL РЦ блокируется перенос электрона по А-ветви и значительно увеличивается время жизни возбужденного состояния первичного донора электрона Р , что позволяет исследовать свойства этого состояния [Vos et al., 1991; 1993]. При инкубировании на свету DLL мутант восстанавливал свою способность к фототрофному росту после появления спонтанных мутаций, возвращающих БФео Нд в его сайт связывания. Примечательно, что мутантные РЦ с аналогичными генетическими конструкциями DMM И DLM оказались нестабильными даже в составе мембран, что свидетельствует о важности белкового окружения хромофоров для сборки комплекса РЦ [Robles et al., 1990]. Показано, что перенос электрона по активной цепи в DLL мутанте может быть частично возобновлён, если вернуть тирозин в позицию М208 (как в РЦ Rba. capsulatus дикого типа) [Carter et al., 2009]. Эти данные свидетельствуют о важной роли тирозина М208 (М210 у Rba. sphaeroides) в образовании и стабилизации состояния РВд" [Yakovlevetal., 2003].

Генетические и молекулярно-биологические подходы

Выделение реакционных центров из мембран проводили методом ионообменной хроматографии. Прцедура подробно описана в [Фуфина, 2011; Леонова, 2013]. Клетки массой 20-25 г разбавляли 100 мл буфера и разрушали при помощи ультразвука при 4С. Неразрушенные клетки удаляли путем центрифугирования (14000 об/мин, 1 час, 4С). Хроматофоры осаждали центрифугированием (45000 об/мин, 40 мин., 4С) и ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0) буфере. Обработку хроматофоров лаурилдиметиламиноксидом (ЛДАО) проводили в присутствии 120 мМ NaCl. Время обработки и концентрацию ЛДАО варьировали в зависимости от стабильности выделяемых РЦ. Затем суспензию разбавляли в 2-2,5 раза 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0) буфером, содержавшим 120 мМ NaCl и 0,1% ЛДАО, и центрифугировали (45000 об/мин, 1 час, 4С). Супернатант, содержащий РЦ, разбавляли TL буфером (20 мМ Трис-HCl рН 8,0, 0,1% ЛДАО) и наносили на колонку, с ДЭАЭ целлюлозой DE-52, уравновешенной 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 120 мМ NaCl и 0,1% ЛДАО. Колонку промывали TL буфером с постепенным увеличением концентрации соли (от 60 до 135 мМ NaCl в TL). Элюцию РЦ с колонки проводили при концентрации соли 180-200 мМ NaCl. Затем РЦ чистили на колонке с ЕМД-целлюлозой, уравновешенной 60 мМ NaCl в TL буфере и элюировали 165 мМ NaCl в TL буфере. Последующую очистку и концентрирование РЦ проводили на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Выход РЦ после очистки оценивали по длинноволновой полосе поглощения мономерных БХл вблизи 800 нм в 1 см кювете (ODVgoo) в расчете на 1 литр 3-х дневной культуры. РЦ хранили при температуре - 20С.

Для выделения реакционных центров методом афинной хроматографии клетки с одного литра культуры собирали центрифугированием, разводили в 50 мл буфера 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0) с 0,2 мМ PMSF и разрушали при помощи ультразвука при 4 С. Неразрушенные клетки удаляли путем центрифугирования (14000 об/мин, 1 час, 4 С). К надосадочной жидкости добавляли ЛДАО в 3 этапа с промежутками 20 мин до концентрации 0,7%, имидазол (5 мМ) и Ni-NTA-агарозу в буфере 10 мМ Трис рН 8,0, 0,1% ЛДАО. Инкубировали смесь в темноте при 4 С, медленно перемешивая. Затем смесь переносили на колонку, промывали тем же буфером, пока не переставали сходить пигменты и белок. Элюцию РЦ проводили буфером 10 мМ Трис рН 8,0, 0,1% ЛДАО, 40 мМ имидазола. В ряде экспериментов вместо имидазола в буфер для элюции включали 50 мМ ЭДТА. После элюции проводили диализ РЦ против буфера 10 мМ Трис рН 8,0 + 0,1% ЛДАО при 16 С для удаления имидазола. Соотношение оптической плотности OD28o/OD8o5 в пределах 1,3- 1,7 служило критерием чистоты препаратов РЦ [Okamura et al., 1974]. При выделении нестабильных РЦ их количество после очистки из мембран оценивали по длинноволновой полосе поглощения мономерных БХл вблизи 800 нм в 1 см кювете (ODVgoo) в расчете на 1 литр 3-х дневной культуры.

Определение пигментного состава РЦ проводили по методике, описанной в работах [Straley et al., 1973; Van der Rest and Gingras, 1974], модифицированной Татьяной Фуфиной [Фуфина, 2011]. 1 мл РЦ осаждали 26% сульфата аммония. К осажденным РЦ добавляли смесь ацетон-метанол (7:2), перемешивали и центрифугировали при 13400 об/мин, 5 минут. Спектр поглощения экстракта пигментов измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-1601PC при комнатной температуре. Концентрацию пигментов в экстракте определяли по формуле:

Анализ пигментного состава хроматофоров проводили после их высушивания под вакуумом при температуре жидкого азота. Высушенные образцы хранили при -20 С. К 0,01 г порошка хроматофоров добавляли 1 мл смеси ацетон-метанол (7:2), перемешивали, центрифугировали при 13400 об/мин, записывали спектры поглощения экстракта пигментов. Затем к образцу добавляли 1/1000 объема ЮМ НС1 для феофитинизации молекул БХл, перемешивали, инкубировали 2 минуты и вновь записывали спектры поглощения экстракта. Коэффициенты экстинкции БХл и БФео были взяты из работы [Van der Rest and Gingras, 1974].

Денатурирующий электрофорез белков проводили в 18% полиакриламидном геле в присутствии 6 М раствора мочевины и 0,1% ДСН. Для Вестерн-боттинга использовался ПААГ с линейным градиентом 10-20%. Для калибровки использовали стандартные наборы низко- или высокомолекулярных белков фирмы «BioRad» (США).

Для Вестерн-блоттинга отбирали клетки в разных условиях культивирования, разрушали ультразвуком, и затем образцы бесклеточных экстрактов (6 мкг по белку) анализировали с помощью ДСН ПААГ. Затем белки переносили из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану Clear-blot (АТТО Co., Япония). Мембрану блокировали буфером 20 мМ Трис-НС1, 140 мМ NaCl, содержащим 5% сухого молока, в течение 60 мин при 37 С и затем промывали и инкубировали с первичными антителами к люциферазе кролика (США). Связывающую способность антител определяли с помощью набора Peroxidase Substrate Kit ТМВ (США), используя пероксидазный коньюгат с антителами к иммуноглобулину G кролика в качестве вторичного антитела.

Обработку РЦ борогидридом натрия проводили согласно ранее описанной методике (Scheer, 1993). К образцу РЦ объемом 5 мл в 20 мМ Трис-HCl буфере рН 8,0 / 0,1%) Тритон Х-100 добавляли NaBH4 до тех пор, пока рН раствора не достигал 10. Инкубировали 16 часов при 20С, затем проводили диализ в течение суток при 4С против того же буфера. После диализа РЦ очищали на колонке с ДЭАЭ целлюлозой DE-52. Обработку РЦ протеиназой К осуществляли в течение 18-24 часов в 50 мМ Трис-НС1 буфере, рН 8,0, в присутствии 1 мМ СаСЬ и в соотношении фермент:субстрат 1:50.

Равновесный потенциал пары Р/Р измеряли с помощью платинового электрода путем титрования РЦ феррицианидом натрия или аскорбатом натрия как описано ранее [Murchison et al., 1993]. В качестве электрода сравнения служил хлор-серебряный электрод. Спектры поглощения РЦ измеряли после каждого добавления титранта. Результаты обрабатывали при помощи программы Origin с использованием уравнения Нернста (у=100/(ехр(38.92 (х-Ео))+1)). Значения Е0 и температурные поправки брали из статьи [O Reilly, 1973].

Спектры поглощения при комнатной температуре и 90 К измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-1601PC. В качестве контрольной использовали кювету с буферным раствором, не содержащим образца. Для измерения низкотемпературных спектров поглощения использовали криостат с жидким азотом. В кювету криостата помещали раствор Трис-HCl рН 8,0 /ЛДАО 0,1% буфера и глицерина (96%) в соотношении 1:2. Спектр поглощения этого раствора записывали как базовую линию. Затем в ту же кювету помещали смесь РЦ в TL буфере и глицерина в соотношении 2:3. Укрепляли криостат в держателе. Жидкий азот заливали в колбу криостата и через 20 мин. записывали спектр. Спектры поглощения при 10 К измеряли на спектрофотометре QE 65000 (Ocean Optics), криостат заполняли жидким гелием.

Кинетику и спектры фотоиндуцированных изменений поглощения АА в миллисекундном диапазоне измеряли на однолучевом дифференциальном спектрофотометре с фосфороскопом с использованием подсветки образца лампой накаливания и скрещенных светофильтров СЗС-22 и КС-15. В измерительном канале прибора использовали слабый монохроматический свет. Изменения поглощения индуцировали мощной подсветкой на длине волны Х=874 нм.

Измерение люциферазной активности проводили в бесклеточном экстракте при помощи набора реактивов фирмы Promega (Luciferase Assay System), содержащем люциферин, АТФ и фосфатный буфер. Бесклеточный экстракт Rba. sphaeroides получали после разрушения клеток ультразвуком. Неразрушенные клетки и частицы клеток удаляли центрифугированием (16500 g, 15 мин). В люминесцентных реакциях свет образуется при окислении люцеферина. Общий вид происходящей реакции: люциферин + Ог - оксилюцеферин + свет. Реакция, катализируемая люциферазой, проходит в две стадии: 1) люциферин + АТФ - люцифериладенилат + РРІ; 2) люцифериладенилат + Ог - оксилюцеферин + АМФ + свет. Эмиссию фотонов в образце измеряли автоматически с помощью люминометра в течение 3 мин. 2.4 Кристаллизация РЦ и рентгеноструктурный анализ

Экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе puf промотора

В дифференциальном спектре АА РЦ I(L177)H максимум выцветающей полосы поглощения Р был сдвинут на 20 нм в коротковолновую область от 870 нм до 850 нм. Уменьшение поглощения при 815 нм и увеличение поглощения при 790 нм отражают коротковолновый сдвиг полосы поглощения мономерного БХл в поле зарядов Р QA". В возникшем поле зарядов Р QA наблюдается сдвиг максимума полосы поглощения БФео в длинноволновую область. Амплитуда выцветающей полосы поглощения первичного донора в дифференциальном спектре этих генетически модифицированных комплексов была примерно в 2 раза меньше, чем в РЦ дикого типа (Рис. 5.1.4). Согласно оценке методом спектроскопии высокого временного разрешения, проведенной группой фемтосекундной спектроскопии лаборатории ППФ ИФПБ, квантовый выход разделения зарядов Р QA В РЦ I(L177)H был близок к единице, как и в РЦ дикого типа. Таким образом, в отличие от мутации 1(М206)Н, затрагивающей окружение БХл активной цепи переноса электрона Рв и Вд, аминокислотное замещение I(L177)H вблизи кофакторов неактивной цепи не оказало существенного влияния на функционирование РЦ.

Согласно данным пигментного анализа молярное соотношение Бхл:БФео в ацетон-метанольном (7:2) экстракте из РЦ дикого типа и РЦ 1(М206)Н составило 1,99±0,01. Таким образом, в этих РЦ на четыре молекулы БХл приходится две молекулы БФео. В пигментном экстракте из РЦ I(L177)H молярное соотношение Бхл:БФео составило 1,55±0,05. Это означает, что на три молекулы БХл приходится две молекулы БФео. Таким образом, было показано, что в ацетон-метанольном экстракте пигментов из РЦ I(L177)H отсутствует одна молекула БХл а.

Результаты пигментого анализа РЦ I(L177)H указывают на то, что в результате мутации один БХл мог быть утерян из структуры комплекса. В то же время, в спектрах поглощения РЦ I(L177)H, измеренных при 10К, в Qy области прослеживаются полосы поглощения, характерные для всех четырех бактериохлорофиллов РЦ (Рис. 5.2.1). Полосы поглощения мономерных БХл активной и неактивной ветвей располагаются при 803 и 817 нм. Qy полоса поглощения димера БХл Р сдвинута в коротковолновую область и располагается при 880 нм.

Спектры поглощения РЦ дикого типа (пунктирная линия) и I(L177)H (сплошная линия), измеренные при 10 К. На вставке область 550-700 нм и полоса Qx Бхл. Пигментный анализ образца РЦ с высокой концентрацией (более 1 ODV по поглощению при 807 нм) выявил, что после экстрагирования пигментов смесью ацетон-метанол (7:2) денатурированный осадок РЦ дикого типа не содержит пигментов, в то время как денатурированный осадок РЦ I(L177)H имеет сине-зеленую окраску, характерную для БХл. При обработке осадка ЇМ НС1, он приобретает бурую окраску, характерную для БФео (Рис. 5.2.2), но прочное связывание пигмента с осадком сохраняется. Использование других, в том числе более сильных органических растворителей, таких как ацетон, диметилсульфоксид, диметилформамид, не приводило к экстрагированию пигмента из осадка РЦ I(L177)H.

Осадки РЦ после экстракции пигментов были растворены в буфере Трис-НС1, содержащем 0.5% Тритон Х-100, 80 мМ NaCl и 5% ДСН при рН 8.0 и 2.0. Спектры поглощения осадков представлены на рисунке 5.2.3. В спектре поглощения белка РЦ дикого типа (спектр 1) отсутствуют полосы поглощения каких-либо пигментов, а в спектре поглощения белка РЦ I(L177)H при нейтральном значении рН присутствуют полосы поглощения с максимумами при 804 нм и 600 нм, типичные для поглощения БХл, связанного с белком (спектр 3). При рН около 2 наблюдается коротковолновый сдвиг максимумов обеих полос поглощения до 772 и 541 нм, отражающий потерю молекулой БХл центрального атома магния и превращения его в БФео (Рис. 5.2.3, спектр 4). Путем сравнения амплитуд Qx полос в спектре мутантного РЦ до- и после экстрагирования пигментов провели оценку количества БХл, прочно связанного с белком в РЦ I(L177)H. Было показано, что в расчете на один РЦ I(L177)H не экстрагируется 1 молекула БХл (Рис. 5.2.4). Таким образом показано, что в результате одиночной аминокислотной замены изолейцина на гистидин в РЦ Rba. sphaeroides молекула БХл оказалась прочно связана с белком.

Спектры поглощения РЦ I(L177)H, измеренные до (1) и после (2) экстрагирования пигментов. Разложение спектров на Гауссианы показано штриховыми линиями. Дальнейшая работа была направлена на выяснение прочности этой пигмент-белковой связи. На рисунке 5.2.5 показан результат электрофореза РЦ в 18% ПААГ в денатурирующих условиях в присутствии 6 М мочевины и 0,1% ДСН. Основные пигменты РЦ (каротиноид, БФео, феофитинизированный БХл) двигались в геле отдельно от белковых субъединиц и были видны до окрашивания геля как коричневая полоса на уровне 5 kDa. В образце РЦ I(L177)H кроме основной полосы пигментов наблюдалась полоса, окрашенная в зеленый цвет, которая двигалась на уровне L-субъединицы РЦ. Согласно спектру поглощения пигмента, измеренному в геле, эта полоса принадлежит БХл (левый верхний спектр). Следует особо отметить, что в денатурирующих условиях электрофореза молекула БХл, связанная с белковой субъединицей, не феофитинизируется. Таким образом, с помощью электрофореза РЦ I(L177)H в ПААГ в денатурирующих условиях было показано, что 1) один БХл в РЦ I(L177)H связан с L-субъединицей ковалентной связью; 2) у бактериохлорофилла, прочно связанного с белком, наблюдается усиление координирования центрального атома Mg

Тестирование экспрессионного вектора в периодических и непрерывных условиях культивирования Rba. sphaeroides

Ранее в работах [Robles et al., 1990] и [Taguchi et al., 1992] проводилась симметризация белкового окружения кофакторов в РЦ Rba. capsulatus с целью исследования причин асимметричного переноса электрона по А-цепи. Вблизи молекулы Р были внесены как протяженные (М187-М204, Syml мутант), так и более короткие (Ml 94-М204, Syml-2 мутант; М205-М211, Sym2-1 мутант) замены участков М субъединицы на симметричные участки L-субъединицы (см. Глава 1, 1.3.4.1.). Было замечено, что в Syml мутанте выход РЦ при очистке был снижен (Taguchi et al., 1992), а для хорошо охарактеризованных Syml-2 и Sym2-1 мутантов такое упоминание отсутствовало [Taguchi et al., 1996]. Учитывая, что гомология аминокислотных последовательностей рассматриваемых участков вблизи Р в РЦ Rba. capsulatus и Rba. sphaeroides очень высока [El-Kabbani et al., 1991], можно предположить, что симметризация короткого участка M203-M205 не должна приводить к нарушению сборки РЦ Rba. sphaeroides в мембране, хотя в случае более протяженного участка М203-М212 такой эффект возможен.

По-видимому, снижение выхода РЦ при очистке из мембран мутанта 1(М206)Н и других мутантов, полученных в данной работе, прежде всего, связано с внесением замещения Ile-His в позиции М206. После введения дополнительной Н-связи между БХл Рв и белком с помощью мутации F(M197)H исчезает спектральная гетерогенность полосы поглощения Р в мутантных РЦ, однако их выход при очистке остается низким. Примечательно, что спектральные свойства РЦ с пятью аминокислотными заменами F(M197)H+G(M203)M+L(M204)I+S(M205)A+I(M206)H и РЦ 1(Ы77)Н в значительной степени схожи, однако пигмент-белковые взаимодействия, возникающие в РЦ I(L177)H, а именно ковалентная связь БХл Рд с L-субъединицей и 6-координирование БХл Вв, ни в одном другом из мутантных РЦ обнаружены не были.

Учитывая близость позиции М206 от места связывания гликолипида (Рис. 5.6.5) можно предположить, что мутация 1(М206)Н и, возможно, дальнейшие замены аминокислотных остатков, направленные на симметризацию белкового окружения Р, могли нарушить связывание этого липида с поверхностью РЦ, необходимое для стабильной сборки комплекса [Camara-Artigas et al., 2002а]. Известно, что в структурах бактериальных РЦ, имеющихся в настоящее время в базе данных белков (PDB), обнаруживается от одного до нескольких липидов [Jones, 2007]. Наиболее часто встречается кардиолипин, но также есть данные о связывании фосфатидилхолина и гликолипида [Camara-Artigas et al., 2002а]. Отмечено, что липиды имеют постоянные сайты связывания на поверхности комплекса РЦ и, вероятно, играют структурную роль, укрепляя нестабильные участки белка за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий [Jones, 2007]. Было показано, что аминокислотные остатки, контактирующие с кардиолипином, высоко консервативны, а мутации, нарушающие связывание этого липида, снижали термостабильность РЦ [Wakeham et al., 2003]. При выделении и очистке РЦ, по-видимому, происходит потеря части липидов, и поэтому во многих структурах РЦ в местах предполагаемого связывания липидов нередко обнаруживаются молекулы детергентов.

В структуре РЦ, полученной с разрешением 2.55 A (PDB 1МЗХ), кристаллографически определяется гликолипид глюкозил-галактозил-диацил-глицерол, который взаимодействует преимущественно с М-субъединицей, а также с единственной трансмембранной спиралью Н-субъединицы (Рис. 5.6.5) [Camara-Artigas et al., 2002а]. Полярная дисахаридная часть этого липида располагается на расстоянии 3.5 А от БХл Вд, а неполярный «хвост» гликолипида взаимодействует с изопреноидной цепью молекулы QA- Считается, что гликолипид создает гидрофобное окружение для мономерного БХл активной цепи переноса электрона, а также, возможно, стабилизирует структуру РЦ в участке соединения двух субъединиц. В пользу консервативности сайта связывания этого гликолипида свидетельствует тот факт, что в структуре РЦ Blc. viridis в том же месте присутствует электронная плотность, которая была интерпретирована как детергент [Deisenhofer and Michel, 1989]. В полученной нами структуре РЦ I(L177)H на расстоянии 2.98 А от БХл Вд была также обнаружена молекула ЛДАО (Рис. 5.6.6).

Показано, что в структуре РЦ вблизи мономерного БХл Вд полярная дисахаридная часть гликолипида, способная участвовать в ионных взаимодействиях, близко контактирует с Leu-M204, Phe-M208 и Тгр-М268 из М-субъединицы, а также с Leu-H24 и ІІЄ-Н28 из Н-субъединицы [Camara-Artigas et al., 2002а]. Можно предположить, что при замене участка М203-М206 на L174-L176 свойства белкового сайта связывания полярной части гликолипида изменяются вследствие замещения Gly-M203 на Met, Leu-M204 на Не и слабо полярного Ser-M205 на неполярный Ala. Однако основное дестабилизирующее влияние на сборку РЦ в мембране, очевидно, вносит введение полярного гистидина в позицию М206, существенно нарушающее белок-белковые и белок-липидные взаимодействия вблизи бактериохлорофиллов активной цепи кофакторов. Как упоминалось выше, имидазольная группа гистидина в нейтральном состоянии обладает значительным дипольным моментом, наибольшим среди боковых групп других полярных аминокислотных остатков [Sandberg and Edholm, 2001]. Если гистидин, внесенный в результате мутации в гидрофобное окружение мембранного белкового комплекса, не вступает в устойчивые взаимодействия с ближайшими молекулами, его появление может в большой степени дестабилизировать структуру белка. В РЦ I(L177)H введенный в симметричную позицию гистидин L177 образует ковалентную связь с БХл Рд, а также Н-связь с новой молекулой воды с Р-стороны БХл Вв, о чем свидетельствует структура мутантного комплекса, полученная с разрешением 2.9 А (Рис. 5.6.6). Хотя РЦ 1(Ы77)Н менее стабилен, чем РЦ дикого типа, его удельный выход при очистке достаточно высок. Вероятно, из-за присутствия гликолипида вблизи БХл Вд образование подобных взаимодействий в РЦ 1(М206)Н невозможно, что приводит к его дестабилизации, а также препятствует воспроизведению ковалентной связи БХл с белком, наблюдаемой в РЦ 1(Ы77)Н.

Примером стабильного мутантного РЦ, в котором замещение 1(М206)Н не создает проблем для сборки комплекса в мембране, служит упомянутый в предыдущем разделе РЦ I(M206)H+H(M202)L. Несмотря на присутствие «дестабилизирующей» мутации 1(М206)Н, РЦ I(M206)H+H(M202)L отличается стабильностью и высоким выходом при очистке, сравнимым с удельным выходом РЦ дикого типа. Моделирование на основе структуры РЦ I(L177)H позволило предположить, что имидазольная группа His-L177 в РЦ H(L173)L+I(L177)H и His-M206 в РЦ I(M206)H+H(M202)L меняет свою ориентацию и поворачивается в сторону центрального атома магния БХл Рд. По-видимому, образование устойчивого взаимодействия His-M206 с атомом Mg БХл Рв снимает препятствия для связывания гликолипида и таким образом способствует нормальной сборке комплекса.

Таким образом, разные последствия одинаковых аминокислотных замещений в симметричных положениях М206 и L177 в реакционном центре Rba. sphaeroides связаны, по-видимому, с присутствием вблизи БХл Вд полярной части молекулы гликолипида. Внесение His-M206, а также других аминокислотных остатков, замещаемых при симметризации белкового окружения Р, вероятно, мешает связыванию гликолипида и, как следствие, дестабилизирует РЦ.