Особенности нарушений окислительного метаболизма при сочетанной эндокринной и дерматологической патологии и возможности их коррекции в эксперименте Попов Константин Андреевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 14

1.1. Роль окислительного стресса в патобиохимии сахарного диабета 15

1.2. Неферментное гликирование белков и окислительный стресс 21

1.3. Этиология, распространенность и основы патогенеза кожных заболеваний, в том числе при сочетанном течении с сахарным диабетом 25

1.3.1. Сахарный диабет и псориаз 29

Глава 2. Материалы и методы исследования 32

2.1. Общая характеристика групп больных 32

2.2. Характеристика групп исследуемых лабораторных животных 36

2.3. Лабораторные методы исследования

2.3.1. Лабораторные методы исследования показателей углеводного обмена 41

2.3.2. Лабораторные методы исследования показателей белкового обмена 42

2.3.3. Лабораторные методы исследования показателей липидного обмена 43

2.3.4. Лабораторные методы исследования функционального состояния антиоксидантной системы в крови и ротовой жидкости 46

2.3.5. Лабораторные методы исследования интенсивности свободнорадикальных процессов в крови и ротовой жидкости 52

2.3.6. Лабораторные методы исследования уровня эндогенной интоксикации в крови и ротовой жидкости 54

2.3.7. Интегральные методы оценки состояния антиоксидантной защиты 55

2.4. Выполнение статистической обработки результатов исследования 58

Глава 3. Особенности окислительного метаболизма у больных с сочетанным течением сахарного диабета 2 типа с дерматологическими заболеваниями

3.1. Состояние углеводного и липидного обменов у больных с эндокринными, дерматологическими и сочетанными нарушениями .

3.2. Состояние функционирования антиоксидантной системы крови и ротовой жидкости больных с эндокринными, дерматологическими и сочетанными нарушениями

3.3. Показатели интенсивность свободнорадикальных процессов и уровня эндогенной интоксикации в крови и ротовой жидкости больных с эндокринными, дерматологическими и сочетанными нарушениями

Глава 4. Возможности метаболической коррекции экспериментального диабета у крыс с использованием средств антиоксидантной направленности 85

4.1. Влияние исследуемых средств антиоксидантной направленности на уровень гликемии и содержание некоторых показателей липидного профиля в плазме крови крыс с экспериментальным сахарным диабетом 85

4.2. Функционирование антиоксидантной системы в условиях развития экспериментального сахарного диабета и при его коррекции антиоксидантными средствами 89

4.3. Интенсивность свободнорадикальных процессов в крови у крыс с экспериментальным сахарным диабетом и при его коррекции антиоксидантными средствами 92

4.4. Показатели уровня эндогенной интоксикации в условиях развития экспериментального сахарного диабета у крыс

и при его коррекции антиоксидантными средствами 95

Глава 5. Обсуждение полученных результатов 97

5.1. Особенности окислительного метаболизма у больных с сочетанным течением сахарного диабета и дерматологических заболеваний 97

5.2. Возможности метаболической коррекции патобиохимических изменений при сахарном диабете в эксперименте 103

Глава 6. Заключение 107

Выводы 123

Практические рекомендации 125

Список сокращений 126

Список литературы

• Неферментное гликирование белков и окислительный стресс
• Лабораторные методы исследования показателей белкового обмена
• Состояние функционирования антиоксидантной системы крови и ротовой жидкости больных с эндокринными, дерматологическими и сочетанными нарушениями
• Интенсивность свободнорадикальных процессов в крови у крыс с экспериментальным сахарным диабетом и при его коррекции антиоксидантными средствами

Введение к работе

Актуальность исследования. Актуальной проблемой современного здравоохранения является сахарный диабет (СД), распространенность которого позволяет говорить об эпидемии данного заболевания. Эксперты Всемирной диабетической федерации прогнозируют, что количество больных СД к 2040 г. достигнет 642 млн человек [IDF, 2015]. В Российской Федерации в 2014 году всего было зарегистрировано 4,17 млн человек с диагнозом сахарный диабет [Здравоохранение в России, 2015].

Относительная или абсолютная инсулиновая недостаточность при диабете ведет к нарушениям метаболизма глюкозы, липидов и белков. В основе развития поражения кожи при СД 2 типа лежат нарушения углеводного обмена и накопление соответствующих продуктов измененного метаболизма, которые в сочетании с диабетическими ангиопатиями, нарушениями местного и общего иммунитета приводят к структурным изменениям в дерме, эпидермисе, фолликулах и потовых железах [Т.Б. Моргунова и соавт., 2010]. Нередко дерматологические проявления могут выступать в качестве «сигнальных признаков» заболевания. В настоящее время описано более 30 видов дерматозов, которые предшествуют СД 2 типа или развиваются на фоне манифестного процесса [А.Н. Хлебникова, Н.В. Марычева, 2011; Ю.М. Штода и соавт., 2014]. Обменно-эндокринные нарушения нередко являются пусковым механизмом развития некоторых дерматозов (псориаз, атопический дерматит, микробная экзема, дисгидротическая экзема, кольцевидная гранулема, и т.д.). Отмечается определенная взаимосвязь течения этих заболеваний с наличием эндокринопатии. Нарушение функции и целостности эпидермального барьера в результате прямого воздействия факторов агрессии на роговой слой приводит к эпидермальной гиперплазии и может оказаться пусковым механизмом в развитии гиперпролиферативного кожного заболевания, такого, как псориаз. Немаловажное значение в поражении кожи имеет и хроническая гипергликемия.

Степень разработанности темы. Особое место в развитии патобиохимических нарушений многих заболеваний принадлежит окислительному стрессу вследствие усиления активности свободнорадикальных процессов, перекисного окисления биомолекул со снижением потенциала антиоксидантной системы (АОС) [L. Robert et al., 2008; B. Halliwell, 2009]. При сахарном диабете данные процессы являются следствием усиленного аутоокисления глюкозы и формируются как один из компонентов воспаления. Неферментативное гликирование само по себе нарушает нативную конфор-мацию молекул белков с изменениями их функции, а также ведет к образованию конечных продуктов гликирования, инициирующих экспрессию генов синтеза коллагена и других белков мембран капилляров, что еще больше усиливает атерогенные свойства крови [A.L. Groeger, B.A. Freeman, 2010]. Кроме того, развивается дисфункция эндотелия, сопровождающаяся усилением продукции ингибитора активации плазминогена, клеточных адгезивных молекул и снижением продукции вазодилатато-ра – оксида азота в сосудистой стенке.

Многочисленные исследования выявили достоверно повышенные уровни маркеров окислительного стресса у больных псориазом, включая сывороточный и эритроцит-раный малоновый диальдегид (МДА) [H. Nemati et al., 2014; W. Barygina et al., 2013; V.M. Pujari et al., 2014], гидропероксиды липидов [G. Ferretti et al., 2012], диеновые конъюгаты, оксид азота [S.A. Gabr et al., 2012; A. Sikar Akturk et al., 2012] и другие активные формы азота [D.P. Kadam et al., 2010]. В исследованиях также обнаружено снижение уровня антиоксидантов, таких как общие тиолы плазмы крови [S. Emre et al., 2017], витамин Е [V.M. Pujari et al., 2014], а также снижение активности основных анти-оксидантных ферментов [H. Nemati et al., 2014]. Уровни тканевого МДА в поврежденной коже больных псориазом оказались значительно выше, чем у лиц с интактной кожей [A. Sikar Akturk et al., 2012]. Имеются сведения о том, что уровень общей антиоксидант-3

ной активности (АОА) крови у больных псориазом ниже, чем у здоровых лиц [M. Hashemi et al., 2010], и что более важно, более низкие уровни АОА сопровождаются усилением маркеров окислительного стресса [H.A. Surucu et al., 2015]. Вышеуказанные данные показывают то, что окислительный стресс может играть значительную роль в патогенезе псориаза.

Несмотря на общность некоторых патогенетических звеньев рассматриваемых нозологических единиц на молекулярном уровне, достаточную изученность иммунологической реактивности и окислительного метаболизма при СД, псориазе, атопиче-ском дерматите и склеродермии, патобиохимические особенности сочетанных форм рассматриваемых болезней остаются невыясненными и дискуссионными. Кроме того, вполне вероятно, что воздействие на данные патогенетические звенья у больных СД 2 типа и дерматологическими заболеваниями приведет к стойкой ремиссии дерматоза и снижению риска развития сосудистых осложнений СД.

Исходя из вышеизложенного, следует признать актуальным изучение особенностей окислительного метаболизма и продукции гуморальных факторов защиты при со-четанных дерматологических (псориаз, атопический дерматит, ограниченная склеродермия) и эндокринных (сахарный диабет 2 типа) заболеваниях.

Цель исследования: изучить особенности окислительного метаболизма при сочетанном течении сахарного диабета с псориазом, атопическим дерматитом или ограниченной склеродермией, разработать алгоритм неинвазивного мониторинга указанных нозологий, а также исследовать возможности метаболической коррекции сахарного диабета в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Изучить интенсивность окислительных процессов и выраженность эндогенной интоксикации по данным биохимических и биофизических исследований крови и ротовой жидкости у больных с сочетанным течением сахарного диабета 2 типа с псориазом, атопическим дерматитом или ограниченной склеродермией.

2. Проанализировать особенности функционирования отдельных звеньев анти-оксидантной системы крови и ротовой жидкости у больных с сочетанным течением сахарного диабета 2 типа с псориазом, атопическим дерматитом или ограниченной склеродермией.

3. Определить возможности использования ротовой жидкости для неинвазив-ной диагностики метаболических нарушений при сахарном диабете 2 типа и изучаемых коморбидных состояниях и предложить оптимальный алгоритм соответствующих биохимических исследований.

4. Разработать высокоинформативный биохимический способ лабораторной диагностики состояния прооксидантно-антиоксидантной системы у больных, в том числе с сочетанными формами изученных заболеваний.

5. Экспериментально обосновать возможности коррекции метаболических нарушений, развивающихся у больных сахарным диабетом, с использованием средств антиоксидантной направленности с различными механизмами действия.

Научная новизна:

6. Впервые изучены особенности интенсификации свободнорадикальных процессов и степени эндогенной интоксикации на системном уровне (в крови) и на местном уровне (в ротовой жидкости) у больных с сочетанным течением сахарного диабета 2 типа с псориазом, атопическим дерматитом или ограниченной склеродермией.

7. Впервые проведено комплексное исследование особенностей функционирования ферментного и неферментного звеньев антиоксидантной системы крови и ротовой жидкости у больных сахарным диабетом 2 типа, дерматологическими заболеваниями, а также при их коморбидном течении.

3. Показаны перспективы использования ротовой жидкости в лабораторной диагностике метаболических нарушений при сахарном диабете, дерматологических заболеваниях и их сочетанном течении.

4. Разработан информативный способ определения резистентности организма к действию прооксидантных факторов на основе оценки функционального состояния тиолового звена антиоксидантной системы плазмы крови (патент РФ № 2629391).

5. Экспериментально обоснована возможность использования средств прямой (кверцетин, восстановленный глутатион и биологически активная добавка с комплексным антиоксидантным составом) и косвенной (дихлорацетат натрия и вода со сниженным содержанием дейтерия) антиоксидантной направленности для коррекции метаболических нарушений, развивающихся при сахарном диабете, что открывает перспективы дальнейших клинических исследований.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Теоретическая значимость работы заключается в выявлении особенностей углеводного и липидного обменов, функционирования прооксидантно-антиоксидантной системы, функциональной системы детоксикации в условиях сочетанного течения сахарного диабета 2 типа с дерматологическими заболеваниями. Результаты исследований способствуют расширению представлений о роли в патогенезе сахарного диабета 2 типа, псориаза, атопического дерматита, очаговой склеродермии и их коморбидных вариантах дисбаланса в прооксидантно-антиоксидантной системе и развития окислительного стресса, а также теоретическому обоснованию целесообразности использования средств анти-оксидантной направленности у данных категорий больных.

Практическая значимость исследования заключается в выявлении эффектов изученных средств метаболической коррекции антиоксидантной направленности (глутати-он, кверцетин, биологически активная добавка с комплексным антиоксидантным составом, вода со сниженным содержанием дейтерия и дихлорацетат натрия) на состояние окислительного метаболизма у исследованных категорий больных, а также в определении рекомендации по дальнейшим экспериментальным и клиническим исследованиям данных препаратов. Разработан способ оценки резистентности организма к действию прооксидантных факторов на основе изучения тиолового звена антиоксидантной системы (патент РФ № 2629391). Доказана возможность использования ротовой жидкости с целью лабораторной диагностики и прогнозирования течения изученных заболеваний.

Методология и методы исследования. Сбор данных и обработка полученных результатов проводились соответственно разработанной диссертантом схеме исследования, в котором были использованы адекватные поставленным задачам современные биохимические, биофизические, экспериментальные, лабораторные и статистические методы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что у больных сахарным диабетом 2 типа, псориазом, атопиче-ским дерматитом, ограниченной склеродермией и при коморбидном течении изученных заболеваний имеют место характерные изменения углеводного и липидного обменов, эндогенной интоксикации, а также нарушения в функционировании проокси-дантно-антиоксидантной системы на местном и системном уровнях.

2. Показана целесообразность определения активности супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, уровня общей антиоксидантной активности и показателей хе-милюминесценции в ротовой жидкости для оценки степени выраженности окислительных нарушений у больных изученных групп.

3. Предложенный способ оценки резистентности организма к воздействию прооксидантных факторов может быть использован в диагностике заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом (патент РФ № 2629391).

4. Показана эффективность использования средств антиоксидантной направленности (глутатион, кверцетин, биологически активная добавка с комплексным антиокси-дантным составом, вода со сниженным содержанием дейтерия и дихлорацетат натрия) для коррекции метаболических нарушений при экспериментальном сахарном диабете.

Степень достоверности и апробации работы. При выполнении работы использованы современные, информативные и адекватные задачам методы исследования. Полученный и анализируемый материал включает достаточное количество лабораторных исследований изученных групп больных, включая контрольную группу, а также данные групп сравнения (185 образцов крови и 185 образцов ротовой жидкости), исследований лабораторных животных (105 белых нелинейных крыс-самцов). Достоверность подтверждается также непосредственным участием соискателя в выполнении лабораторных исследований и проведении экспериментов на лабораторных животных, обработки полученных результатов. Результаты исследования обработаны статистически с использованием системы статистического анализа R (R Development Core Team, Австрия, 2008).

Диссертация выполнена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации (от 28.01.2015 г. ч. 1, раздел 1) «Осуществление прикладных научных исследований, в том числе проведение доклинических исследований лекарственных средств и клинических исследований лекарственных препаратов» и в рамках комплексной темы НИР кафедры фундаментальной и клинической биохимии номер государственной регистрации 01201263445 («Изучение молекулярных аспектов нарушений регуляторных механизмов пищеварительных и окислительных процессов в организме, поиск способов их метаболической коррекции») в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России.

Результаты выполненной диссертационной работы были доложены и обсуждены на конференции Allergy, Astma & Immunophysiology: Resent Advances in Understanding and Management (Singapore, 2015), XIII научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России «Медицинская наука и здравоохранение» (Краснодар, 2015), Международном конгрессе «Инновационные технологии в иммунологии и аллергологии» (Москва, 2015), IX Всемирном конгрессе по аллергии, астме и ХОБЛ, X съезд аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2016), XXIII Всемирном конгрессе по клинической медицине и иммунореабилитации (Нью-Йорк, США, 2016), XIV научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России «Медицинская наука и здравоохранение» (Краснодар, 2016), конференции Allergy, Asthma & Immuno-physiology: innovative technologies, Filodiritto International Proceedings (Bologna, Italy, 2016), V Съезде физиологов СНГ, V Съезда биохимиков России (Дагомыс, 2016), конференции Allergy, Asthma, COPD, Immunophysiology & Norehabilitology: innovative technologies, Filodiritto International Proceedings (Bologna, Italy, 2017).

Внедрение результатов исследования. Материалы диссертационного исследования были внедрены в учебный процесс кафедры фундаментальной и клинической биохимии ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России. Основные результаты диссертации внедрены в лабораторную практику ЦНИЛ ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России, а также в лечебно-диагностический процесс эндокринологического отделения ГБУЗ ККБ № 2 г. Краснодара и стационарного отделения ГБУЗ ККВД г. Краснодара.

Публикации. Всего по материалам диссертационной работы опубликовано 17 научных работ, из которых 12 – в журналах, включенных в Перечень рецензируемых научных изданий или входящих в международные реферативные базы данных и системы цитирования, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук и издания, приравненные к ним, в том числе получен патент.

Личный вклад автора в исследование. Диссертантом была проведена разработка дизайна исследования (90 %), проведен поиск и обзор отечественных и зарубежных источников литературы (92 %), лично выполнены все лабораторные исследования, проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов (95 %). Соискатель принимал непосредственное участие в формулировании выводов и формулировании научных положений, предложений для внедрения, разработке практических рекомендаций (88 %), написании статей (74 %) и тезисов (80 %), подготовил текст и иллюстративный материал для диссертации (97 %).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения и списка литературы, иллюстрирована 12 таблицами и 17 рисунками. Указатель литературы содержит 112 источников, из которых 33 отечественных и 79 зарубежных авторов.

Неферментное гликирование белков и окислительный стресс

Эндотелий кровеносных сосудов представляет собой барьер между кровью и тканями. Этот метаболически активный монослойный орган подвергается воздействию различных биомеханических и биохимических факторов, на которые он реагирует, сохраняя целостность и гомеостаз сосудистой стенки и ее функции. В эндотелиальных клетках, основными источниками супероксидных анион-радикалов являются НАДФН-оксидазы, ксантиноксидазы, циклооксигеназы, митохондрии, за счет утечки электронов из дыхательной цепи и при определенных условиях, эндотелиальные NO-синтазы (NOS) (рисунок 1.1) [A.C. Montezano, R.M. Touyz, 2012]. Активность НАДФН-оксидаз повышается в эндотелиальных и гладкомышечных клетках при стимуляции ангиотензином II, что указывает на то, что в присутствии активированной ренин-ангиотензин-альдостероновой системы усиливается дисфункция, связанная с повышенным образованием свободных радикалов в сосудах [C. Richard et al., 2008]. Другим источником АФК является ксантиноксидаза, которая катализирует последовательное гидроксилирование гипоксантина с образованием ксантина и мочевой кислоты. Митохондрии являются основным источником продуцирования АФК в клетке, и их гиперпродукция, вероятно, является одним из ведущих патогенетических звеньев при многих заболеваниях, включая сахарный диабет. Поврежденные митохондрии продуцируют больше АФК (усиливают окислительный стресс) и меньше АТФ (гипоэнергетическое состояние), чем нормальные митохондрии. Поскольку они повреждены, они не могут полноценно окислять глюкозу или жирные кислоты, и не могут обеспечить клетку адекватным количеством АТФ. Глюкоза, аминокислоты и липиды в таком случае будут накапливаться за пределами митохондрий, и в большей степени будут подвергаться гликированию, в свою очередь усиливающем генерацию свободных радикалов. Формируется порочный круг между повреждениями митохондрий, неферментным гликированием и окислительным стрессом [A.L. Wang et al., 2007].

При патологических состояниях окислительный стресс в митохондриях, может способствовать усиленному перекисному окислению липидов, повреждению клеточных мембран и ДНК, тем самым активируя каскад процессов, которые еще более усугубляют тяжесть заболевания. Помимо утечки в цепи переноса электронов, митохондрии также генерируют H2O2 с помощью моноаминоксидазы (МАО), связанной с внешней мембраной. MAO – фермент, ответственный за метаболизм биогенных аминов и являющийся существенным источником H2O2 и причиной окислительного стресса при сердечно-сосудистых заболеваниях и сахарном диабете [S.F. Nunes et al., 2011]. В физиологических условиях продуцирование перексида водорода, по разным оценкам, составляет около 2 % от общего количества потребляемого организмом кислорода.

Основной АФА является оксид азота (NO), синтезируемый эндотелием. Это полноценный газовый медиатор, являющийся ключевым детерминантом эндотелиальной функции, продуцируемый эндотелиальной NO-синтазой (eNOS). Обладает мощным сосудорасширяющим, противовоспалительным и антитромботическим действием [Z. Xia, P.M. Vanhoutte, 2011; M. Feletou et al., 2012]. В физиологических условиях в присутствии достаточного количества субстрата (L-аргинина) и кофактора (тетрагидробиоптерин или Н4-БП) eNOS продуцирует NO, но в условиях низкой биодоступности Н4-БП для NOS она может вырабатывать супероксид анион-радикал вместо NO [A.C. Montezano, R.M. Touyz, 2012]. Также продукция NO может быть снижена за счет ингибирования активного центра фермента гуанидинозамещенными аналогами L-аргинина, такими как асимметричный диметиларгинин (АДМА), встречающаяся в природе аминокислота. Уровни АДМА у людей и лабораторных животных в большинстве исследований варьируют от 0,3 до 0,5 ммоль/л. У больных диабетом 1 или 2 типа уровень АДМА в плазме существенно повышен и является одним из самых ранних признаков сосудистой дисфункции и инсулинорезистентности при диабете 2 типа [J.H. Lee et al., 2011; C. Korandji et al., 2011].

Свободный радикал NO имеет период полураспада всего лишь несколько секунд в водном окружении. NO реагирует с молекулярным кислородом и АФК с образованием продуктов окисления, включая другие формы АФА. Одна из наиболее изученных реакций представляет собой взаимодействие NO с супероксидом с образованием пероксинитрита: ONOO-. Последний сам быстро окисляется, а при протонировании претерпевает гомолитическое расщепление с образованием гидроксильного радикала (ОН) и диоксида азота (NO2).

Действие на организм животных свободных радикалов привело организмов к формированию защитных антиоксидантных механизмов. Антиоксидант, присутствуя в очень низких концентрациях по сравнению с окисляемыми субстратами, значительно замедляет или ингибирует его окисление. Механизмы защиты от индуцируемого свободными радикалами окислительного стресса включают: (а) превентивные механизмы, (б) механизмы восстановления и (в) антиоксидантную защиту. Ферментативная антиокислительная защита включает супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО), каталазы (КАТ) и другие ферменты, такие как пероксиредоксины, тиоредоксины, металлотионеины [И.И. Павлюченко и соавт., 2004]. Неферментативные антиоксиданты представлены витаминами (аскорбиновая кислота, токоферол, каротиноиды, биофлавоноиды) и другими прямыми (глутатион, липоевая кислота, и другие тиолсодержащие соединения) и непрямыми (хелаторы металлов с переменной валентностью, фармакологические препараты) антиоксидантами. В организме избыток или недостаток ионов металлов может способствовать нарушениям функционирования белков, препятствовать формированию правильной структуры белка или, в случае ионов железа или меди, способствовать оксидативному стрессу [L. Rochette et al., 2011]. Участие ионов металлов в окислительных нарушениях, в том числе при сахарном диабете делает их мишенью для терапевтических вмешательств. В нормальных условиях существует баланс между генерацией АФК и активностью системы антиоксидантной защиты. Окислительный стресс часто определяется как дисбаланс между прооксидантами и антиоксидантами, которые могут быть количественно определены в крови как редокс-состояние глутатиона в виде его окисленной и восстановленной форм [D.P. Jones, Y.M. Go, 2010; J.R. Roede et al., 2012]. Существует два типа последствий окислительного стресса: положительный (стимуляция клеточной пролиферации) или разрушительный для клетки (апоптоз или некроз в случае больших количеств радикалов и реактивных молекул). Окислительный стресс у больных диабетом 2 типа является следствием нарушений нескольких патобиохимических звеньев, включая гипергликемию, инсулинорезистентность, воспаление и дислипидемию.

Лабораторные методы исследования показателей белкового обмена

С целью оценки состояния углеводного обмена в плазме венозной крови исследуемых лиц и лабораторных животных проводили определение концентрации глюкозы энзиматическим колориметрическим методом, с помощью наборов реагентов («Витал Девелопмент Корпорэйшн», Санкт-Петербург, Россия). Способ основан на образовании пероксида водорода при окислении глюкозы биожидкости под действием глюкозооксидазы. Образующийся пероксид водорода под действием пероксидазы окисляет хромогенные субстраты с появлением окрашенных продуктов. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию глюкозы. Для осуществления метода к 2,0 мл рабочего реагента, содержащего пероксидазу, глюкозооксидазу и фенол в фосфатном буферном растворе рН = 7,5, добавляли 10 мкл плазмы крови, полученной из крови, стабилизированной фторидом натрия, для подавления гликолиза в эритроцитах. Тщательно перемешивали, инкубировали в течение 10 минут в термостате при 37 С, после чего фотометрировали при длине волны 510 нм и длине оптического пути 10 мм, против холостой пробы, содержащей вместо биожидкости 10 мкл бидистиллированной воды. Аналогично проводилось определение оптической плотности калибровочной пробы, только вместо биожидкости в нее вносилось 10 мкл калибратора, содержащего глюкозу в концентрации 10 ммоль/л.

Концентрацию глюкозы в исследуемой плазме крови (С) определяли по формуле: С (ммоль/л) = (Dоп/Dкал)10, где Dоп – оптическая плотность опытной пробы, содержащей плазму крови; Dкал – оптическая плотность калибровочной пробы.

Для оценки состояния белкового обмена, а также в качестве вспомогательного метода, для расчета некоторых лабораторных показателей плазмы крови в пересчете на грамм белка, проводили определение концентрации общего белка в плазме крови испытуемых людей и лабораторных животных. Используемый метод определения белка был основан на регистрации поглощения белковым раствором ультрафиолетового света [В.С. Камышников, 2004]. Для осуществления данного метода плазму крови предварительно разбавляли в 100 раз дистиллированной водой, а затем измеряли оптическую плотность полученного раствора при 260 нм и 280 нм на спектрофотометре при длине оптического пути 10 мм. Расчет концентрации общего белка проводили по формуле:

Б (г/л) = (1,45D280 – 0,74 D260)100, где Б (г/л) – концентрация общего белка; D280 – оптическая плотность раствора при 280 нм; D260 – оптическая плотность раствора при 260 нм; 1,45 и 0,74 – расчетные коэффициенты, 100 – разбавление плазмы крови. Определение концентрации общего белка в РЖ проводили по тому же принципу, но ввиду меньшего его содержания, использовали разбавление 1 : 10.

С целью оценки обмена липидов в плазме крови больных и лабораторных животных определяли концентрации общего холестерола (ОХС), холестерола липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), холестерола липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и триглицеридов (ТГ). Определение концентрации общего холестерола в плазме крови. Определение концентрации общего холестерола в плазме крови осуществляли по энзиматическому колориметрическому методу, с помощью наборов реагентов («Витал Девелопмент Корпорэйшн», Санкт-Петербург, Россия). Способ основан на взаимодействии холестерола с кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием пероксида водорода. Пероксид водорода под действием перокисдазы окисляет хромогенные вещества с образованием окрашенных веществ, интенсивность окраски которых пропорциональна содержанию холестерола в исследуемом образце биожидкости.

Для выполнения методики добавляли 20 мкл свежей плазмы крови к 2,0 мл рабочего реагента, содержащего холестеролэстеразу, холестеролоксидазу, пероксидазу, 4-аминоантипирин в фосфатном буферном растворе с фенолом. Тщательно перемешивали пробу, инкубировали в течение 5 минут при 37 С в термостате. Выводили на ноль спектрофотометр по холостому раствору, содержащему 20 мкл дистиллированной воды, вместо биожидкости. Затем измеряли оптическую плотность раствора в кювете с длиной оптического пути 10 мм и при длине волны 500 нм. Параллельно опытному образцу проводили определение оптической плотности калибровочной пробы, содержащей, вместо исследуемой биожидкости, раствор калибратора, содержащий холестерол в концентрации 5,17 ммоль/л.

Расчет концентрации общего холестерола в исследуемой плазме крови (С) проводили по формуле: С (ммоль/л) = (Dоп/Dкал)5,17, где Dоп – оптическая плотность опытной пробы, содержащей плазму крови; Dкал – оптическая плотность калибровочной пробы. Определение концентрации холестерола липопротеинов высокой плотности в плазме крови.

Определение содержания липопротеинов высокой плотности в плазме крови определяли по методу, предусматривающему предварительное осаждение хиломикронов, липопротеинов очень низкой и низкой плотностей с помощью фосфорновольфрамовой кислоты и ионов Mg2+, с последующим определением оставшегося в растворе холестерола липопротеинов высокой плотности по энзиматическому колориметрическому методу, с помощью наборов реагентов («Витал Девелопмент Корпорэйшн», Санкт-Петербург, Россия). На первой стадии выполнения эксперимента – преципитации – к 150 мкл плазмы крови, калибратора или дистиллированной воды добавляли 300 мкл осаждающего реагента, содержащего 0,55 ммоль/л фосфорновольфрамовой кислоты и 25 ммоль/л магния хлорида. Тщательно перемешивали и через 10 минут центрифугировали в течение 15 минут при 2600 g. В супернатанте определяли концентрацию холестерола. Для этого 200 мкл супернатанта добавляли к 2,0 мл рабочего реагента, содержащего холестеролэстеразу, холестеролоксидазу, пероксидазу, 4-аминоантипирин в фосфатном буферном растворе с фенолом. Параллельно по той же схеме ставили калибровочную и холостую пробы. Инкубировали полученные реакционные смеси в течение 10 минут в термостате при 37 С, затем измеряли оптическую плотность опытной и калибровочной проб против холостой при длине оптического пути 10 мм и длине волны 500 нм на спектрофотометре.

Состояние функционирования антиоксидантной системы крови и ротовой жидкости больных с эндокринными, дерматологическими и сочетанными нарушениями

Активность ГПО в РЖ, как и в эритроцитах крови, была ниже контрольных значений, тогда, как ГР в некоторых группах превышала (3, 4 и 5), в других (2, 6, 7 и 8) была наоборот меньше аналогичного показателя 1-й группы. Во второй группе были определены сниженные активности ГПО на 21,6 % и ГР – на 23,1 % в сравнении с группой 1. У больных псориазом ГПО не существенно не отличалась от значений 1-й группы, а активность ГР превышала их в 3,6 раза (р 0,05). В РЖ 4-й группы активность ГПО была значительно ниже – в 2,6 раза, а активность ГР наоборот превышала показатель контроля в 1,6 раза (р 0,05). В группе, представленной больными склеродермией, активность ГПО была зафиксирована на 29 % ниже значения показателя 1-й группы, а ГР оставалась на уровне контрольных цифр. Группы с сочетанными заболеваниями характеризовались сниженными значениями активности ГПО и ГР в РЖ. В 6-й группе активность ГПО статистически значимо не изменялась, а ГР была ниже показателя контрольной группы на 33,6 %. В группе 7 активность и ГПО и ГР на 18,9 % и 19,3 % соответственно были ниже контрольных значений. В группе 8 активность ГПО и ГР также были ниже значений показателей 1-й группы на 15,5 % и 16,0 % соответственно.

Состояние активности ферментов антиоксидантной системы может говорить о стадии процесса, степени его тяжести, фазе компенсации или декомпенсации. Как правило, на первых этапах развития патологического процесса АОС справляется с интенсификацией образования прооксидатных факторов, что отражается в увеличении активности защитных ферментных систем и поддержанием концентрации низкомолекулярных восстановительных эквивалентов на уровне близком норме. Эту фазу можно описать, как фазу компенсации. При дальнейшем прогрессировании заболевания обычно происходит срыв компенсаторных возможностей систем неспецифической резистентности организма, в том числе АОС, что сопровождается снижением активности ферментов ниже уровня нормы. Таким образом, обсуждение полученных результатов лабораторных исследований состояния прооксидантно-антиоксидантной системы нередко бывает затруднена и для получения объективных данных необходимо, обрабатывать биохимический профиль биожидкости, включающий несколько параметров, отражающих состояние разных звеньев этой системы. Так, например, в группе 4 активность ГР была выше этого показателя контрольной группы в 1,6 раза и составляла в среднем 24,16 мкмоль/(лмин). Если сравнивать данный показатель с активностью того же фермента в группе 2 (11,67 мкмоль/(лмин)) и группе 3 (53,88 мкмоль/(лмин)) возникает проблема с дифференцировкой стадии развития патологического процесса в группе 4. Этот показатель может отражать только нарастание активности ГР в фазе компенсации или уже снижение его на начальных этапах декомпенсации. Решить эту проблему можно либо путем изучения биохимических профилей, как указано выше, либо изучением процесса в динамике.

Расчет соотношения КАТ/СОД в РЖ выявил отличные от крови результаты (рисунок 3.3).

Соотношение активности каталазы и супероксиддисмутазы в ротовой жидкости больных сахарным диабетом 2 типа, дерматологическими заболеваниями и при их сочетанном течении (Me) Примечание: – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 1; – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 2; # – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 3; – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 4; – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 5. Обозначения групп такие же, как в примечании к рисунку 3.1.

В двух случаях – группы 2 и 4 этот показатель был выше в 1,2 и 1,8 раз по сравнению с контрольной группой (р 0,05). В группе 6 КАТ/СОД не отличалось от значения группы 1. А в группах 3, 5, 7 и 8 данное соотношение было снижено, составляя в группе 3 – 0,74 отн. ед., в группе 5 – 0,45 отн. ед., а в группах 7 и 8 – 0,88 отн. ед. Низкие значения этого соотношения могут сказаться на адекватности утилизации образующегося в избытке пероксида водорода и часто происходит в период активного прогрессирования заболевания.

Содержание восстановленного глутатиона – одного из основных компонентов низкомолекулярного звена АОС, участвующего кроме того в таких процессах в организме, как детоксикация, иммунный ответ и других метаболических системах, хорошо отражает состояние неспецифической резистентности организма. Глутатион – тиолсодержащий трипептид, который в организме существует в окисленной и восстановленной формах, причем последней в клетках в несколько раз больше. За счет легкости перехода из одной формы в другую и развитой системы ферментов его метаболизма, GSH участвует в поддержании клеточного редокс-гомеостаза.

При исследовании концентрации восстановленной формы глутатиона в эритроцитарной взвеси было определено, что во 2-й группе его содержание было ниже контрольных значений на 17,2 % (р 0,05), в группах 3–5 статистически значимых изменений отмечено не было, а в группах 6–8 концентрация GSH в эритроцитах была ниже на 16,0–20,3 % по сравнению с аналогичным показателем 1-й группы (р 0,05) (рисунок 3.4).

Для оценки неферментного звена АОС плазмы крови определяли содержание общих тиоловых групп, а также рассчитывали отдельно содержание быстрорегагирующих (легкодоступных, SHл) и медленно реагирующих (труднодоступных, SHт) SH-групп (таблица 3.4). Сравнение содержания общих суммарных тиоловых групп в основных группах с показателем контрольной группы показало относительно невысокую информативность этого теста. Сниженные значения этого показателя были отмечены в группе 2 – на 18,9 %, в группе 5 – на 24,5 %, в группе 6 и 7 –на 15,1 % и в группе 8 – на 17,0 % по сравнению с контрольной группой. В группах 3 и 4 статистически значимых отличий от контроля определено не Рисунок 3.4 – Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах больных сахарным диабетом 2 типа, дерматологическими заболеваниями и при их сочетанном течении (min; Q1;Me;Q3;max) Примечание: – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 1; – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 2; # – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 3; – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 4; – статистически значимые отличия (р 0,05) от показателя группы 5. Обозначения групп такие же, как в примечании к рисунку 3.1.

было. Следует отметить, что, исходя из полученных данных, трудно дифференцировать тяжесть изученных болезней, поскольку различия были незначительные или совсем отсутствовали. Для повышения информативности исследования тиолового звена АОС плазмы крови было предложено рассчитать отдельно содержание легкодоступных, реагирующих в первые три минуты, и труднодоступных, реагирующих с 3 по 30 минуты SH-групп, а также оценить их соотношение в разных группах. В результате была установлена тенденция – снижение при развитии патологического процесса фракции труднодоступных тиоловых групп, даже при сохранении уровня суммарных SH-групп на уровне контрольной группы. Так, в группе 2 содержание SHл оставалось на уровне группы 1, а содержание SHт было меньше контроля на 20,5 % (р 0,05).

Интенсивность свободнорадикальных процессов в крови у крыс с экспериментальным сахарным диабетом и при его коррекции антиоксидантными средствами

Результаты проведенных исследований демонстрируют возможность коррекции метаболических нарушений при развитии СД с помощью средств прямой или косвенной антиоксидантной направленности. Однако следует с осторожностью сравнивать действие тех или иных веществ друг с другом, так как очевидно, что ряд используемых препаратов обладал гипогликемическим действием, тогда как некоторые предотвращали развитие самого СД, защищая клетки островков Лангерганса поджелудочной железы от поражения аллоксаном. ДХА, активируя энергетический метаболизм, сам обладает достаточно выраженным гипогликемическим эффектом. Использование питьевого рациона с пониженным содержанием дейтерия характеризуется возникновением в организме изотопного градиента, приводящего к изменению метаболической активности на клеточном и субклеточном уровнях [H.W. Kreuzer-Martin et al., 2006; X. Xie, R.A. Zubarev, 2015; С.С. Джимак и соавт., 2016; L.G. Boros et al., 2016]. Прослеживается низкая вариабельность (в пределах 1–2 % от среднего значения) колебаний концентрации дейтерия в крови, как и в других биологически активных жидкостях, органах и тканях по данным ряда авторов [М.И. Быков и соавт., 2015; S.S. Dzhimak et al., 2015; С.С. Джимак и соавт., 2016]. Данное явление, по их мнению, может свидетельствовать о существовании в организме изотопного градиента, изменения которого отражаются в функционировании метаболических систем, что является основой для исследований воды со сниженным содержанием дейтерия, как лечебно-профилактического нутриционного фактора [М.Г. Барышев и соавт., 2011; S.S. Dzhimak et al., 2014]. Кроме того, вода со сниженным содержанием дейтерия, вероятно, действует и как слабоинтенсивный стрессовый фактор, подготавливая организм к действию более сильного повреждающего агента [D.S. vila et al., 2012; A.A. Basov et al., 2013; S.S. Dzhimak et al., 2015]. Также механизмом, объясняющим гипогликемические и антиатерогенные эффекты воды со сниженным содержанием дейтерия, по данным ряда авторов является влияние низких концентраций дейтерия на внутриклеточный обмен моносахаридов и липидов [R. Rehakova et al., 2016], в том числе за счет повышения функциональной активности митохондриальной цепи переноса электронов, что способно изменять скорость глюконеогенеза и окисления жирных кислот [L.G. Boros et al., 2016].

Достоверно отличался от значений группы сравнения ряд данных, полученных при коррекции нарушений с помощью кверцетина и биологически активной добавки (EAN: 5907529461563) с комплексным антиоксидантным составом и большим содержанием каротиноидов. Введение первого оказывало выраженное гипогликемическое действие (на 47 % ниже показателя группы сранвения, р 0,05), в то время, как биодобавка не вызывала такого эффекта. Более того, согласно полученным данным, применение биодобавки не способствовало нормализации ни одного из исследуемых показателей, кроме небольшого снижения индекса атерогенности (на 16,5 %, р 0,05). Естественно следует учитывать способ введения, и, следовательно, биодоступность, хотя биодобавку вводили в рацион питания крыс значительно раньше, принимая во внимание возможную длительность развития эффекта. Способ введения мог также повлиять на химический состав парафармацевтика, учитывая его жидкий липофильный состав, приходилось вскрывать капсулу и вносить небольшие количества вместе с кормом животным, поэтому контакт компонентов биодобавки с кислородом воздуха был неизбежен и достаточно длителен. Учитывая, что данное средство позиционируется, как добавка с высоким содержанием каротиноидов (10 мг лютеина и 500 мкг зеаксантина в 1 капсуле), но также содержит другие компоненты, например жирные кислоты, которые могут легко и необратимо окисляться с образованием продуктов, оказывающих уже прооксидантное действие, что может объяснить негативные эффекты. Глутатион и кверцетин в растворенном виде имели значительно меньший контакт с кислородом, кроме того их окисленные продукты могут легко регенерировать в организме. Также более высокая эффективность кверцетина могла быть связана с более выраженными антиоксидантными свойствами биофлавоноидов по данным ряда авторов [Y. Sun et al., 2017], а также с несколько большей растворимостью в воде, при выраженных липофильных свойствах, позволяющих эффективно проникать внутрь клеток, но и более равномерно распределяться в организме, а не преимущественно в печени и жировой ткани. Достаточно эффективным оказалось применение воды со сниженным содержанием дейтерия, так кроме гипогликемического эффекта установлен также гиполипидемический, показатели АОС были близки к норме, а также наблюдался самый низкий уровень эндогенной интоксикации, среди всех исследуемых способов коррекции. Можно было бы ожидать, что введение восстановленного глутатиона крысам с СД даст значительный эффект, однако содержание глюкозы в данной группе было не ниже группы сравнения, но по данным показателей липидного обмена, антиоксидантной системы и эндогенной интоксикации состояние метаболизма крыс этой группы было существенно лучше, несмотря на гипергликемию. Таким образом, глутатион сам не обладал гипогликемическим эффектом и не предохранял -клетки от повреждения аллоксаном, но активно участвовал в метаболических процессах в организме и способствовал нормализации липидного профиля, показателей АОС и системы детоксикации. Что вероятнее всего влияет на прогноз заболевания и может быть особенно эффективно в сочетании с гипогликемической терапией [М.В. Шестакова и соавт., 2011].

Таким образом, представленные экспериментальные данные подтверждают актуальность применения в комплексной терапии СД веществ с антиоксидантными свойствами прямого и косвенного механизма действия. Перспективным является использование воды со сниженным содержанием дейтерия и дихлорацетата натрия при комплексной коррекции патологических состояний, сопровождающихся гипергликемией, дислипидемией, окислительным стрессом и эндогенной интоксикацией, что указывает на целесообразность дальнейших подробных исследований механизмов изменения неспецифической резистентности организма при пролонгированном их назначении. Длительное применение ДХА ограничено его побочными эффектами, однако учитывая необходимость введения его на фоне основной терапии и возможности снижения частоты и выраженности нежелательных эффектов путем применения препаратов тиамина и липоевой кислоты, дальнейшее изучение данного вещества может оказаться целесообразным. Кверцетин и глутатион также заслуживают внимания, а учитывая гипогликемический эффект первого и метаболические эффекты глутатиона, направленные на поддержание функционирования системы неспецифической резистентности организма, следует учесть перспективность комбинированного применения двух этих антиоксидантов.