Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Дофаминергические и грелиновые механизмы алкогольной зависимости (аналитический обзор) 13
1.1. Современные представления о дофаминовой системе 13
1.1.1. Дофамин и дофамин ер гические системы мозга. Дофаминовая нейропередача 13
1.1.3. Классификация рецепторов дофамина 16
1.1.4. Области экспрессии и локализации рецепторов дофамина 17
1.1.5. Онтогенез дофаминовой системы мозга 19
1.1.6. Функциональная роль рецепторов дофамина 23
1.1.7. Роль дофамииновой системы головного мозга в механизмах подкрепления 30
1.2. Современные представления о грелиновой системе 33
1.2.1. Грелин и грелиновая система 33
1.2.2. Рецептор грелина 34
1.2.3. Физиологическая роль грелина 35
1.2.4. Онтогенез грелиновой системы 37
1.2.5. Роль грелиновой системы головного мозга в механизмах подкрепления 39
1.2.6. Значение грелиновой системы головного мозга в алкогольной и наркотической зависимости 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы 45
2.1. Выбор объекта исследования 45
2.2. Определение срока беременности у крыс 45
2.3. Процедура хронической алкоголизации 45
2.4. Взятие материала 46
2.5. Экстракция РНК фенол-хлороформным методом
2.6. Экстракция РНК с использованием тризола 48
2.7. Обработка ДНКазой 48
2.8. Обратная транскрипция 48
2.9. Полимеразная цепная реакция 49
2.10. Агарозный гель-электрофорез 50
2.11. Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени 49
2.12. Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией 52
2.13. Иммуноферментный анализ 53
2.14. Статистические методы анализа 53
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 55
3.1. Влияние алкоголизации матерей на дофаминовую систему мозга плодов в пренатальный и в ранний постнатальныи периоды 55
3.1.1. Влияние алкоголизации матерей на содержание ДА и ДОФУК в переднем мозге плодов в пренатальный и в ранний постнатальныи периоды 55
3.1.2. Влияние алкоголизации матерей на экспрессию мРНК дофаминовых рецепторов и КОМТ в переднем мозге плодов в пренатальный и в ранний постнатальныи периоды 60
3.2. Влияние алкоголизации матерей на формирование грелиновой системы в пренатальный и ранний постнатальныи периоды 68
3.2.1. Влияние алкоголизации матерей на экспрессию мРНК грелинового рецептора в переднем мозге плодов в пренатальный и ранний постнатальныи периоды 68
3.2.2. Влияние алкоголизации матерей на уровень дезацилгрелина в сыворотке плодов в пренатальный и ранний постнатальныи периоды 70
3.3. Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на грелиновую систему взрослых крыс
3.3.1. Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на экспрессию мРНК грелинового рецептора в структурах мозга взрослых крыс 71
3.3.2. Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на содержание дезацилгрелина в сыворотке крови взрослых крыс 73
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 75
Заключение 85
Выводы 87
Научно-практические рекомендации 89
Список сокращений 90
Приложение 91
Литература
- Области экспрессии и локализации рецепторов дофамина
- Процедура хронической алкоголизации
- Влияние алкоголизации матерей на содержание ДА и ДОФУК в переднем мозге плодов в пренатальный и в ранний постнатальныи периоды
- Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на грелиновую систему взрослых крыс
Области экспрессии и локализации рецепторов дофамина
По эффектам на систему внутриклеточного синтеза цАМФ, ДА рецепторы делятся на две группы: Д1-подтип (активирует аденилатциклазную систему клетки (АЦ) и стимулирует накопление вторичного посредника цАМФ) и Д2-подтип, (ингибирует АЦ или не оказывает на нее действия) (Clark, White, 1997; Missale et al, 1998; Lajtha, 2007; Brady et al, 2012).
Методами молекулярной биологии идентифицировано и охарактеризовано еще три рецепторных подтипа - ДЗ, Д4 и Д5. ДА-рецепторы относятся к семейству метаботропных рецепторов нейротрансмиттеров и гормонов, сопряженных с гетеротримерными G-белками (ГТФ-связывающими) (Pivonello et al, 2007).
Для генов ДА-рецепторов характерно отсутствие интронов в кодирующих областях генов Д1- и Д5-рецепторов и разное их количество у представителей Д2-семейства (Sokoloff et al, 1990; Van Тої et al, 1991; Missale et al, 2010). Наличие интронов в кодирующей области Д2-подобных рецепторов объясняет существование у них сплайсинговых форм, что было показано для Д2- и ДЗ-подтипов. Изоформы ДЗ-рецептора - это нефункциональные белки; у Д2-рецептора существуют две изоформы - Д2Б (короткая изоформа) и Д2Ь (длинная изоформа) (Gingrich, Caron, 1993; Missale et al., 2010). Функциональных различий у двух изоформ Д2-рецептора к настоящему времени не выявлено. Обе изоформы обладают схожим паттерном экспрессии в структурах мозга, однако транскрипты Д2Б представлены менее широко (Monsma et al., 1989; Pivonello et al., 2007; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Таким образом, семейство ДА-рецепторов включает два основных подтипа: Д1-подобные, к которому относят Д1- и Д5-рецепторы, и Д2-подобные, в котором выделяют Д2-, ДЗ- и Д4-рецепторы (Раевский К.С. и др., 1996; Hiroi et al., 2002; Lajtha et al, 2007; Brady et al, 2012).
Наибольшее количество рецепторов ДА локализуется в ЦНС. В последние годы ДА-рецепторы были обнаружены и в других периферических органах, таких как: питуитарные и паратиреоидные железы, почки, сердце (Missale et al., 1998; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Д1-рецептор наиболее широко богато представлен в мозге у-крыс, обезьян и человека (Dearry et al., 1990; Fremeau et al., 1991; Pivonello et al., 2007). Основное количество мРНК Д1-рецептора было найдено экспрессируется в стриатуме, прилежащем ядре и зрительных бугорках (Dearry et al., 1990; Bergson et al., 1995; Lajtha et al., 2007; Brady et al., 2012). Небольшой уровень мРНК ДІ-рецептора экспрессируется обнаруживается в лимбической системе, гипоталамусе и таламусе (Dawson et al., 1988; Missale et al., 2010). В ряде областей (ретикулярная часть черной субстанции) выявлен высокий уровень Д1-рецепторного белка, тогда как соответствующая ему мРНК не найдена. Это позволяет предположить, что в указанные структуры Д1-рецептор попадает по терминальным проекциям нейронов из других областей мозга (Dearry et al., 1990; Weiner et al., 1991; Pivonello, 2007).
Д5-рецептор распространен в мозге гораздо беднее. Его локализация ограничивается гиппокампом, латеральным мамиллярным и парафасцикулярным ядрами таламуса (Meador-Woodruff et al., 1992; Missale et al., 2010). Значительное содержание мРНК Д5-рецептора найдено в некоторых ростральных отделах переднего мозга, включая кору, латеральный таламус, стриатум; в меньшей степени - черную субстанцию, медиальный таламус и гиппокамп (Choi et al., 1995; Lajtha et al, 2007; Brady et al, 2012).
Наибольшая экспрессия Д2-дофаминовых рецепторов определяется в стриатуме, обонятельных бугорках, центральной части прилежащего ядра (Jackson, Westlind-Danielson, 1994; Pivonello et al., 2007). Соответствующая Д2-рецептору мРНК найдена в префронтальной, цингулярной и энторинальной коре, миндалине и гиппокампе, следовые ее количества обнаружены в гипоталамусе, компактной части черной субстанции и вентральной покрышки области (Bouthenet et al., 1991; Jackson, Westlind-Danielson, 1994; Lajtha et al., 2007; Brady etal.,2012).
ДЗ-подтип рецепторов ДА в наибольшей степени экспрессируется в лимбических отделах и обонятельных бугорках, в меньшей степени ДЗ-рецептор представлен в гиппокампе и некоторых кортикальных областях. Незначительное количество мРНК ДЗ-рецептора выявлено в компактной части черной субстанции, вентральной области покрышки и мозжечке (Bouthenet et al., 1991; Lajtha et al., 2007; Brady etal.,2012).
Области наибольшей экспрессии Д4-рецептора сходны с таковыми для ДЗ-рецептора и представлены фронтальной корой, миндалиной, гиппокампом и гипоталамусом (Van Тої et al., 1991; Missale et al., 1998; Beaulieu and Gainetdinov, 2011). Высокий уровень мРНК Д4-рецептора имеется в сетчатке, ретикулярной части черной субстанции, в бледном шаре, таламусе (Mrzliak et al., 1996; Pivonello et al., 2007).
На субклеточном уровне ДА рецепторы локализуются в области синаптических контактов (пре- или постсинаптических), а также на соме и дендритах ДА-нейронов (Tarazi et al., 1998; Missale et al., 2010). В последние годы активно изучаются пресинаптические рецепторы, расположенные на терминальных окончаниях, а также рецепторы, локализованные на теле и дендритах ДА-нейронов, выполняют ауторегуляторную функцию в ДА-нейропередаче, и обозначаются термином «ауторецепторы». Выделяют три типа деятельности ауторецепторов ДА. Это регуляция импульсной активности, синтеза нейротрансмиттера и его высвобождения (Nestler et al., 2001; Missale et al., 2010; Beaulieu, Gainetdinov, 2011). Активация пресинаптических ауторецепторов тормозит синтез и высвобождение ДА, тогда как стимуляция соматодендритных рецепторов ДА вызывает подавление импульсной активности нейрона, вторично приводя к снижению выброса ДА в области синаптических окончаний (Nestler et al., 2001; Pivonello et al., 2007). Имеются также дендритные ауторецепторы, непосредственно регулирующие процесс высвобождения ДА (Westerink et al., 1994; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Фармакологические и нейрохимические исследования ДА-ауторецепторов показали, что они принадлежат к семейству Д2-подобных рецепторов (Morelli et al., 1988; Starke et al., 1989; Pivonello et al., 2007). В отношении Д1-подтипа рецепторов было подтверждено их преимущественно постсинаптическое расположение в структурах мозга (Tarazi et al., 1998). Д3-рецепторы мозга могут функционировать подобно Д2-ауторецепторам, ингибируя синтез и высвобождение ДА (Joseph et al., 2002). Д4-подтип рецептора расположен преимущественно постсинаптически (Rivera et al., 2002; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
ДА-ауторецепторы более чувствительны к эффектам селективных лигандов Д2-рецепторов и обладают более быстрым процессом десенситизации, по сравнению с постсинаптическими рецепторами (Cooper et al., 1991; Elsworth, Roth, 1996 Missale etal, 2010).
Онтогенез дофаминовой системы мозга Онтогенез дофаминовой системы мозга изучен довольно подробно с помощью ВЭЖХ, электронной микроскопии, иммуногистохимии, радиолигандных и молекулярно-биологических методов (Antonopoulos et al., 2002; Di Giovanni et al, 2009; Brady et al., 2012). У крыс концентрация моноаминов в центральной нервной системе при рождении низка и составляет 8 - 12% от концентрации у взрослых особей (Herregodts et al., 1990; Lajtha et al., 2007; Brady et al, 2012). Содержание ДА в мозге нарастает быстро, так что к 2-х недельному возрасту соответствует примерно 50% от содержания у взрослых. К 4-х недельному возрасту содержание ДА находится в пределах от 80% до 100% от взрослых значений.
Полосатое тело представляет собой область мозга, которая получает наиболее плотную ДА-ергическую иннервацию. В стриатуме содержание ДА при рождении колеблется от 11% до 13% от содержания у взрослых крыс (Giorgi et al., 1987; Lajtha et al., 2007). В полосатом теле содержание ДА повышается несколько медленнее. Содержание ДА в полосатом теле возрасте 2-х недель составляет лишь 28%, а на 3-й неделе - 50% от содержания у взрослого животного. В полосатом теле концентрация ДА достигает взрослых значений на 50 - 60-й день после рождения (Giorgi et al., 1987; Lajtha et al., 2007).
У крыс экспрессия Д1-рецептора в онтогенезе была исследована методом гибридизации мРНК in situ. В полосатом теле, обонятельном бугорке и коре сигнал обнаруживался начиная с 14-го дня пренатального развития и последовательно увеличивался на 16-й, 18-й и 21-й дни гестации (Schambra et al., 1994; Antonopoulos et al., 2002).
Процедура хронической алкоголизации
При введении грелина внутрь желудочков мозга и в вентральную область покрышки, грелин действует сходным образом агонистами ДА-рецепторов, стимулирует секрецию и обмен ДА в прилежащем ядре, и повышение локомоторной активности (Jerlhag et al., 2006a,b 2007, Abizaid et al., 2006). Системное введение грелина также воздействует на мезолимбическую ДА-систему (Jerlhag, 2008; Quarta et al., 2009), что говорит о способности периферического грелина проникать в мезолимбическую систему мозга. Введение антагониста рецептора грелина в ВОП блокируют способность грелина увеличивать потребление пищи (Abizaid et al., 2006) и стимулировать высвобождение ДА в прилежащем ядре (Jerlhag et al., 2011). Это свидетельствует, что мишенью грелина являются грелиновые рецепторы, расположенные на поверхности ДА-ергических клеток ВОП. Учитывая, что подкрепляющие свойства стимулов (таких как пища и алкоголь) опосредует высвобождение ДА в прилежащем ядре (Engel et al., 1988; Robinson, Berridge, 1993), полученные данные указывают, что рецепторы грелина входят в состав подкрепляющей системы мозга.
Мезолимбическая дофаминовая система вместе с холинэргической системой образует холинергическую-дофаминергическую систему подкрепления. Хорошо извесно, что мезолимбическая система подкрепления включает не только рецепторы ДА, но и ацетилхолиновые рецепторы (Larsson, Engel, 2004). Приём пищи и алкоголя повышает уровень ацетилхолина в вентральной области покрышки и дофамина - в прилежащем ядре (Rada et al., 2000; Larsson et al., 2005). Рецептор грелина экспрессируется в латеродорзальной области покрышки на холинэргических клетках (Guan et al., 1997; Dickson et al., 2010), что говорит о возможности грелина напрямую влиять на эту структуру. Введение грелина в л атер о дорзальную область покрышки активирует локомоторную активность и высвобождение ДА в прилежащем ядре (Jerlhag et al., 2007). Эти эффекты грелина блокируются системным и внутримозговым введением неселективного антагониста никотиновых рецепторов - мекамиламина (Jerlhag et al., 2006а; Jerlhag, 2008). Одновременно, мекамиламин блокирует способность локально введённого в ВОП грелина повышать потребление пищи (Dickson et al., 2010). Таким образом, грелин активирует холинэргическую-дофаминергическую систему подкрепления.
Использование селективных антагонистов некоторых типов никотиновых и ацетилхолиновых рецепторов показало, что способность грелина активировать холинергическую-дофаминергическую связь подкрепления опосредована определёнными подтипами никотиновых и ацетилхолиновых рецепторов, а именно аз(3г, (Хб и Рз (Jerlhag, 2008). Эти подтипы также опосредуют и подкрепляющие свойства алкоголя - алкогольную стимуляцию и потребление алкоголя грызунами (Larsson, Engel, 2004; Jerlhag et al., 2006b; Lof et al., 2007; Steensland et al., 2007; Ericson et al., 2009). Блокирование данных подтипов варениклином снижает потребление алкоголя заядлыми курильщиками (МсКее et al., 2009), а один гаплоидный фенотип гена (Хб ассоциируется с тяжёлыми формами алкогольной зависимости (Landgren et al., 2009). Чрезмерное потребление алкоголя крысами в течение долгого периода вызывает высвобождение ацетилхолина в ВОП, за которым следует увеличение уровня ДА в прилежащем ядре, что указывает на активацию алкоголем холинэргической-дофаминергической системы подкрепления, подобную таковой, вызываемой грелином (Larsson et al., 2005). Видимо, нейрохимические пути действия грелина и алкоголя имеют много общего и включают холинэргическую и дофаминэргическую системы подкрепления. Активность ДА-ергических нейронов в ВОП опосредована различными афферентами, и в пределах ВОП рецептор грелина присутствует не только на ДА-ергических клетках, но также и на пресинаптических мембранах афферентов (Abizaid et al., 2006), которые могут опосредовать способность грелина активировать системы подкрепления.
Так, способность грелина повышать локомоторную активность, высвобождение ДА в прилежащем ядре и стимулировать условную реакцию предпочтения места ослабляется неселективным агонистом НМДА-рецепторов AP5 (Jerlhag et al., 2011). Более того, грелин-индуцированная электрическая активность дофаминергических нейронов вентральной области покрышки зависит от возбуждающего выброса глутамата глутаматергического входа, а блокада НМДА-рецепторов в ВОП снижает вызываемое потреблением пищи высвобождение ДА в прилежащем ядре (Taber, Fibiger, 1997; Abizaid et al., 2006). К настоящему времени предполагается, что именно НМДА-рецепторы опосредуют высвобождение ДА в прилежащем ядре, наблюдаемое во время потребления животными пищи после введения грелина (Kawahara et al., 2009).
Несмотря на бурный прогресс в изучении центральных механизмов голода, действие антагонистов опиодных рецепторов и антагонистов орексигенного рецептора А на способность грелина активировать мезолимбическую дофаминовую систему к настоящему времени не доказано (Jerlhag et al., 2011). В целом, предполагается, что центральная орексигенная сигнальная система принимает участие в вызываемом грелином потреблении и поиске пищи при голоде (Toshinai et al., 2003; Perello et al., 2010), В тоже время ряд данных указывает на то, что грелин-индуцируемое потребление пищи и грелин-зависимое подкрепление, отчасти регулируются разными механизмами. Тем не менее, накопленные данные о реципрокных взаимодействиях рецепторов грелина, ДА, ацетилхолина, НМДА, гамма-аминомасляной кислоты, энкефалинов и канабиноидов внутри мезокортиколимбической системы мозга свидетельствуют о возможности в будующем использовать препараты различных групп, в том числе антагонистов грелиновых, никотиновых или глутаматных рецепторов, для лечения целого ряда аддитивных состояний (Dickson et al., 2011).
Алкогольная зависимость - это хроническое рецидивирующее заболевание и одновременно острая социальная проблема. Доступные методы лечения включают медицинские, психологические, и социальные мероприятия, способные увеличить время между рецидивами и снизить потребление алкоголя. Алкогольная зависимость является гетерогенным заболеванием, в развитии которого играют роль различные сигнальные системы. Понимание сложных механизмов, лежащих в основе этой болезни - ключ к разработка новых путей и средств лечения алкоголизма.
Работы последних лет по изучению центральных эффектов гормона голода грелина, показавшие тесное взаимодействия грелина и дофаминэргической системы мозга (отвечающей за физиологические механизмы подкрепления), привели к мысли о том, что система грелин-ДА может принимать участие не только в регуляции пищевого поведения и энергетического баланса, но и в формировании зависимости от наркотиков и алкоголя (Dickson et al., 2011; Айрапетов М.И и др., 2013). Так, системное введение антагониста грелинового рецептора ослабляет подкрепляющие свойства амфетамина и кокаина (Jerlhag et al., 2010), и наоборот, грелин стимулирует поиск кокаина у крыс (Wellman et al., 2005; Davis et al., 2007; Tessari et al., 2007). С другой стороны, голод, стимулирующий подъем уровня грелина (Gualillo et al., 2002), одновременно, усиливает поиск и самовведение кокаина и амфетамина у крыс, а так-же повышает наркоген-зависимую локомоторную активность (Carroll et al., 1979).
В экспериментах с антагонистами рецептора грелина (BIM28163, JMV2959 D-Lys3- GHRP-6) и на мышах-нокаутах было показано снижение подкрепляющих свойства алкоголя, которые измеряли по уровню дофамина в прилежащем ядре, изменению локомоторной активности и реакции предпочтения места (Moulin et al., 2007; Jerlhag et al., 2009; Kaur, Ryabinin, 2010). У людей, страдающих алкоголизмом, выявлена корреляция между однонуклеотидным полиморфизмом в гене рецептора грелина, потреблением алкоголя, избыточным весом и курением (Landgren et al, 2008, 2010).
Введение грелина (в желудочки мозга, ВОП) повышает потребление алкоголя мышами, тогда как мыши-нокауты по гену грелина демонстрируют снижение локомоторной активности, реакции предпочтения места, и высвобождения ДА в прилежащем ядре в ответ на алкоголь (Jerlhag et al., 2009). На уровне структур мозга эти эффекты реализуются на уровне мезолимбической системы подкрепления, поскольку введение грелина непосредственно в гипоталамус не влияло на потребление алкоголя крысами (Schneider et al., 2007). Системное действие грелина носит аддитивный характер и наиболее выражено у грызунов, потреблялявших ранее алкоголь, так как введение грелина интактным крысам, незначительно повышает потребление алкоголя (Lyons et al., 2008). У человека гаплотипы гена грелина ассоциируются с избыточным весом, приобретенным или наследственным алкоголизмом (Landgren et al., 2008; Landgren et al., 2010). У здоровых добровольцев уровень грелина в плазме крови снижался сходным образом, после приёма алкоголя или приема пищи (Calissendorff et al., 2006; Zimmermann et al., 2007; Tschop et al., 2001). Взаимосвязь уровня грелина в плазме крови с алкогольной зависимостью у людей остаётся неясной, поскольку некоторые исследователи пишут о повышении, а некоторые -о понижении уровня грелина у людей-алкоголиков (Kim et al., 2005; Kraus et al., 2005; Addolorato et al, 2006; Hillemacher et al, 2007; Badaoui et al., 2008). Неоднозначные результаты этих наблюдений, видимо, связаны с различной этиологией, тяжестью заболевания, и времени забора крови.
При отмене алкоголя, уровень грелина повышается в течение начальной фазы абстиненции и снижается до контрольных цифр в дальнейшем (Wurst et al., 2007). В то же время потребность в алкоголе при воздержании стимулировала подъем грелина (Addolorato et al., 2006, Leggio, 2010). Таким образом, грелин и его рецептор могут быть одними из факторов, от которых зависит потребление и поиск подкрепляющих субстанций. Поэтому, поиск и разработка фармакологических препаратов, способных взаимодействовать с грелиновой системой головного мозга, может быть одним из перспективных направлений в лекарственной терапии алкоголизма, наркомании, и других аддитивных состояний.
Влияние алкоголизации матерей на содержание ДА и ДОФУК в переднем мозге плодов в пренатальный и в ранний постнатальныи периоды
Приступая к обсуждению полученных данных, необходимо отметить что потребление алкоголя во время беременности может вызывать серьезные негативные последствия у потомства (Schneider et al, 2011). Алкоголь свободно проходит через плаценту и попадает в кровоток плода. Из-за низкой активности алкогольдегидрогеназы, плод не способен метаболизировать алкоголь, который может сохраняться в амниотической жидкости (Schneider et al, 2011).
Фетальный алкогольный синдром (ФАС) является наиболее известным результатом потребления алкоголя во время беременности. Диагностические критерии ФАС включают симптомы в трех областях: различные черепно-лицевые дисморфизмы (рис. 22), пренатальное и / или постнатальное отставание в росте и дисфункцию ЦНС, в том числе когнитивный и поведенческий дефицит (Rivera et al, 2005; Schneider et al, 2011).
Созревание моноаминергических систем мозга происходит, начиная с третьего триместра беременности, и охватывает первые три недели постнатального периода (Rathbun, 1985; Druse, 1990; Шабанов П.Д., 2010). Чувствительность системы дофамина к действию этанола в этот период различается по срокам наблюдений (Cooper, 1988; Druse, 1990; Gillespie, 1997). В целом, потребление этанола беременными крысами (пренатальная нагрузка этанолом) вызывает снижение активности моноаминергических систем мозга у потомства (Rathbun, 1985; Cooper, 1988; Мао et al., 2013). Это проявляется уменьшением содержания дофамина в стриатуме и числа участков связывания дофаминовых рецепторов Д1-типа в коре головного мозга (Druse, 1990; Naseer et al., 2014), снижением активности транспортера ДА в стриатуме (Barbier, 2009), значительным уменьшением числа Д1- и Д2-рецепторов в мозге у крыс на разных сроках постнатального развития (Carneiro, 2005; Uban et al., 2013). Пренатальное воздействие этанола приводит к постоянной аномальной синаптической пластичности в дорсолатеральном стриатуме из за нарушенного баланса Д1- / Д2-рецепторов (Zhou et al., 2012). В то же время, результаты изменения активности ДА-ергической системы мозга и поведения у крысят, рожденных от матерей, алкоголизированных в период беременности, могут зависеть от линии экспериментальных животных и величины алкогольной нагрузки. Так, потомство крыс линии ТНА (Tokai High Avoider) в большей степени реагировало на пренатальную алкогольную нагрузку в сравнении с крысами линии Вистар (Furuya, 1996). В данной работе показано, что уровень алкогольной нагрузки может разнонаправлено влиять на обмен дофамина в мозге. В частности, потребление матерями питьевого раствора с 10%-ным и 20%-ным содержанием алкоголя увеличивало концентрацию ДА и снижало уровень метаболита ДА - диоксифенилуксусной кислоты в структурах мозга новорожденных крысят. В тоже время потребление 5%-ного раствора алкоголя вызывало противоположные изменения в содержании дофамина и его метаболитов в мозге потомства (Furuya, 1996). Сходные результаты по влиянию величины алкогольной нагрузки на обмен ДА у потомства были получены в экспериментах на приматах. Так, низкая концентрация этанола в плазме крови самок-макак в период беременности (от 0 до 249 мг/дл) увеличивала содержание ДА в стриатуме у потомства, тогда как более высокие концентрации этанола в крови (в диапазоне от 260 до 540 мг/дл) снижали уровень ДА в стриатуме (Clarren, 1990).
В нашем исследовании показано, что алкоголизация крыс в период беременности вызывает снижение активности ДА-ергической системы мозга. Отмечалась тенденция к снижению уровня ДА - с 0,0187±0,0077 нг/мг ткани в контроле до 0,0131 ±0,0027 нг/мг ткани у алкоголизированных плодов, а также мРНК фермента метаболизма катехоламинов КОМТ с 84,85±1,04 у.е. в контроле до 80,65±1,05 у.е. у алкоголизированных плодов в структурах переднего мозга на 17-й день пренатального развития.
На 13-й день пренатального периода достоверных отличий в этих показателях не отмечали. В ответ на снижение активности пресинаптического отдела системы ДА отмечали развитие компенсаторной реакции со стороны рецепторного аппарата, что выражалось достоверным увеличением содержания мРНК длинного (с 58,23±0,26 у.е. в контроле до 65,40±0,67 у.е. у алкоголизированных плодов) и короткого (с 57,48±0,33 у.е. в контроле до 64,48±0,65 у.е. у алкоголизированных плодов) сплайс-вариантов дофаминового рецептора Д2-типа. Как и в случае с содержанием ДА, на 13-й день пренатального периода достоверных отличий этих показателей у алкоголизированных и не алкоголизированных плодов не наблюдали. Это, по-видимому, позволяет сохранять активность системы ДА мозга плода на физиологическом уровне.
В постнатальный период отмечали дальнейшее снижение активности системы ДА, в частности, уменьшение содержания ДОФУК и отношения ДОФУК/ДА в группе крысят, матери которых потребляли алкоголь во время беременности, но были переведены на потребление воды после рождения потомства (группа «отмена алкоголизации»), в сравнении с контрольной группой на 10-й день постнатального периода, и снижением содержания ДОФУК и отношения ДОФУК/ДА в группе продолжающихся алкоголизироваться крыс (группа «алкоголизация») на 17-й день постнатального периода. Несмотря на снижение активности пресинаптического отдела ДА системы мозга в постнатальный период, компенсаторной реакции со стороны рецепторного аппарата системы ДА на этих сроках не наблюдали. В тоже время прекращение приема алкоголя кормящими самками способствовало восстановлению уровня ДОФУК до нормальных значений на 17-й день постнатального развития, что свидетельствует о возможной нормализации активности системы ДА после прекращения алкоголизации.
Интересно отметить разную выраженность изменений со стороны системы ДА на разных сроках постнатального развития. Угнетение активности системы ДА было более выражено в более поздние сроки, в частности, на 10-й день постнатального периода.
При сравнении групп животных, алкоголизированных в период беременности и кормления (пре- и постнатальный период) и только в период беременности (отмена этанола после рождения детенышей), следует отметить тенденцию к нормализации функционирования дофаминергической системы мозга, в большей степени выраженную в случае отмены алкоголя в постнатальном периоде. Так, восстановление уровня до нормальных значений ДОФУК и мРНК фермента метаболизма катехоламинов КОМТ в структурах переднего мозга отмечали лишь на 17-й день постнатального периода (поздние сроки постнатального периода). Это хорошо согласуется с полученными ранее данными, что введение нейротоксина 6-гидроксидофамина, избирательно нарушающего дофаминергическую нейромедиацию, крысам в пренатальный (13-й и 17-й дни беременности) и ранний постнатальный период (4-10-17-й дни жизни) по-разному влияет на эмоциональное поведение и обмен моноаминов в головном мозге (Шабанов П.Д. и др., 2002). Показано, что последствия пренатального введения 6-гидроксидофамина крысам были значительно более выражены и сохранялись до 17-го дня постнатального периода (Шабанов П.Д. и др., 2002).
Исследования на грызунах показали, что нарушения ДА-ергической системы, вызванные пренатальным воздействием алкоголя могут лежать в основе некоторых поведенческих изменений, связанных с ФАС. Например, гиперактивность во время раннего периода развития могут быть получены путем химического истощения ДА-ергических нейронов среднего мозга у новорожденных крыс или путем введения алкоголя внутриутробно (Schneider et al., 2011). У грызунов были зафиксированы и другие неврологические нарушения воздействия алкоголя на плод, в том числе изменения в гиппокампе, мозжечке, соматосенсорной коре, и обонятельной луковице (Uban et al., 2013). Тем не менее, нарушения ДА-ергической системы подчеркнуты из-за ее важности в исполнительном и тормозном контроле в областях, в которыех у детей с ФАС наблюдается дефицит.
Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на грелиновую систему взрослых крыс
В экспериментах по исследованию формирования дофаминергической системы и грелиновой системы в онтогенезе при хронической алкоголизации 18 самок крыс, начиная с 1-го дня до окончания беременности (21-22-й день), подвергали полунасильственной алкоголизации 15%-ным раствором этанола в качестве единственного источника жидкости при свободном доступе к брикетированному сухому корму (рис 4). Половину животных после рождения ими детенышей переводили на водный режим, вторую половину крыс продолжали алкоголизировать до 17-го дня постнатального развития крысят. Контролем служили 17 самок крыс, содержавшихся на обычном водном режиме. Детеныши, рожденные от них, служили контролем крыс, матери которых были подвергнуты алкоголизации.
В экспериментах с хронической алкоголизацией 40 взрослых животных, крыс подвергали полунасильственной алкоголизации 15%-ным раствором этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6-ти месяцев при свободном доступе к брикетированному сухому корму. Контрольная группа состояла из 10 крыс и в качестве источника жидкости получала воду. Экспериментальные животные были разделены на три группы - группа алкоголизации в течение 6-ти месяцев и группы 1-го и 7-го дня абстиненции (отмены алкоголя).
Беременных крыс на 13-й и 17-й дни гестации декапитировали, извлекали плоды и выделяли мозг. Аналогично выделяли мозг у крысят в возрасте 4-х, 10-ти и 17-ти дней жизни. Для биохимических тестов использовали структуры переднего мозга. Секцию проводили на уровне среднего мозга, отсекая нижлежащие отделы мозга и мозжечок по линии проекции мозжечка на низлежащие структуры.
У крысят так же тотально собирали вытекшую кровь, инкубировали в течение 30 мин. при +4С и далее центрифугировали при 3000 об/мин и температуре +4С. Полученные образцы сыворотки крови замораживали и хранили при -80С до проведения иммуноферментного анализа.
Взрослых крыс декапитировали через 6 месяцев после хронической алкоголизации и на 1-й и 7-й дни после отмены алкоголя. Мозг выделяли на холоду. Образцы необходимых структур мозга (фронтальная кора, прилежащее ядро, гипоталамус, миндалина, гиппокамп, вентральная тегментальная область) немедленно замораживали в жидком азоте и хранились при температуре -80С до проведения ПЦР-анализа. Так же после декапитации тотально собирали вытекшую кровь, инкубировали в течение 30 мин. при +4С и далее центрифугировали при 3000 об/мин и температуре +4С. Полученные образцы сыворотки крови замораживали и хранили при -80С до проведения иммуноферментного анализа.
Суммарную РНК выделяли с использованием гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформного метода экстракции (Hillary, 2000). Пробу мозга гомогенизировали в буфере D (4 М гуанидинтиоцианат, 30 мМ цитрат натрия, 30 мМ (3-меркаптоэтанол, рН 7,0), затем центрифугировали при 13000 об/мин 5 мин, отбирали супернатант и добавляли к нему 1 объем водонасыщенного фенола и 1/5 объема смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1. Суспензию инкубировали на льду в течение 5 мин, перемешивая каждую минуту. Центрифугировали при 13000 об/мин (4С) в течение 30 мин и отбирали водную фазу. В качестве осаждающего агента использовали равный объём 12 М раствора LiCl. Полученную смесь инкубировали 30 мин при -20 С, затем центрифугировали 15 мин при 13000 об/мин. Осадок промывали 80% этанолом, высушивали и растворяли в 40 мкл стерильной воды. Осадок подсушивали в течение 10-15 мин. при +56С с открытой крышкой. К осадку добавляли 30 мкл деионизованной воды, перемешивали и инкубировали 15 минут при +56С в закрытых пробирках. После чего центрифугировали в течение 1 мин. при 13000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость в дальнейшем использовали для ПЦР.
Выделение тотальной РНК проводили из 20 мг пробы мозга с использованием реагента TRIzol («Ambion», США) в полном соответствии с инструкцией производителя.
Обработку проб ДНКазой проводили с использованием ДНКазы («Promega», США) в полном соответствии с инструкцией производителя.
После обработки ДНКазой концентрацию полученной РНК измеряли на спектрофотометре «Implen NanoPhotometer РЗЗО» («Implen», Германия), по отношению А2бо/А28о (в норме 1,9) оценивали чистоту выделенного препарата. Для последующей работы пробы выравнивали по концентрации РНК.
Синтез к ДНК проводили методом ОТ в 25 мкл реакционной смеси с использованием РНК-зависимой ДНК-полимеразы вируса лейкемии мышей Молони (M-MuLV обратной транскриптазы, «Promega», США). К образцу тотальной РНК в количестве 0,5-1 мкг добавляли 0,5 мкг олиго-(сІТ)іб праймеров («Медиген», Россия) и доводили объём смеси до 10 мкл стерильной водой («Sigma-Aldrich», США), свободной от ДНКаз и РНКаз (такую воду далее использовали во всех экспериментах с НК), затем осуществляли отжиг праймеров на матрице РНК при 70С в течении 5 мин в твердотельном термостате «TDB-120» («Biosan», Латвия), после чего пробы немедленно охлаждали на льду в течении 2-х мин. Данный твердотельный термостат далее использовали для всех одностадийных реакций с участием НК. Далее к 10 мкл пробы добавляли 15 мкл реакционной смеси в однократном буфере для ОТ, которая содержала 200 единиц M-MLV обратной транскриптазы, эквимолярную смесь четырёх dNTP по 500 мкМ каждого и 25 единиц ингибитора РНКаз RNasin Plus (все компоненты в смеси производства компании «Promega», США). Реакцию проводили в течение одного часа при 42С. Пробы кДНК хранили при -20С в течении одного года.