Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1.Влияние стрессовых факторов окружающей среды на растения 11
1.2.Причины и последствия влияния засоления на растения 15
1.3. Устойчивость к температурным стрессовым факторам 22
1.4.Окислительный стресс в растениях 28
1.5.Компоненты системы защиты от окислительного стресса 35
1.6.Кросс-адаптация растений при действии стрессоров 46
1.7.Клеточная селекция на устойчивость растений при стрессе 48
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть
Объекты исследований
2.1.Краткая характеристика картофеля 54
2.2.Оптимальные условия для произрастания картофеля 58
Методы исследований
2.3.Микроразмножение и поддержание клонов картофеля in vitro 60
2.4. Скрининг in vitro в условиях солевого стресса 61
2.5.Микроклубнеобразование в условиях солевого стресса in vitro 61
2.6.Окислительный стресс 62
2.7.Определение содержания хлорофилла 62
2.8.Определение водного дефицита в листьях картофеля 62
2.9.Определение фотосинтеза 63
2.10.Определение относительного содержания воды 63
2.11.Биохимические методы исследования з
2. І6.Полевые опыты 70
2.17.Статистическая обработка данных 70
ГЛАВА 3. Селекция растений картофеля на устойчивость к солевому стрессу и высокой температуре
3.1.Разработка скрининг-метода на устойчивость к засолению различных генотипов картофеля in vitro 71
3.2. Оценка устойчивости гибридов картофеля в полевых условиях 82
З.3.Получение температуроустойчивых линий картофеля 90
ГЛАВА 4. Особенности клубнеобразования у различных по устойчивости к стрессам генотипов картофеля
4.1.Инициация клубнеобразования in vitro 104
4.2.Синтез белков в процессе клубнеобразования in vitro 110
4.3. Содержание фотосинтетических пигментов у контрастных генотипов картофеля в процессе клубнеобразования in vitro 114
ГЛАВА 5. Биохимические механизмы устойчивости к стрессовым факторам среды
5.1.Изучение РБФКО, как модельного белка при действии высокой температуры 128
5.2.Синтез субъединиц РБФКО в условиях температурного шока 139
5.3.Действие окислительного стресса на контрастные по устойчивости генотипы картофеля при засолении 143
5.4. Активность СОД в различных компартментах клетки у контрастных клон-гибридов картофеля 153
5.5.Равновесие системы прооксиданты-антиоксиданты у контрастных
к солевому стрессу клон-гибридов картофеля 156
5.6.Содержание пролина у контрастных генотипов картофеля 160
ГЛАВА 6. Особенности функционирования механизмов устойчивости в условиях водного дефицита
6.1.Водный режим солеустойчивых генотипов картофеля 166
6.2.Водоудерживающая способность контрастных генотипов картофеля 170
6.3.Регуляция фитогормонами водоудерживающей способности растений картофеля 173 6.4.Водный режим температуроустойчивых генотипов картофеля 177
6.5.Содержание свободного пролина в условиях водного стресса 179
6.6.Действие водного стресса на содержание полирибосом растений-регенерантов картофеля 183
ГЛАВА 7. Прикладные аспекты исследования
7.1.Характеристика и оценка эффективности выращивания новых устойчивых сортов картофеля 191
Заключение 206
Выводы 209
Список использованной литературы
- Устойчивость к температурным стрессовым факторам
- Скрининг in vitro в условиях солевого стресса
- Оценка устойчивости гибридов картофеля в полевых условиях
- Содержание фотосинтетических пигментов у контрастных генотипов картофеля в процессе клубнеобразования in vitro
Введение к работе
Актуальность исследования. Повышение урожая сельскохозяйственных культур зависит от устойчивости сортов и гибридов к действию экстремальных факторов среды, таких как высокая температура, засуха и засоление почв. Особенно остро стоит проблема устойчивости растений к абиотическим факторам в странах с резким континентальным климатом.
Таджикистан является страной, расположенной на границе субтропического и умеренного климатических поясов. Для большей части региона характерны холодная зима и жаркое сухое лето, а также высокий уровень засоления земель, что обуславливает получение низких урожаев и ведет к ограничению ведения сельскохозяйственного производства.
Температурный стресс, засуха, засоление почв и дефицит воды приводят к значительным морфологическим, физиологическим, биохимическим и молекулярным изменениям в клетках растений, которые могут негативно влиять на продуктивность и в целом на производство сельскохозяйственной продукции [Войников и др., 1991; Аббасова и др., 1993; Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006; Dajic, 2006].
Картофель – одна из приоритетных продовольственных культур в Республике Таджикистан, занимающая второе место после пшеницы. В течение последних лет потребление картофеля в стране резко возросло, а низкая урожайность картофеля в большинстве регионов не может удовлетворить спрос населения. Особо следует подчеркнуть низкую урожайность картофеля в связи с отсутствием высокопродуктивных сортов, адаптированных к местным условиям с точки зрения устойчивости к различным абиотическим стрессам.
Получение сортов картофеля устойчивых к стрессам поможет решить проблему нехватки продовольствия. Показано, что сорта картофеля устойчивые к высоким температурам, засухе и засолению почв могут повысить урожайность данной культуры на 20-30% [Алиев и др., 2007; Партоев, 2013].
Получение растений с повышенными признаками устойчивости к экстремальным факторам среды и обладающих высокой продуктивностью связано с исследованием физиологических и биохимических механизмов стресс-толерантности, с ролью фотосинтетического аппарата и прежде всего, ключевого фермента рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФКО), а также с работой трансляционной системы в формировании устойчивости в условиях стресса [Давлятназарова, 1997; Алиев, 2012].
Известно, что стресс может провоцировать образование активных форм кислорода (АФК), в связи, с чем немаловажную роль играет изучение ферментов антиокислительной системы защиты и продуктов перекисного окисления липидов [Мерзляк, 1999; Бараненко, 2006; Гарифзянов, 2011; Прадедова, 2011].
Одним из современных подходов в решении данной проблемы является и использование биотехнологических методов, которые, несомненно, имеют ключевое значение для разработки и внедрения новых сортов сельскохозяйственных культур, обладающих, как устойчивостью к стрессам, так и высокой продуктивностью. Особый акцент необходимо делать на отбор клеточных линий, обладающих новыми наследуемыми признаками на уровне клетки, ткани, органа и целого растения. Известно, что клеточные механизмы устойчивости являются сходными для клеток культивируемых in vitro и целых растений, поэтому селекция на клеточном уровне имеет реальную перспективу получения устойчивых к засолению и высокой температуре сортов картофеля [Ларина,1995; Кулаева,1997; Шевелуха, 2003; Балнокин, 2005; Дьякова, 2012; Киёмова, 2013; Алиев, 2014].
Получение высокопродуктивных сортов картофеля, устойчивых к абиотическим факторам окружающей среды с целью создания устойчивой системы семеноводства имеет приоритетное направление для Таджикистана и отражено в: Стратегии Республики Таджикистан в области науки и техники на период 2005-2015гг.; Государственной Программе по развитию картофелеводства на период 2012-2016 гг.
Степень разработанности темы. Устойчивость растений на действия стрессовых факторов окружающей среды является объектом пристального внимания ученых во всем мире. Начало исследований было заложено такими учеными как Н.А Максимов, В.Р. Заленский, П.А.Генкель, Г.Селье., Б.П.Строганов. На современном этапе, большая роль в изучении устойчивости и адаптации растений принадлежит Вл.В. Кузнецову, И.А.Тарчевскому, В.К. Войникову, Н.И. Шивяковой, Ф.М. Шакировой, М.Н. Мерзляк, А.Р.Гарифзянову, I. Fridovich и др. Определенный вклад был внесен и таджикскими учеными Ю.С. Насыровым, Х.Х.Каримовым, К.Алиевым, М.М. Якубовой и др.
Но, тем не менее, комплексный подход, включающий в себя использование биохимических признаков, в сочетании с биотехнологическими
приемами для идентификации генотипов картофеля с высоким потенциалом устойчивости и продуктивности остается открытым.
Цель исследования: Выявление механизмов устойчивости различных генотипов картофеля к действиям абиотических факторов среды и поиск эффективных биохимических маркеров для отбора и получения потенциальных форм и линий сельскохозяйственных культур, обладающих устойчивостью и продуктивностью.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
разработать скрининг - метод для выявления устойчивых к засолению клон-гибридов картофеля in vitro;
получить линии картофеля устойчивые к высокой температуре;
выявить особенности развития устойчивых генотипов in vivo;
выявить особенности синтеза белков у растений картофеля в условиях температурного стресса;
изучить антиоксидантные системы защиты растений картофеля при стрессе;
исследовать особенности функционирования механизмов устойчивости в условиях водного дефицита.
Научная новизна: Показана целесообразность системного подхода использования инновационных методов биотехнологии и достижений фундаментальных исследований в области биохимии для выявления активности эндогенных систем защиты и урожайности сельскохозяйственных растений в условиях климатического стресса. Маркерами могут служить антиоксидантные системы, параметры которых можно использовать как тест-признаки устойчивости и урожайности, особенно при стрессорном воздействии.
Впервые разработан скрининг-метод для отбора различных гибридов картофеля на солеустойчивость in vitro.
Показано, что эффективная работа антиоксидантной защиты у устойчивых генотипов картофеля в условиях засоления коррелирует с ингибированием интенсивности АФК.
Исследование компартментации ферментов антиоксидантной защиты у контрастных по уровню устойчивости к стрессу растений картофеля показало, что у солеустойчивых генотипов меньшее накопление продуктов АФК в большей степени связано с активацией антиоксидантных ферментов, локализованных в хлоропластах, чем в митохондриях и цитоплазме.
Исследования по влиянию циклогексимида на трансляционную систему рибосом различных по устойчивости к засолению генотипов картофеля позволило предположить о существовании предсинтезированного пула СОД у устойчивого генотипа.
Изучение действия высокой температуры на синтез белка в хлоропластах растений картофеля дает возможность использовать термостабильность РБФКО и системы ее трансляции, как показатель устойчивости к температурному фактору.
Установлено, что водный стресс вызывает реорганизацию фермент-мембранных комплексов, сопровождающихся замедлением скорости фермент-субстратных взаимодействий и изменяет направленность ее функции. Показано, что при водном дефиците уменьшается содержание полирибосом, в то время как при его устранении содержание полирибосом восстанавливается до определенного уровня.
Дозированное воздействие температурного стресса на уровне целого растения и каллусных культур различается, и действие температурного шока на уровне неорганизованной пролиферации клеток дает возможность выявить устойчивые к высокой температуре линии картофеля.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты являются предпосылкой для обоснования системы защиты растений от окислительных повреждений в условиях абиотического стресса на примере использования стресс-толерантных растений картофеля. Разработка биохимических маркеров стрессустойчивости на основе функционирования антиоксидантных компонентов имеет важное значение для ускоренного отбора клеток и создания устойчивых и продуктивных сортов.
Разработанный скрининг-метод позволяет провести оценку большого количества клон-гибридов картофеля in vitro на устойчивость к стрессорным факторам за короткий период. В результате исследования получены клон-гибриды картофеля, обладающие устойчивостью и высокой продуктивностью.
В процессе ступенчатого скрининга с использованием каллусных культур получена линия картофеля, устойчивая к высокой температуре (ТУ), которая передана в Государственную комиссию по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур и охране сорта при Министерстве сельского хозяйства Республики Таджикистан.
Получены авторские свидетельства на два новых сорта картофеля «Файзабад» и «Таджикистан». В настоящее время, проходят государственные испытания еще два сорта картофеля.
Основные результаты и подходы исследования могут быть внедрены в производство, применены в учебном процессе в университетах биологического и аграрного профиля при чтении спецкурсов, в том числе включены в соответствующие курсы лекций по физиологии, биохимии и биотехнологии растений.
Основные положения, выносимые на защиту:
структурно-функциональное состояние компонентов клетки растений связано с продукционным процессом, который находится в зависимости от устойчивости к стрессорному фактору;
экспериментальное обоснование использования ступенчатого скрининга in vitro для отбора гибридов картофеля устойчивых к стрессовым факторам и обладающих высокой продуктивностью;
дозированное воздействие высокотемпературного стресса на уровне неорганизованной пролиферации (каллусные культуры) дает возможность выявить резистентные к высокой температуре линии картофеля;
устойчивость к неспецифическому действию температуры у растений, наряду с физиологическими изменениями, сопровождается закреплением некоторых молекулярных механизмов, связанных с активацией системы транскрипции и трансляции, сопровождающейся синтезом специфических белков и повышением их концентрации в клетках;
избирательность специфических биохимических реакций, усиливающихся действием стресса обеспечивается активацией антиоксидантных ферментов и пролина, и определяется особенностями генотипа растений.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 59 работ, 24 из них входят в перечень ВАК Минобрнауки России.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность экспериментальных данных, которые получены на базе современных методов исследования с использованием сертифицированного оборудования подтверждаются достаточной повторностью и воспроизводимостью. В работе представлены данные, полученные лично автором.
Основные положения и выводы диссертации были представлены на: Международном симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности». Москва (Россия), 2004 г.; Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Сыктывкар (Россия), 2007 г.; Международной конференции «Global Potato Conference». Дели (Индия), 2008г.; I международном семинаре «Обеспечение улучшения продовольствия и увеличение доходов в Юго-Западной и Центральной Азии (SWCA) через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическому стрессу». Шимла (Индия), 2008; II международном семинаре «Обеспечение улучшения продовольствия и увеличение доходов в Юго-Западной и Центральной Азии (SWCA) через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическому стрессу». Гуджарат (Индия), 2010 г.; VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва (Россия), 2011 г.; Республиканской научной конференции посвященной 60-летию образования Академии наук Республики Таджикистан «Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане». Душанбе (Таджикистан), 2011 г.;IV международной научной конференции «Экологические особенности биологического разнообразия». Куляб (Таджикистан), 2011 г.; Международной научной конференции памяти академика Ю.С. Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений». Душанбе, 2012г.; Республиканской научной конференции «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов». Душанбе (Таджикистан),2012 г.; V международной конференции «Экологические особенности биологического разнообразия». Худжанд (Таджикистан), 2013 г.; Международном семинаре «Улучшение сортов картофеля и технологий управления водными ресурсами для улучшения эффективности водопользования, устойчивости к внешним воздействиям, рентабельность и производительность мелких земельных хозяйств, предрасположенных к стрессовым условиям Центральной Азии». Ташкент (Узбекистан), 2013 г.; Международной научной конференции «Биология и биотехнология растений». Алматы (Казахстан), 2014; Международной научно-практической конференции, посвященной 24 годовщине Государственной Независимости Республики Таджикистан «Роль отрасли семеноводства в обеспечении продовольственной безопасности». Душанбе (Таджикистан), 2015; IX международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва (Россия), 2015 г.;
Всероссийской (с международным участием) научной конференции «Биологические аспекты распространения, адаптации и устойчивости растений». Саранск, 2016 г.
Структура и объем диссертации. Диссертация написана на русском языке, на 252 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающей в себя 383 наименования, приложения, содержит 39 таблиц и 50 рисунков.
Устойчивость к температурным стрессовым факторам
Известно, что высокие и низкие температуры воздуха вызывают стресс в растительных организмах, который сопровождается замедлением их метаболизма. Темепратурный стресс может быть вызван как высокими, так и низкими температурами. Работ по селекции к высокотемпературному шоку не так много, хотя на протяжении последних десятилетий многие ученные занимаются изучением белков теплового шока, так называемых БТШ [Tall,1983; Войников и др., 1991; Gechev et al., 2006; Авгонова, 2006].
Исследования по низкотемпературному шоку более распространены. Так существуют данные по влиянию низких температур на растения субтропических и тропических зон, на некоторые цветочные культуры, а также ряд овощных культур. Повреждения, вызванные охлаждением, прежде всего, связаны с превращением липидов мембран из жидко-кристалического в твердое [Dix,1986; Ларина, 1995; Авгонова, 2006]. Повреждения при холодовом стрессе связаны с образованием внеклеточного льда. При этом отток воды во внеклеточное пространство приводит к вторичному эффекту, вызванному водным стрессом. Нарушения, вызываемые отрицательными температурами, могут быть предотвращены аккумуляцией антифризных веществ, уменьшением количества свободной воды. Кроме того, в осенне-зимний период отмечаются глубокие превращения запасных питательных веществ, в частности накопление жиров и сахаров [Ларина, 1995; Войников и др., 1991; Авгонова, 2006].
Исследованиями показано, что одним из компонентов, имеющем важную роль в защите растений от повреждений при понижении температур является свободный пролин. Как показали результаты клеточной селекции к гидроксипролину, полученные каллусные линии и растения картофеля, устойчивые к данному аналогу пролина, аккумулировали пролин и обладали повышенной морозоустойчивостью и толерантностью к NaCl[Dix, Street, 1976; Ларина, 1995; Авгонова, 2006].
Разработаны подходы для получения морозоустойчивых растений, основанные на генно-инженерных манипуляциях с Pseudomonas. В растения табака был введен ген, кодирующий белок, ускоряющий кристаллизацию льда в бактериях Pseudomonas. У трансгенных растений наблюдали повышенную активность кристаллизации льда по сравнению с контрольными. Формирование множества мелких кристаллов может снять повреждения клеток крупными кристаллами льда [Huitema et al., 1986; Ларина,1995].
В ответ на различные стрессы в клетках многих организмов наблюдается активация специфических генов и синтез специфических белков, так называемых стрессовых белков. Например,полипептиды, синтезирующиеся в клетках многих организмов, под действием гипертермии которые называют белками теплового шока (БТШ) [Александров, 1994; Войников и др.,1991].
В 1983 году были опубликиваны работы по дифференцированной генной активации у Drosophila, вызванной тепловым шоком и были описаны соответствующие, теплошоковые белки (БТШ) [Tall, 1983]. Кроме того, индукция БТШ была вскоре обнаружена во всех видах организмов, включая растения [Войников и др., 1991]. Открытие стрессовых белков вызвало большой интерес и стимулировало проведение целого ряда работ. Выбор теплового шока для изучения регуляции активности генов оказался удачным и позволил получить интересные результаты в области молекулярных механизмов действия стрессовых белков [Hendrick, Hartl, 1993; Ingram, Bartels, 1996].
С открытием БТШ и их характеристикой, клеточные аспекты теплошокового ответа и возможная роль вновь образованных БТШ для вызванной термотолерантности становятся основной исследовательской области молекулярной стрессовой биологии растений и животных.
Экспериментальные исследования по тепловому шоку, главным образом, сосредоточены на условиях теплового шока и тепловой адаптации. При этих условиях могут быть определены два различных состояния термотолерантности, и существуют доказательства, что в это вовлечены белки теплового шока, только в последнем случае. Два отличительных воздействия длительной гипотермии – это разрушение хлоропластной структуры, связанной с обесцвечиванием, наблюдаемое у EuglenaGracelessи рассаде высших растений, а также устранение внутренних инфекций из многих культурных растений [Pelham, 1985].
Подобно животным системам, три фазы теплошоковой индукции (несколько минут), экспрессия (3 часа), и спад (12-48 часов) БТШ и термотолерантность очень схожи и в растениях.
О природе белков теплового шока известно пока немного, неясно также, почему их синтез индуцируется относительно быстро. К настоящему времени нет определенного мнения о возможной роли БТШ в метаболизме клеток и в фенотипическом проявлении эффекта теплового шока. В ряде работ, сообщается об остановке при торможении развития организмов, подвергнутых воздействию высокой температуры. Не следует забывать, что при гипертермии происходит одновременно образование БТШ и ингибирование белкового синтеза, характерного для обычных, температурных условий. Второе событие, по-видимому, объясняет изменения в интенсивности развития организмов [Войников и др. 1984; Welch, Sahan, 1985].
Скрининг in vitro в условиях солевого стресса
Химический состав картофеля меняется в зависимости от сорта, почвенно-климатических условий и удобрений. Примерный химический состав клубней и ботвы следующий: клубни содержат воды - 75%, крахмала - 20%, сахара - 0.3%, белка -2%, жира – 0.15%, клетчатки -1%, золы -1.1%; свежая ботва содержит воды - 84%, крахмала - 6%, сахара – 0.5%, белка - 3%, жира – 0.7%, клетчатки - 3%, золы – 2.5%.
Кроме того, в состав клубней входит небольшое количество гликоалкалоида соланина. В нормальных здоровых клубнях соланина содержится 2-10 мг на 100 г сырого картофеля. В таком количестве соланин не оказывает вредного действия на организм человека и животных. На свету клубни зеленеют, содержание соланина в них повышается, они приобретают неприятный горький привкус. Из-за этого пищевые качества картофеля ухудшаются. Если в продовольственном картофеле будут обнаружены отдельные клубни с зеленой мякотью, то их следует варить очищенными от кожуры. Соланин при этом полностью разрушается.
Обычно картофель с более высоким содержанием сухого вещества и крахмала является и более вкусным. Большое содержание сахара в клубнях понижает столовые качества картофеля. Так, содержание сахара выше 2%, что нередко бывает зимой при охлаждении клубней, делает картофель неприятно сладким. Для того, чтобы устранить сладкий привкус клубней, необходимо их подержать при комнатной температуре в течение 7-10 дней. В этом случае сахар превращается обратно в крахмал.
Корневая система картофеля, выращенного из клубня, мочковатая [Посыпанов, Русанов,1997; Партоев, 2013]. Она представляет собой совокупность корневых систем отдельных стеблей. При посеве семeнами главный корень развивается из зачаточного корешка-семени и является как бы продoлжением стeбля. Корневая система имеет, так называемые, глазковые или первичные корни, образующиеся в начале прoрастания клубней. Столонные корни находятся непосредственно на столонах и пристолонные клубни, появляются в течениe всего вегетационного периода и располагаются группами по 4-5 около каждoго столонa. Hа один стебель прихoдится 20-25 кoрней в срeднем [Таммон,1957].
Oколо полoвины корней расположены в пахотном слое, от 22 до 38% проникают до 40-60 см, а отдельные корни уходят на глубину до 150-200 см [Клазенер,1929; Бме,1926].Pаспространение кoрней в ширину зависит от скороспелости сoрта, у раннеспелых сортов корни менее широко распространяются в стороны, чем у поздних [Ротмистров,Остерман,1970]. Рaзвитие корневой системы в значительной степени зависит от влажности почвы, е аэрации, содержания в ней питательных веществ, а также сорта картофеля: у среднеспелых и среднепоздних сортов корни более мощные, чем у раннеспелых. Стебель картофеля большей частью прямостоячий, реже отклоняющиеся в сторону, высотой 30-150 см. Окраска стеблей зелная, однако у некоторых сортов она маскируется антоцианом, который придат стеблям красно - бурый оттенок. На проявление окраски влияют освещенность, влажность почвы, величина посадочных клубней, удобрения и другие факторы. Куст растения картофеля состоит из 4-5, реже 6-8 стеблей. Число стеблей в кусте значительно варьирует и зависит от сорта, размера посадочных клубней и числа, проросших на них почек, растения, выросшие из крупных клубней, имеют больше стеблей, чем растения, полученные из мелких клубней, число стеблей в кусте определяет урожайность клубней.
В подземной части стебля из пазушных почек развиваются побеги-столоны, на концах которых образуются клубни, или утолщения. Толщина столонов всегда меньше, чем стеблей. Столоны могут быть разной длины, у раннеспелых сортов они короче, у среднеспелых и позднеспелых - длиннее.
Листья картофеля, появляющиеся при прорастании клубней, простые, цельнокрайние. По мере роста растения образуются прерывисто-непарноперисторассечнные листья. Каждый такой лист состоит из 3-4 пар боковых долей, размещнных одна против другой, промежуточных долек между ними и конечной доли. Опушенность листьев слабая [Справочник картофелевода, 1987]. С нижней стороны листа выступают сеть жилок, окраска которых нередко коррелирует с окраской клубней. Черешок, стержень и жилки долей у листа некоторых сортов окрашены в красно -бурый или красно - фиолетовый цвет. В листьях в процессе фотосинтеза в основном образуются крахмал, сахара и белки.
Цветки у картофеля собраны в соцветия, представляющие собой расходящиеся завитки, расположенные на общем цветоносе. Цветоносы и цветоножки у отдельных сортов бывают длинные и короткие. Цветоножка сочлененная. Цветки пятерного типа. Чашечка зеленая, спаяно пятилепестная, чашелистики сросшиеся у основания. Венчик колесовидный из пяти сросшихся лепестков, окраска венчика разнообразная: белая, красно-фиолетовая, сине - фиолетовая и синяя с различными оттенками.
Оценка устойчивости гибридов картофеля в полевых условиях
Снижение содержания хлорофилла в листьях при высокой концентрации NaCl, изменение его состояния и уменьшение фотохимической активности являются одной из основных причин низкого урожая картофеля, о чм свидетельствует клубнеобразование in vitro.
Так, при формировании микроклубней в присутствии NaCl в среде культивирования наивысший показатель имели устойчивые к соли гибриды № 1; 40; 42; 43; 48; 73; 79.
Эти клоны формировали в среднем до15 микроклубня на растение, и вес одного клубня достигал от 65мг до 98 мг (рис.4). Однако следует заметить, что устойчивые к засолению гибриды не всегда отличались высоким процентом формирования микроклубней и наоборот, т.е. клубнеобразование является генотипически закрепленным признаком.
Увеличение урожая сельскохозяйственных культур в значительной степени было достигнуто за счет химизации, механизации и мелиорации сельского хозяйства, что негативно сказалось на окружающей среде и привело к ряду экологических проблем. По некоторым данным, около 9х108 га всех земель планеты имеют высокое содержание солей, иэта тенденция с каждым годом возрастает[ФАО, 2010; Алиев, 2012].
Отобранные нами ранее растения - регенерантыкартофеля были апробированы в полевых условиях.
Опыты проводили в Вахдатском районе Гиссарской долины Таджикистана, используя рендомизированный полноблочный метод при схеме посадки 70 х 25 см. Всего было высажено 15клон-гибридов (1;40;41;42;45;46;48;49;50;51;53;55;60;63), в качестве контроля использовали клубни картофеля сорта Кардинал (рис. 5).
Таджикистан, 2010 г. В период вегетации растений использовали следующие удобрения: аммоний сульфат (10г/метримоноамоний фосфат(30 г/метр) перед посадкой, а также мочевину(10 г/м) на 40 день после посадки. Полив производился бороздковым методом при необходимости.
Был произведен анализ почвы перед посевом и в разные периоды вегетации. Как видно из данных таблицы 5, за вегетационный период уровень засоления почвы изменился от слабо засоленного до средне засоленного, а также изменился тип засоления от сульфатного до хлоридно-сульфатного. Наибольшая концентрация сухого вещества (1,1%), хлорида (0,129%) и сульфатов (0,524%) наблюдались в период цветения.
Как видно из представленных данных, общий процентвсхожестисемян был 92,6%, наибольший процент всхожести(100%) имели клоны 40, 50, 51, наименьший процент был у клон-гибрида № 48 и сорта Кардинал. Количество образовавшихся стеблей на одно растение составило 3,4, наивысший показатель был у клон-гибрида № 42 и наименьший у клон 85 гибрида № 60, и составил 5,9 и 1, 7 соответственно. Что касается высоты растений, то средняя величина была 58,2 сантиметра, наибольший показатель был у клон-гибридов № 40; 42 и 60.Высота растений на 90-й день после посадки значительно увеличилась в сравнении с 50-ым днем, но в сравнении с 70-ым днем высота растений увеличилась не значительно. Таким образом, происходило угнетение роста по мере усиления действия соли на растения картофеля.
Общая площадь листьев увеличилась значительно на 90-ый день, по сравнению с 50-ым, наивысший процент этого показателя имели клон-гибриды№1;40;41;42, а наименьший сорт Кардинал. Площадь листовой поверхности также увеличивалась в течение вегетационного периода, наименьший показатель имел сорт Кардинал, наивысший был у клон-гибрида № 41. Увеличение листовой поверхности происходило значительнее на промежутке с 50-ого по 70-ый день после посадки, а к 90-му дню происходило торможение увеличения площади листовой поверхности.
Оценку поражения заболеваниям проводили визуально. Наиболее подверженным к заболеваниям оказался сорт Кардинал и клон-гибрид № 48, тогдакак клон-гибриды № 1; 41; 42; 51 и 60 показали малый процент поражения болезнями.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в течение всего вегетационного периода произошел переход уровня засоления почвы от слабого к среднему типу, и как следствие, влияние солевого стресса привело к угнетению морфологических и физиологических параметров.
Как было отмечено ранее, одним из важнейших репродуктивных признаков картофеля является формирование и качество клубней, в связи с этим нами были изучены некоторые параметры урожайности клон-гибридов картофеля в условиях солевого стресса.
Содержание фотосинтетических пигментов у контрастных генотипов картофеля в процессе клубнеобразования in vitro
Одним из важнейших репродуктивных признаков картофеля является процесс формирования клубней. Этот процесс является генотипически закрепленным и особую роль в нем играют фитогормональные, углеводные и фотопериодические факторы [Adam et. al., 1996; Назарова и др., 2007; Негматуллаев и др., 2008].
Как известно, углеводы играют значительную роль не только как энергетический компонент клетки, но и участвуют в регуляции экспрессии генов, а также могут оказывать влияние на активность растительных ферментов и фитогормонов посредством гликозилирования [Koch, 1996]. Ферменты метаболизма сахаров также используются для направленного изменения содержания углеводов и, как следствие, роста, развития и устойчивости растений к стрессовым воздействиям [Голденкова и др., 2002].
Увеличение содержания сахарозы на уровне культуры in vitro в растениях может изменять метаболизм углеводов (глюкоза, фруктоза), их транспорт, возможны изменения в соотношение ауксинов и цитокининов и, как следствие, изменение генетического потенциала. Эти изменения могут проявляться за счет изменения содержания глюкозы, которые влияют на степень гликолизирования углеводов и фитогормонов, в результате, которого происходит изменение уровня экспрессии генов, регулируемых углеводами [Алиев и др., 2006].
Известно, что относительное увеличение содержания цитокининов может происходить за счет снижения эндогенного уровня ауксинов. Показано, что увеличение концентрации ИУК в культуральной среде приводит к увеличению неэстерифицированных форм в растениях при соединении с сахарами, и прежде всего с глюкозой. Увеличение концентрации глюкозы приводит к увеличению содержания эстерифицированных форм ИУК [Полевой, Саламатова, 1975]. По всей видимости, при увеличении содержания сахарозы в культуральной среде, особенно в процессе микроклубнеобразования картофеля, происходит изменение баланса гексоз,следствием чего является изменение уровня ауксинов с одной стороны, а с другой стороны приводитк сдвигу во взаимодействии между сахарами и цитокининовыми сигналами в регуляции экспрессии генов. И поэтому, вероятно, процесс инициации роста клубней требует высоких концентраций сахарозыу некоторых сортов картофеля[Мирзохонова, 2006].
Как показали исследования, оптимальная концентрация сахарозы для микроклубнеобразования у сорта Жуковский ранний была 5%, у солеустойчивого клон-гибрида №1 формирование клубней зависело от более высокой концентрации сахарозы – 7%, а у ТУ-регенерантов (устойчивый к высокой температуре) максимальное клубнеобразование наблюдалось при 9% сахарозы в среде культивирования. На рисунке 13 показана зависимость клубнеобразования от содержания сахарозы в среде культивирования. Как видно из приведенных данных, динамика формирования клубней на начальных этапах развития регенерантов во всех вариантах существенно не отличалась.
У ТУ-регенерантов картофеля наибольший процент формирования микроклубней наблюдался при максимальной концентрации сахарозы-9%. Следует отметить, что у ТУ-регенерантов повышение уровня формирования клубней плавно повышалось по мере повышения концентрации сахарозы и не превышало 40%.
У клон-гибрида №1 при концентрации сахарозы 5% наблюдалось формирование одиночных клубней у 50% растений, а при 7% сахарозы формирование клубней увеличилось в 2 раза. При повышении содержания сахарозы в среде культивирования до 9% наблюдалось резкое ингибирование клубнеобразования.
У сорта Жуковский ранний, максимальное количество клубней сформировалось при 5% концентрации сахарозы в среде культивирования и уменьшалось по мере увеличения концентрации до 9%, то есть у растений сорта Жуковский ранний инициация клубней повышается при понижении концентрации сахарозы. Достигая пороговой концентрации сахарозы (9%) в среде культивирования процесс формирования микроклубней подавляется.