Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Биомолекулярные и взаимодействия между ними 13
1.2. Групповые антигены системы АВ0 человека, животных и растений 21
1.3. Белок-лигандные взаимодействия: влияние минорных компонентов 38
1.4. Стратегия взаимодействия белков с эндогенными и экзогенными малыми и средними молекулами 60
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 78
2.1. Материалы исследования 79
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение группы крови по системе АВ0 80
2.2.2. Система антиген-антитело АВ0 – модельдля изучения белок-лигандного взаимодействия 83
2.2.3. Биохимические методы исследования 85
2.2.4. Компьютерное предсказание биологической активности соединений 90
2.2.5. Методы визуализации антиген-антительного взаимодействия
2.2.5.1. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 93
2.2.5.2. Проточная цитофлуориметрия 95
2.2.6. Статистическая обработка результатов исследований 99
ГЛАВА 3. Низкомолекулярные компоненты метаболизма – модуляторы межмолекулярных взаимодействий 102
3.1. Влияние пирувата и этанола на антигены А и В эритроцитов крови 102
3.2. Влияние пирувата и этанола на естественные антитела плазмы 111
3.3. Влияние пирувата и этанола на моноклональные антитела 115
3.4. Характер влияния лактата на антигены А и В эритроцитов крови, естественные антитела плазмы и моноклональные антитела 122
3.5. Влияние этанола на каталитическую активность дегидрогеназ 128
ГЛАВА 4. Прогнозирование биологической активности пирувата, лактата, этанола и антигенных детерминант А и В 141
4.1. Прогнозирование спектра биологической активности пирувата 145
4.2. Прогнозирование спектра биологической активности лактата 154
4.3. Прогнозирование спектра биологической активности этанола 160
4.4. Возможные биологические активности и механизмы действия антигенной детерминанты антигена А 171
4.5. Возможные биологические активности и механизмы действия антигенной детерминанты антигена В 179
ГЛАВА 5. Визуализация молекулярно-биологических взаимодействий методами оптического биоимиджинга 187
5.1. Визуализация и количественная оценка антиген-антительного взаимодействия в условиях действия пирувата и этанола с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 188
5.2. Количественная оценка антиген-антительного взаимодейтсвия в условиях действия пирувата методом проточной цитофлуориметрии 206
Заключение 219
Выводы 235
Практические рекомендации 237
Список сокращений 238
Список литературы
- Групповые антигены системы АВ0 человека, животных и растений
- Компьютерное предсказание биологической активности соединений
- Влияние пирувата и этанола на естественные антитела плазмы
- Возможные биологические активности и механизмы действия антигенной детерминанты антигена А
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Характерной чертой
биомедицинских исследований начала постгеномной эры стало возникновение
и развитие ряда новых научных дисциплин – геномики, транскриптомики,
протеомики и метаболомики, использующих в исследованиях системный
подход и комплекс современных технологий. Новые научные дисциплины
стали важнейшими источниками новых знаний о генах, транскриптомах,
белках и метаболитах человека, которые необходимы для развития
фундаментальной биологии и медицины, поскольку на основе этих знаний
формируются и детализируются представления о молекулярных основах
биологических процессов в норме и патологии, а также расширяются
диагностические возможности современной медицины. Независимо от того,
каким образом получены данные, они будут обрабатываться и
интерпретироваться с помощью методов биоинформатики, играющей роль цементирующего начала. Компьютерное моделирование белковых структур и межмолекулярных взаимодействий стало неотъемлемой частью многих областей исследования в биомедицине, так как оно позволяет сформировать математически обоснованные предположения о структуре и биологической активности участников биохимических процессов в организме человека.
В настоящее время установлено, что межмолекулярные взаимодействия играют важнейшую роль в реализации жизненно важных функций в клетке, в органе и в организме в целом. Решающими практически во всех основных биологических процессах, таких как: клеточная регуляция, биосинтез и биoдеградация, передача сигнала, процессы транскрипции и трансляции, образование олигомеров и мультимолекулярных комплексов, упаковка вирусов и иммунный ответ, являются белок-лигандные взаимодействия (Чернов Н.Н., 1996; Терентьев А.А. и соавт., 2009; Kastritis P.L. et al., 2012; Gylmiyarova F.N et al., 2014). Полифункциональность белков обусловлена их способностью изменять конформацию молекулы при взаимодействии с лигандами. Белки могут взаимодействовать практически со всеми типами молекул: от небольших соединений – вода, ионы металлов, углеводы, жирные кислоты, фосфолипиды клеточных мембран – до высокомолекулярных белков и нуклеиновых кислот (Chebotareva N.A. et al., 2015; Du X. et al., 2016). Нарушение взаимодействий между белками лежит в основе некоторых заболеваний (Muronetz V.I. et al., 2016).
Вследствие революционного прогресса в изучении протеомики в настоящее время сложилось более точное представление о количестве белков, синтезируемых в организме, но явно недостаточны знания о лигандах, с которыми белки могут взаимодействовать. Эндогенные метаболиты составляют большинство молекул в клетке, а многочисленные взаимодействия белок–метаболит являются самыми распространенными (Clements M. et al., 2011). Метаболиты могут выступать не только в качестве субстратов и продуктов ферментативных реакций, но и служить регуляторами сигнальных
путей и модуляторами функций как отдельных молекул, так и биохимических каскадов (Cantelmo A.R. et al., 2015). Малые и средние молекулы метаболитов действуют быстро и связываются обратимо, что позволяет эффективно изменять функции белков (Castoreno A.B. et al., 2011).
Актуальность изучения регуляции белок-лигандных взаимодействий обусловлена появлением новых взглядов на роль метаболитов и их ключевое значение в процессах жизнедеятельности.
На сегодняшний день имеющиеся в арсенале науки методы
исследования позволяют получить информацию о состоянии базовых
метаболических путей в организме. Однако практически отсутствует система
данных для выявления индивидуальных молекулярных основ метаболизма,
факторах эндогенной природы, определяющих физиологический уровень
обмена и специфику индивидуальной реакции. Важная роль в специфической
защите организма, энергетическом, метаболическом обеспечении
принадлежит крови и прежде всего эритроцитам, участвующим в поддержании динамического гомеостаза организма (Гильмиярова Ф.Н. и соавт., 2007). Примером структурного и функционального полиморфизма у человека служат антигены эритроцитов системы групп крови АВ0. Создание теоретической и экспериментальной базы данных о функциональной специфике антигенов системы АВ0 может стать основой для выяснения причин индивидуальной реакции на экзогенные и эндогенные факторы обладателей различных групп крови, что будет содействовать дальнейшему развитию персонализированной медицины.
Таким образом, представляется актуальным изучение особенностей влияния низкомолекулярных соединений, участвующих в метаболических процессах, таких как пируват, лактат и этанол, на белок-лигандные взаимодействия, что позволит найти новые пути к выяснению механизмов различных превращений, включая иммунологические, в основе которых лежат процессы межмолекулярного узнавания.
Степень научной разработанности темы исследования. Белок-лигандные взаимодействия управляют множеством сигнальных путей в клетке, которые регулируют гомеостаз и отвечают на внешние и внутренние раздражители. В классическом понимании биохимии многие белок-лигандные взаимодействия рассматриваются как реакция между ферментами и субстратами. Технологические достижения последнего времени позволили выявить ранее неизвестные воздействия метаболитов, которые могут оказывать влияние на функционирование белков. В настоящее время значительные усилия исследователей направлены на изучение свойств малых и средних молекул, которые связываются с определенными белками, изменяя их функции (Dai F. et al., 2012).
В последнее десятилетие изучение взаимодействий белков с малыми молекулами, в частности с метаболитами, запаздывало по сравнению с изучением других типов взаимодействий, таких как белок-белок, белок-ДНК и белок-РНК (Li X. et al.,2013). Только в 2009 году появились первые
публикации о неспецифических взаимодействиях белок–метаболит. Сведения о роли таких эндогенных метаболитов, как пируват, лактат и этанол, участвующих в модулировании функций белков, явно недостаточны. Всё вышеизложенное определило выбор темы настоящего исследования.
Цель исследования: изучить влияние низкомолекулярных
естественных метаболитов – пирувата, лактата, этанола – на белок-лигандные взаимодействия и охарактеризовать их регуляторные возможности.
Задачи исследования:
1. Разработать модельную систему для выявления влияния
низкомолекулярных метаболитов (пирувата, лактата, этанола) на
межмолекулярные взаимодействия с использованием антигенов и антител системы АВ0 крови.
2. Изучить особенности действия пирувата, лактата и этанола на
антиген–антительное взаимодействие в модельных вариантах экспериментов:
с антигенами А и В эритроцитов человека А(II), B(III) и АВ(IV) групп крови; с
естественными анти-А и анти-В антителами плазмы; с анти-А и анти-В
моноклональными антителами.
-
Изучить влияние этанола на белок-лигандные взаимодействия ферментов: глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а-глицеролфосфат-дегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в гемолизате цельной крови и в изолированной среде.
-
Охарактеризовать спектр вероятной биологической активности пирувата, лактата, этанола и антигенных детерминант антигенов А и В системы АВ0 методом молекулярного моделирования с использованием программы Prediction of Activity Spectra for Substances (PASS).
5. Визуализировать и количественно оценить взаимодействия
группоспецифических антигенов с антителами системы АВ0 крови в условиях
действия пирувата и этанола методом конфокальной лазерной сканирующей
микроскопии.
6. Количественно оценить взаимодействие антиген–антитело системы
АВ0 крови в условиях действия пирувата методом проточной
цитофлуориметрии.
Научная новизна. Впервые для изучения белок-лигандного
взаимодействия в качестве тест-системы использована антиген–антительная система АВ0 крови, а в качестве факторов воздействия – пируват, лактат и этанол. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о модификации взаимодействий антигена с антителом при воздействии пирувата, лактата и этанола, что приводит к регистрируемому изменению степени и скорости агглютинации. Выявлена специфика белок-лигандного взаимодействия, связанная с АВ0-группоспецифическими структурными особенностями антигенов и антител.
Для выявления влияния этанола на белок-лигандные взаимодействия
были использованы фермент-субстратные дегидрогеназные системы.
Установлено, что активность глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а-5
глицеролфосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы как в гемолизате цельной крови, так и в изолированной среде повышалась под влиянием этанола.
Впервые предсказаны многопрофильные биологические активности и оценен резерв метаболических свойств пирувата, лактата и этанола, а также антигенных детерминант антигенов А и В системы АВ0 крови с использованием новых технологий компьютерного моделирования. Благодаря многообразию спрогнозированных биологических эффектов, антигены системы АВ0 открываются с новой перспективной стороны как биологически активные соединения, а не только как группоспецифические антигены, обеспечивающие защиту клеток крови.
Впервые использован новый подход для визуализации
межмолекулярного взаимодействия антиген–антитело в условиях влияния
биологически активных соединений эндогенного происхождения. С целью
количественной оценки результатов взаимодействия антигенов и антител при
введении малых молекул в систему впервые использованы методы
конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной
цитофлуориметрии.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Полученные новые экспериментальные данные свидетельствуют о влиянии
метаболитов, в частности пирувата, лактата и этанола, на процессы
межмолекулярного взаимодействия. Доказана информативность
использования антиген–антительной системы АВ0 и дегидрогеназной
фермент-субстратной системы для количественной оценки белок-лигандного
взаимодействия, а также определен характер влияния на эти процессы
биогенных веществ. Исследуемые низкомолекулярные компоненты
метаболизма способны взаимодействовать с различными белками –
антигенами, антителами, каталитическими белками, изменяя их
функциональную активность, что может быть использовано для поиска путей коррекции нарушений метаболизма при различных заболеваниях.
Проведенные эксперименты in vitro, исследования in silico служат основанием для заключения о регуляторном потенциале низкомолекулярных метаболитов, способных влиять на антиген–антительные и метаболические процессы.
Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры биохимии
имени академика Т.Т. Березова Медицинского института Российского
университета дружбы народов, кафедры фундаментальной и клинической
биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государственного
медицинского университета, кафедры биохимии Саратовского
государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского, кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии Красноярского государственного медицинского университета им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого, кафедры биохимии Казанского государственного медицинского университета и используются в
практической работе клинико-диагностической лаборатории клиник
Самарского государственного медицинского университета.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработана новая модельная система для изучения белок-
лигандного взаимодействия, представленная антигенами и антителами
системы АВ0 крови. Показано специфическое влияние пирувата, лактата и
этанола на антиген–антительное взаимодействие.
-
Доказано влияние этанола на белок-лигандные взаимодействия дегидрогеназ: глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, -глицеролфосфат-дегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в гемолизате цельной крови и в изолированной среде.
-
Выявлен широкий спектр биологической активности пирувата, лактата, этанола и детерминант антигенов А и В системы АВ0 крови методом компьютерного моделирования.
4. Установлена возможность использования конфокальной лазерной
сканирующей микроскопии и проточной цитофлуориметрии для визуализации
и количественной оценки межмолекулярных взаимодействий в условиях
влияния биологически активных веществ эндогенного происхождения.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора. Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций основываются на достаточном числе наблюдений и адекватной статистической обработке результатов с помощью пакета компьютерных программ Statistical Package for the Social Science (SPSS) 10.0
Результаты исследований были представлены на Российской
конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии»
(Челябинск, 2009); на II Международной научно-практической конференции
«Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической
медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); XVI
Международной научной конференции «Здоровье семьи в XXI веке»
(Будапешт, 2012); Международной научно-практической конференции
«Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической
медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Казань, 2012, 2014);
Всероссийской научной конференции «Медицинская лабораторная
диагностика: будущее и новации» (Санкт-Петербург, 2014); Российской научно-практической конференции «Медицинская биохимия: достижения и перспективы» (Казань, 2015); XXI Всероссийской научно-практической конференции «Качество лабораторных исследований – условие безопасности пациентов» (Москва, 2016), 8th Annual International Congress of Antibodies (КНР, Далянь, 2016); V Съезде биохимиков России (Сочи, 2016).
Диссертационная работа прошла апробацию на кафедре биохимии имени академика Т.Т. Березова Медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» и на межкафедральном заседании кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой; кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии
и кафедры медицинской биологии, генетики и экологии ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет».
Личный вклад автора в получение научных результатов, изложенных в диссертации, состоял в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщения данных литературы по теме диссертационной работы, формулировке цели и задач, а также проведении экспериментов in vitro и in silico по оценке влияния пирувата, лактата и этанола на белок-лигандные взаимодействия. Участие автора в сборе первичного материала и его обработке – более 80%, обобщении, анализе и внедрении в практику результатов работы – 100%. Самостоятельно проведена статистическая обработка результатов, написан текст диссертации, сформулированы выводы и практические рекомендации.
Публикации. Общее количество публикаций 64, по теме диссертации опубликовано 40 научных работ, в том числе 17 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов. Выданы патент РФ № 2484480 и 2 свидетельства о государственной регистрации программы для ЭВМ.
Объем и структура и диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию объектов и методов исследования, трех глав собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 312 страницах, иллюстрирована 50 рисунками, содержит 44 таблицы. В работе использовано 696 литературных источников, из них 112 отечественных и 584 зарубежных авторов.
Работа выполнена в рамках Федеральной программы:
«Взаимодействие биологически активных веществ растительного и животного происхождения с системами жизнедеятельности организма с учетом биологической вариабельности метаболизма, ассоциированной с групповой принадлежностью крови» (номер гос. регистрации 0120.0809698).
Групповые антигены системы АВ0 человека, животных и растений
В качестве объектов взаимодействия могут выступать различные пары: белок–белок, белок–липид, белок–полисахарид и другие. Для достижения достаточно прочного связывания белков при их взаимодействии необходимы комплементарность контактирующих поверхностей, правильная подгонка ван дер-ваальсовых поверхностей, точное спаривание заряженных групп и донорно-акцепторных пар, участвующих в водородных связях, а также соответствующий вклад гидрофобных взаимодействий. Например, связывание полисахарида гепарина с белком антитромбином осуществляется за счет электростатических сил – ван-дер-ваальсового взаимодействия и взаимодействия заряженных ионизированных групп. Молекула гепарина имеет высокий отрицательный заряд, плотность которого превышает плотность зарядов других биомолекул, что обеспечивает его взаимодействие с антитромбином (Haker U. et al., 2005; Bishop J.R. et al., 2007). Лектины – белки с высоким сродством и специфичностью связывания с углеводами. Рентгеноструктурный анализ комплексов лектинов с углеводами позволил детально изучить эти взаимодействия. Так, например, с рецептором маннозо-6-фосфата лектин связывается через остаток аргинина водородной связью с гидроксильной группой второго атома углерода в остатке маннозы-6-фосфата, а остаток гистидина образует водородную связь с атомом кислорода в фосфатной группе (Varki A. et al., 2006). Кроме специфических взаимодействия имеются и более общие взаимодействия. Например, в белок-углеводных взаимодействиях углевод часто выступает в роли носителя информации при межклеточных контактах или необходим при прикреплении патогенов к клеткам (Gama C.L. et al., 2005; Mendonca-Previato L. et al., 2005).
В многоклеточных организмах клетки для выполнения своих разнообразных функций должны обмениватся между собой информацией об окружающей среде, определяя рН среды, наличие кислорода, присутствие различных химических веществ. Во всех этих случаях информация передается с помощью сигнала, который принимается рецептором и преобразуется в ответ химическими реакциями. Это передача сигнала называется трансдукцией и является универсальным свойством живых организмов. Взаимодействие сигнального вещества и рецептора происходит в высшей степени специфично, что достигается комплементарностью (соответствием) между молекулами и опосредуется теми же типами слабых, нековалентных сил, которые наблюдаются в фермент-субстратных и антиген–антительных взаимодействиях (Clemente N. et al., 2010). Рецепторы для сигнального вещества находятся в определенных типах клеток, например, адреналин усиливает распад гликогена в клетках печени. Трансдукцию сигнала обеспечивает не только высокое сродство рецептора и сигнальной молекулы (лиганда), но и кооперативность взаимодействия различных молекул, например – усиление сигнала каскадами метаболических реакций (амплификация). Амплификация происходит, когда фермент активируется связыванием с рецептором, в последующем активирует молекулу второго фермента, каждый из которых активирует множество молекул третьего фермента (Birnbaumer L., 2007). Ферментативные каскады встречаются в большинстве систем, активируемых гормонами.
Сродство лиганда и рецептора часто описывают константой диссоциации – Кd, обычно 10-10 М. Количественно лиганд-рецепторные взаимодействия можно оценить анализом по Скэтчарду, что позволяет определить Кd и число лиганд-связывающих центров. Взаимодействие лиганд-рецептор приводит к изменению конформации, влияющей на активность рецептора, который может быть ферментом, регулятором фермента, регулятором экспрессии генов или ионным каналом. Различные сигнальные пути запускают множество взаимодействий, которые поддерживают равновесие в клетке и в организме в целом. Система передачи сигналов может включать около десяти компонентов, с помощью которых происходит передача нервного импульса, зрительное и вкусовое восприятие, ответ на сигналы гормонов (Baylon D., 1996; Margolskee R.E., 2002). Часто заключительным этапом сигналпередающего механизма является фосфорилирование белков, которые приводит к активации белков (Pawson T. et al., 2005). У высокоорганизованных животных существует большое разнообразие рецепторов и основных механизмов сигнализации: мембранные белки, действующие через G-белки, рецепторные гуанилатциклазы, активирующие протеинкиназы, рецепторные ферменты (тирозинкиназа), ионные каналы, адгезионные рецепторы, ядерные рецепторы, которые воздействуют на эксперессию генов (Аляутдин P.H., 2013). Ключевую роль в системах передачи сигналов играют протеинкиназы и обратимое белок-белковое взаимодействие. Многие сигнальные белки мультивалентны, т.е. содержат несколько связывающих участков и могут взаимодействовать с несколькими белками одновременно, образуя большое количество сложных мультибелковых сигнальных комплексов и делая сигнализацию более эффективной (Hall J.M. et al., 2001).
Сигналпередающие системы, используемые у высокоорганизованных животных, имеют аналоги у бактерий, архей, эукариот и растений (Becraft P.W., 2002; Аssmann S.M., 2005). Например, бактерия Escherichia coli имеет двухкомпонентную систему передачи сигнала, реагируя на содержание питательных веществ – углеводов, аминокислот, а также на содержание кислорода и изменение температуры. Система включает мембранный белок – гистидинкиназу, один участок которого связывает лиганд-углеводный остаток или аминокислоту, а другой участок, после связывания лиганда, фосфорилирует сам себя. Далее гистидинкиназа переносит остаток фосфорной кислоты на второй белок, который является регулятором ответа на данный сигнал. Двухкомпонентная система встречается у многих бактерий, простейших и грибов (Bakal C.J. et al., 2000).
Компьютерное предсказание биологической активности соединений
Этот мембранный белок выкачивает ионы натрия из клетки, одновременно накачивая ионы калия внутрь клетки, тем самым регулирует концентрацию внутриклеточных одновалентных катионов, участвует в поддержании мембранного потенциала, объема клетки, транспорта аминокислот, глюкозы и нуклеотидов через плазматическую мембрану (Magistretti P.J. et al., 2005; Curthoys N.P. et al., 2014). Накопившиеся данные литературы свидетельствуют о существовании быстрых и множественных механизмов регуляции АТФ-зависимого транспорта Na+ и К+, т.к. изменение в распределении ионов внутри клетки приводит к запуску целого ряда биохимических процессов (Аккуратов Е.Е., 2012). В литературе есть сведения, что АТФ оказывает модифицирующее действие на Na/K-АТФазу за счет оттягивания протона от остатка Гис-13, диссоциация которого активирует изменение конформационного состояния фермента. Можно сказать, что субстрат способен функционировать как регулятор, повышая эффективность работы Na-насоса. Было показано ингибирование активности Na/K-АТРазы активными формами кислорода, которое устраняет активирующие действие АТФ за счет нарушения белок-белкового взаимодействия. Другой способ модификации активности фермента связан с его фосфорилированием протеинкиназами А и С (Болдырев A.A., 2008). Результат фосфорилирования Na/K-АТФазы протеинкиназами А зависит от доступности Сер-938 и может проявляться как в активации, так и в ингибировании активности фермента. Таким образом, существует несколько способов регуляции активности фермента, но их запуск зависит от конкретной ситуации в клетке – наличия антиоксидантов, АФК, активных протеинкиназ (Болдырев A.A., 2001). В литературе есть данные, что Na/K-АТФаза способна функционировать как рецептор, специфическим лигандом которого могут быть соединения класса кардиотонических стероидов. Связывание Na/K-АТФазы с этими стероидами может регулировать экспрессию генов через активацию транскрипционных факторов (Quintas L.E. et al., 2010). Белок агрин, участвующий в формировании синапсов, способен специфически связываться с Na/K-АТРазой и вызывать эффекты, аналогичные действию стероидов (Hilgenberg L.G. et al., 2006). В последнее время появились данные о возможной взаимосвязи между Na/K АФРазой и глутаматными рецепторами и о возможном участии фермента в функционировании глутаматной системы (Zhang D.J. et al., 2009; Langer J. et al., 2009). Показано прочное связывание интегрального белка Na/K-АТРазы с периферическими белками семейства анкиринов, участвующих в адгезии с актин-спектриновым цитоскелетом клетки (Лопина О.Д., 2001). Анкиринсвязывающий участок Na/K-АТФазы контактирует с анкириновым повтором в мембрансвязывающем домене анкирина, создавая потециальные участки для гидрофобного и ионного взаимодействия.
Принято считать, что анкириновые повторы сформировались в процессе эволюции как всеобщий модуль, гарантирующий взаимодействия не только между белками, но и между белками и нуклеиновыми кислотами (Layton C.J. et al., 2011; Scholz O. et al., 2014). Локализация Nа/К-АТФазы в определенных участках мембраны обеспечивается доставкой вновь синтезированного фермента из аппарата Гольджи и удалением неправильно расположенных молекул фермента с последующей их деградацией. Это становится возможным за счет взаимодействия Na/K-ATФaзы с анкиринами и опосредованно с белками цитоскелета (Anong W.A. et al., 2009). В литературе последних лет высказывается предположение, что анкирины-B образуют мембранный комплекс с сердечной Na/K-АТФазой, тем самым участвуют в регуляции экспрессии мембранного ионного канала в сердце и в развитии сердечной ишемии (Li J. et al., 2010; Chorzalska A. et al., 2010). Можно сделать вывод, что Na/K-АТРазы влияют не только на гомеостаз ионов в клетке, но и являются активным регулятором метаболических процессов в клетке, взаимодействуя с различными соединениями (Bers D.M. et al., 2003; Pavlovic D. et al., 2014).
Семейство белков анкиринов играет роль интегрирующего звена, объединяющего различные метаболические процессы в клетке. Так, доказано взаимодействие анкиринов с белком цитоскелета эритроцита – белком полосы 3 (переносчик анионов НСО3-/Сl), спектринами, рецепторами инозитол-3 фосфата, гиалуроновой кислоты, гликопротеинов мозга, а также с протеинкиназами С, тубулином, десмином и виментином (Батрукова М.А. и соавт., 2000). При исследовании влияния анкирина на олигомеризацию белка полосы 3 было выявлено, что удаление анкирина вызывает диссоциацию олигомерного белка до мономеров. В результате диссоциации белка полосы 3 исчезает большинство анкиринсвязывающих участков. Установлено, что при связывании белка цитоскелета паллидина с белком полосы 3 на последнем уменьшается количество сайтов связывания с анкирином. Возможно, так регулируется механическая функция примембранного цитоскелета (Rubtsov A.M. et al., 2000). В литературе появились данные том, что анкирины и многие белки, содержащие анкириновые повторы (интегрины, некоторые протеинкиназы, белки, ингибиторы цитокинов), участвуют в путях передачи сигналов (Hryniewicz-Jankowska A. et al., 2002). Связывание анкирина с кальцийсодержащими белками ингибирует их связывание с рецепторами инозитол-3-фосфата и, как следствие, индуцируемый выброс кальция. По-видимому, это взаимодействие играет ключевую роль в регуляции выброса кальция через систему фосфолипаза С – инозитол-3-фосфат (Bennett V. et al., 2001).
Влияние пирувата и этанола на естественные антитела плазмы
Основа для предсказания известна давно и связана с утверждением: «Биологическая активность вещества является функцией его химической структуры». Надо установить вид этой функции, а также структурную формулу исследуемого вещества, получив в результате прогностическую оценку его биологической активности (Поройков В.В., Филимонов Д.А., 1999). Эмпирический путь исследования биологической активности у химических соединений малоэффективен. В настоящее время число различных структур химических соединений, по данным Chem Navigator, составляет 60 миллиона, а число виртуальных молекул, содержащих до 13 атомов, - почти миллиард (Blum L. et al, 2009). Понятно, что экспериментальное тестирование всех химических соединений на все возможные биологические мишени практически невозможно, и поэтому помощь специальной компьютерной системы стала полезной и необходимой (Поройков В.В. и соавт, 2011). Идея создания компьютерной системы прогноза биологической активности, на первый взгляд, выглядит просто: нужно собрать всю известную информацию о биологически активных соединениях, создать на этой основе обучающую выборку, провести анализ связей «структура-активность» для веществ из обучающей выборки и построить соответствующие зависимости. Подставив в эти зависимости, данные о структуре нового вещества, можно получить оценку его биологической активности. Однако канонические подходы к анализу количественных соотношений «структура-активность» приложимы к соединениям только одного химического класса и, как правило, оперируют с единственным видом биологической активности. В настоящее время разработаны и апробированы методы компьютерного прогноза для веществ, гетерогенных как по химической структуре, так и по проявляемому ими биологическому действию.
Компьютерная программа PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances), созданная в рамках Государственной системы регистрации новых химических соединений, предназначена для прогноза плейотропного действия веществ. В течение последних десяти лет исследованы тысячи различных химических соединений, сотни вариантов алгоритмов с целью разработки единого подхода, обеспечивающего построение достаточно точных моделей связей «структура–активность» (SAR). В результате современная версия компьютерной программы PASS прогнозирует более 4300 видов биологической активности с высокой точностью (Поройков В.В. и соавт., 2011). В PASS версии 1.917 SAR base содержится 57.978 описаний структуры молекул и спектра активности биологически активных веществ и лекарств.
Химическая структура веществ описывается в виде многоуровневых атомных окрестностей – МNА-дескрипторов (MNA – Multilevel Neighborhoods of Atoms), которые формируются автоматически на основе MOL или SDF файлов (MDL Information Systems, Inc.). MOL или SDF файлы являются в настоящее время de facto стандартом для компьютерного представления структурных формул химических веществ. В PASS версии 1.917 словарь MNA-дескрипторов состоит из 44.041 дескрипторов 1-го и 2-го уровней. Важной особенностью MNA-дескрипторов является их открытость, они создаются на основе конкретной химической формулы, а не на основе искусственно составленного списка структурных фрагментов.
Биологическая активность описывается в PASS качественным образом (да/нет), результат прогноза помимо названий активности включает оценки вероятностей наличия (Pa) и отсутствия каждой активности (Pi), имеющие значения от 0 до 1 (Филимонов Д.А., Поройков В.В., 2006). Поскольку эти вероятности рассчитываются независимо, их сумма не равна единице. Упорядочение выполняется по убыванию разности Ра – Рi, так что наиболее вероятные виды активности находятся в начале спрогнозированного списка.
Вероятность Ра показывает сходство структуры молекул исследуемого вещества со структурами молекул, наиболее типичных в соответствующем подмножестве «активных» веществ в обучающей выборке (Луценко Р.В. и соавт., 2013). Риск получения отрицательного результата в эксперименте тем больше, чем меньше величина Ра, однако и новизна такой структуры будет более высокой (Лагунин А.А. и соавт., 2001).
Полный набор биологических активностей, которые может проявить исследуемое вещество, называется спектром биологической активности данного вещества. Нами использовались низкомолекулярные метаболиты с известной структурой и значение Ра (вероятность наличия биологической активности) принимали более 0,5. Поскольку PASS позволяет одновременно предсказывать взаимодействие химических соединений с большим количеством биологических мишеней, интерпретировать полученные результаты и отбирать вещества с плейотропным действием помогает программа Pharma Expert. Полученные данные позволяют предположить наличие у ряда веществ активности, не выявленной ранее из-за ограниченных возможностей использованных экспериментальных моделей.
Возможные биологические активности и механизмы действия антигенной детерминанты антигена А
В литературе встречаются данные о влиянии различных соединений на связывание иммуноглобулинов с антигенами эритроцитов. В исследованиях И.В. Шабунина установлено, что современные органические йодсодержащие рентгеноконтрастные средства имеют сродство к иммуноглобулинам и могут связываться с ними, вследствие этого ингибируется их способность взаимодействовать с антигенами (Шабунина И.В. и соавт., 2000). Алкилоксибензолы, имеющих в своем составе алкильный радикал, угнетают способность иммуноглобулинов к специфическому связыванию с антигенами. Основной вклад в модификацию антител вносят взаимодействия гидрофобных алкильных радикалов алкилоксибензолов с гидрофобными аминокислотами в области активного центра антител. Гидроксильные радикалы исследуемых бензолов могут также влиять на степень гидратации белка. Совместно эти эффекты приводят к изменению конформации иммуноглобулина, которая необходима для комплексообразования антиген–антитело (Дерябин Д.Г. и соавт., 2009). В работе С.А. Бобровника показано, что определяющими для связывания иммуноглобулинов с антигенами являются такие факторы, как стерическая комплементарность, комплементарность зарядов эпитопа и паратопа и ван-дер-ваальсовы взаимодействия (Бобровник С.А., 2002). Показано, что эмбриональный альфа-фетопротеин может ингибировать реакцию агглютинации А и В антигенов эритроцитов со специфическими антисыворотками. Гемагглютинация не ингибируется другими белками амниотической жидкости. Ингибирующий эффект связан с количеством антител и концентрацией альфа-фетопротеина (Brenner T. et al., 1985).
Три серии модельных экспериментов по изучению влияния лактата на антигены А и В эритроцитов А(II), В(III) и АВ(IV) групп крови, моноклональные и естественные антитела показали, что введение лактата в систему антиген–антитело вызывает структурно-функциональные изменения антигенов А и В и антител к ним благодаря высокой химической активности гидроксикислоты и наличию отрицательного заряда. Можно предположить модифицирующее действие лактата на белок, и, как следствие, изменение показателей реакции агглютинации – степени и времени начала агглютинации.
Белок-лигандные взаимодействия лежат в основе многих метаболических процессов, происходящих в клетке. В последние годы появляется много информации о регуляции белок-лигандных взаимодействий в принципиально новых, ранее не изученных аспектах. Нам было интересно, как этанол – соединение с низкой молекулярной массой и высокой химической активностью – влияет на белок-лигандные взаимодействия – фермент-субстратные. В качестве объекта изучения мы выбрали группу ферментов из класса оксидоредуктаз – дегидрогеназы, катализирующие окислительно восстановительные реакции, а именно перенос водорода от одного субстрата на другой. Мы изучали эффекты этанола на активность глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФД), -глицеролфосфат дегидрогеназы (-ГФД) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). ГАФД, -ГФД и ЛДГ относятся к семейству НАД-зависимых дегидрогеназ. Энзимологи эту группу ферментов выделяют как уникальный биологический объект для изучения происхождения и эволюции белковых катализаторов, имеющих сложные коферменты. Все три фермента играют ключевую роль в углеводно-липидном обмене, обеспечивающем образование энергии в живых организмах и восполнение субстратов для различных метаболических процессов.
Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (D-глицеральдегид-3-фосфат: NAD оксидоредуктаза фосфорилирующая – КФ 1.2.1.12) катализирует превращение глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-бисфосфоглицерат в присутствии НАД.
Содержание ГАФД в клетке превышает содержание остальных ферментов и составляет 10-20% от общего количества растворимых белков, что, несомненно, способствует тому, что фермент широко используется как модельный объект (Арутюнов Д.Ю. и соавт., 2002). Самое высокое содержание ГАФД определено в цитоплазме, фермент может также присутствовать в митохондриях и в ядре (Butterfield D.A et al., 2010). При физиологических условиях (рН, ионная сила) молекула ГАФД положительно заряжена и может связываться с любыми отрицательно заряженными биомолекулами, так как обладает высокореакционноспособными сульфгидрильными группами активного центра (Плетень А.П., 2009). В настоящее время имеются многочисленные данные о том, что ГАФД осуществляет не только гликолитические функции, но и способна взаимодействовать с другими белками, нуклеиновыми кислотами, а также с внутриклеточными структурами, выполняя неканонические функции. ГАФД может участвовать в мембранном транспорте, образовании цитоскелета, регуляции экспрессии генов, а также может взаимодействовать с рядом малых молекул, в том числе с фактором некроза опухоли, глутатионом и оксидом азота (Muronetz V.I. et al., 1994; Volker K.W. et al., 1995; Hara M.R. et al., 2006; Bryksin A.V. et al., 2008; Dai R.P. et al., 2008; Groblewska M. et al., 2008; Hwang N.R. et al., 2009). Одной из наиболее интересных функций ГАФД является участие в апоптозе клетки (Sen N. et al., 2008). Кроме того, было обнаружено, что фермент играет важную роль в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и Хантингтона (Mazzola J.L. et al., 2002; Shalova I.N. et al., 2007; Kadmiri N. et al., 2014; Аvila C.L. et al., 2014). Нативная молекула ГАФД находится в форме олигомера, состоящего из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых имеет свой активный центр (рис. 23).