Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Оксид азота в биологических системах: синтез, регуляция и функции 10
1.1.1 Синтез N0 и его регуляция 10
1.1.2 Биологическая роль оксида азота 15
1.2 Современные представления об окислительной модификации белков 20
1.2.1 Окислительная модификация белков: механизмы и последствия 20
1.2.2 Эволюция методологических подходов к оценке окислительной модификации белков 28
1.2.3 Взаимосвязь окислительной модификации белка и протеолиза 34
1.3 Лизосомальный цистеиновый протеолиз: механизмы, регуляция, роль в иммуногенезе 37
1.3.1 Структурно-фукнкциональные особенности лизосомальных цистеиновых протеиназ 37
1.3.2 Место лизосомального цистеинового протеолиза в системе иммунитета 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 47
2.1 Экспериментальные модели in vivo и схемы введения препаратов 47
2.2 Экспериментальные модели in vitro 48
2.3 Методы получения биологического материала in vivo 49
2.4 Методы получения биологического материала для экспериментов in vitro 50
2.5 Биохимические методы исследования 51
2.6 Статистическая обработка данных 59
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1 Биохимико-физиологические характеристики экспериментальных моделей 60
3.2 Оценка состояния окислительной модификации белков
3.2.1 Характеристика окислительного карбонилирования белков под действием ингибитора синтеза оксида азота 63
3.2.2 Характеристика окислительного карбонилирования белков под влиянием субстрата синтеза оксида азота - L-аргинина 77
3.2.3 Состояние окислительной модификации остатков тирозина и триптофана в условиях in vivo- и in vitro-модулирования дефицита синтеза оксида азота 88
3.3 Оценка состояния лизосомального цистеинового протеолиза 91
Заключение 109
Выводы 117
Список условных сокращений 118
Список литературы
- Современные представления об окислительной модификации белков
- Лизосомальный цистеиновый протеолиз: механизмы, регуляция, роль в иммуногенезе
- Методы получения биологического материала для экспериментов in vitro
- Характеристика окислительного карбонилирования белков под влиянием субстрата синтеза оксида азота - L-аргинина
Современные представления об окислительной модификации белков
С момента открытия оксида азота накоплено значительное количество сведений о его биологической роли. Большинство исследований 1990-х годов были направлены на изучение механизмов действия N0 на активность гладких мышц сосудов посредством активации гуанилатциклазы [9]. Было установлено, что важнейшей физиологической мишенью для оксида азота в организме является растворимая гуанилатциклаза (рГЦ) [39], которая при активации увеличивает внутриклеточную концентрацию циклического гуанозинмонофосфата, в результате этого активируется протеинкиназа G. Действуя по этому пути, оксид азота вызывает расслабление гладкой мускулатуры сосудов и ингибирует агрегацию тромбоцитов [177].
Кроме этого, оксид азота широко представлен как в центральной, так и в периферической нервной системе. Полагают, что N0 действует опосредованно на динамическую активность нейронов, модулируя высвобождение нейротрансмиттеров (ацетилхолин, катехоламины, серотонин, гистамин) [194]. Эндогенный оксид азота участвует во многих жизненно важных процессах, являясь универсальным и необходимым регулятором функций клеточного метаболизма. Оксид азота ингибирует агрегацию тромбоцитов и их адгезию на стенках кровеносных сосудов [233], участвует в регуляции тонуса кровеносных сосудов [136], деятельности органов дыхания [173], желудочно-кишечного тракта [150, 228] и мочеполовой системы посредством центральной и вегетативной нервной системы [166, 195]. Кроме этого N0 играет важную роль в нейротрансмиссии [142] ив формировании иммунного ответа [211]. Известно, что NO отличается высокой реакционной способностью, благодаря наличию неспаренного электрона на внешней л-орбитали [130]. Основным продуктом окисления оксида азота являются химически инертные нитратные ионы, способные вновь превращаться в N0 [37]. При взаимодействии N0 с супероксид-анион радикалом (ї) образуется пероксонитрит: NO + О2 - 0N00-.
Пероксонитрит представляет собой короткоживущую молекулу, обладающую повреждающим эффектом. Это объясняется способностью 0N00 инактивировать Mn-супероксиддисмутазу и воздействовать на митохондриальную дыхательную цепь, способствуя увеличению уровня 02 , что приводит к повреждению не только митохондриальной мембраны, но и ДНК, липидов и белков [44, 224]. Помимо этого, накопление пероксонитрита способствует развитию апоптоза по пути активации проапоптозных белков Вах [171]. Таким образом, пероксонитрит - сильнейший окислитель [205], однако было установлено, что ONOO реагирует с глутатионом с образованием S-нитрозотиола, способного стать источником оксида азота [9, 205]. Предполагается, что этот механизм может представлять путь детоксикации пероксонитрита. Биологическими мишенями N0 при участии кислорода являются тиолы и остатки тирозина, реакция нитрозилирования происходит через производное оксида азота - пероксонитрит, который также способен повреждать мембрану митохондрий [44].
С другой стороны, в литературе отмечается способность N0 взаимодействовать с металлами переменной валентности, замедляя Fe2+-индуцируемое перекисное окисления липидов. Доказанным фактом является и то, что в клетках и тканях, продуцирующих оксид азота из L-аргинина, образуются динитрозильные комплексы негемового железа (ДНКЖ) [58]. При этом белковые ДНКЖ являются стабильными депо оксида азота, низкомолекулярные ДНКЖ -переносчиками N0 через клеточные мембраны, однако этот вопрос требует дополнительного исследования [9]. Для оксида азота характерен ряд защитных эффектов: увеличение активности антиоксидантных ферментов [230] и экспрессии кодирующих их генов. Важно отметить, что оксид азота ингибирует перекисное окисление липидов, взаимодействуя с радикалом липидной перекиси NO + LO2 - LOONO .
Окислительно-восстановительные реакции, использующие N0 и Ог в качестве исходных видов молекул, делятся на два класса. Первый класс включает в себя N0 и активные формы азота (АФА), полученные при взаимодействии N0 и активных форм кислорода (АФК). Второй класс содержит АФК в качестве исходного вида молекул. N0 / АФА и АФК могут использоваться отдельно или в комплексе в иммунных реакциях, а также участвовать в "уничтожении" бактерий и иммунной регуляции. Как уже было сказано, N0 вырабатывается в качестве первичного продукта ферментативного действия индуцибельной NO-синтазы и является относительно нереактивным, так как вступает в прямую реакцию только с переходным металлом в геме или кобаламином, с негемовым железом или реактивными радикалами, например, радикалом гидропероксида, образованным при липидной пероксидации [168]. Последняя реакция является примером мощного антиоксидантного свойства N0.
В настоящее время известно, что N0 выступает в качестве мощного антиоксиданта в клетках млекопитающих, предотвращая повреждение АФК, которое может быть вызвано реакциями с металлами, супероксидом и липидными радикалами. С другой стороны, N0 не вступает в прямую реакцию с тиолами, так как необходима активация с супероксидом или Ог для выработки активных форм азота, например, ONOO", N02, и N2O3. 0N00" и N02 могут окислять субстрат, а N2O3 является основным источником нитрозилирования субстрата. Таким образом, эти АФА создают условия, приводящие к нитрозативному или окислительному стрессу. Так как N0 и NO2 - липофильны, они могут мигрировать через клетки, увеличивая количество потенциальных мишеней [168]. Баланс между N0 и супероксидом определяет не только биодоступность N0, но и образование АФА в непосредственной близости от источника супероксида. Другим важным результатом взаимодействия АФК и N0 является то, что активность пероксидазы приводит к потреблению N0 и образованию NO2 и N2O3, а также нитритов/нитратов.
Известно, что биологическая окислительно-восстановительная система, связанная с иммунитетом, представлена Ог , Н2О2 и другими активными формами кислорода (АФК) [168]. Первичный клеточный источник АФК - оксидазы, которые изменяют Ог , путем переноса отдельного электрона с НАДФН#Н (восстановленная форма) на кислород [237]. Дальнейшее восстановление кислорода до активной формы катализируется рядом ферментов посредством взаимодействия с переходными металлами или реакции с N0.
Открытие молекулярных механизмов действия N0 позволило обнаружить участие оксида азота в формировании иммунных реакций [211]. Оксид азота прямо и косвенно модулирует иммунную реакцию в макрофагах и фагоцитах. Первые предположения о роли оксида азота в формированиии иммунного ответа возникли после обнаружения феномена синтеза N0 макрофагами [174]. В дальнейшем были получены подтверждения вовлеченности оксида азота в механизмы неспецифического иммунитета [80, 135, 168, 190, 211] и частично в комплексный механизм тканевого повреждения через модуляцию воспалительного процесса [46, 99] и апоптоза [169]. Оксиды азота (NOx) в качестве участников врожденного иммунного ответа были найдены в фагоцитах [149, 226]. Активация выработки NOx запускается при взаимодействии иммуногенов со специфическими рецепторами мембраны, такими как комплемент или рецепторы [168, 217]. Образование NOx также стимулируется при лечении веществами, которые активируют поступление кальция [237]. Хотя процесс активации хорошо исследован, о процессах, помогающих контролировать или ограничивать активность НАДФН#Н-оксидазы и выработку супероксидов недостаточно известно [237].
Лизосомальный цистеиновый протеолиз: механизмы, регуляция, роль в иммуногенезе
Метод определения активности лизосомальных цистеиновых протеиназ Активность катепсинов В, L и Н изучалась спектрофлуориметрическим методом (System 3 Scanning Spectrofluorometr, Optical technology devices, inc. Elmstord, New York, 10523) no Barrett & Kirschke [77].
Принцип метода: количественное определение 7-амидо-4-метилкумарина, высвобождающегося в результате энзиматического гидролиза пептидной связи Na-CBZ-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin («Sigma», США) для катепсина В, Na-CBZ-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin («Sigma», США) для катепсина L, Arg-7-amido-4-methylcoumarin («Sigma», США) для катепсина Н («Sigma», США). Преимущества данного метода связаны с высокой чувствительностью и специфичностью используемых субстратов.
Ход определения. К 0,4 мл субстратно-буферного раствора, содержащего 20 мкМ Na-CBZ-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin («Sigma», США) для катепсина В, N-CBZ-Phe-Arg-7-aMH7i,o-4-Meran[KyMapHHa («Sigma», США) для катепсина L и Arg-7-amido-4-methylcoumarin («Sigma», США) для катепсина Н, 8 мМ ДТТ и 2 мМ ЭДТА в 0,1 М ацетатном буфере рН 6,0 и рН 5,5 для катепсинов В и L соответственно, Na/K-фосфатном буфере рН 6,8 для катепсина Н, преинкубированного 2 минуты при 37С, добавляли 0,1 мл исследуемого материала. Реакционную смесь инкубировали при 37С 60 минут. Реакцию останавливали добавлением 2 мл холодного 0,1 М ацетатного буфера рН 4,0. Контролем служила проба, содержащая те же компоненты, за исключением исследуемого материала, который вносился в конце инкубации непосредственно после добавления ацетатного буфера рН 4,0.
Количество свободного 7-амидо-4-метилкумарина измеряли на при Хвхи Хвт, соответственно 360 нм и 440 нм против контроля. В качестве стандартного раствора использовали 7-амидо-4-метилкумарин (Sigma, США), растворенный в диметилсульфоксиде (Вектон, Санкт-Петербург). Активность ферментов в 1 мл гомогената рассчитывалась по формуле:
Для выявления аутокаталитического действия катепсинов в реакционную смесь, включающую 8 мМ ДТТ, 2 мМ ЭДТА и 0,1 мл исследуемого материала, преинкубировали в течение 15 минут при 37 С. После этого к ней добавляли 20 мкМ Na-CBZ-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin для катепсина В, N-CBZ-Phe-А -7-амидо-4-метилкумарина для катепсина L и Arg-7-amido-4-methylcoumarin для катепсина Н и инкубировали 60 минут при 37 С [5]. Аутокаталитическое действие катепсинов оценивалось по коэффициенту отношения значения активности фермента после прекаталитической инкубации к параллельно определяемому значению активности без преинкубации (К аса - коэффициент аутокаталитического действия).
Метод количественного определение цистатина С Содержание ингибитора лизосомальных цистеиновых протеиназ цистатина С проводили с использованием наборов иммуноферментного анализа для определения цистатина С Bio Vendor (Чехия). Оптическую плотность образцов оценивали с помощью планшетного ридера «OPSIS MR» (Швеция) при длине волны 450 нм. Результаты представляли в виде общей концентрации цистатина С в нг/мг белка.
Метод оценки окислительной модификации белков в тканях Для оценки окислительной модификации белков использовали определение уровня карбонильных производных по R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [29].
Метод оценки окислительной модификации белков основан на реакции взаимодействия карбонильных производных окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрировались спектрофотометрически. 1ЧОг+Н30 СООН 2,4-д и нитрофени л гид рази н 2,4-д инитрофенил гид разон Ход определения. Для анализа использовали неседиментируемую (цитоплазматическую) фракцию, полученную в результате ультрацентрифугирования гомогената тимуса и селезенки. Предварительно в материале осаждали нуклеиновые кислоты во избежание ошибочно завышенных показателей уровня карбонильных производных белков. Осаждение нуклеиновых кислот осуществляли с помощью 10% стрептомицина сульфата, в соотношении к гомогенату 1:9, экспозиция 15 минут при комнатной температуре. Далее центрифугировали в течение 10 мин при 800g и для работы использовали надосадочную жидкость.
При определении уровня карбонильных белков, образовавшихся при спонтанной окислительной модификации (спонтанная ОМБ), использовали 0,1 мл надосадочной жидкости, в которой осаждали белки 1 мл 20% трихлоруксусной кислоты, как в опыте, так и в контроле. Далее в опытную пробу вносили 1 мл 0,01 М 2,4-ДНФГ, растворенного в 2 М НС1, а в контрольную пробу - 1 мл 2 М НС1. Пробы инкубировали при комнатной температуре 1 час, затем центрифугировали в течение 15 мин при 1000 g. Полученные осадки промывали 3 раза смесью этанол (96%) - этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, не прореагировавшего с карбонильными группами окисленных белков. Полученные осадки высушивали для удаления оставшегося раствора этанол-этилацетат, а затем растворяли в 8 М растворе мочевины в объеме 3 мл, для лучшего растворения к осадкам добавляли 1 каплю 2 М НС1.
Определение карбонильных белков, образующихся по металл-катализируемому механизму (индуцируемая ОМБ), проводится аналогичным образом с предварительным добавлением к опытной и контрольной пробам по 0,1 мл 4x10"3 М FeS04, 1х10"3 М ЭДТА, ЗхЮ"4 М Н202 приготовленные ex tempore, при этом взаимодействие двухвалентного железа с перекисью водорода, способствует последующему образованию радикала ОН по реакции Фентона: Fe2++ Н202 = Fe3+ + ОН"+ ОН [12]
Внесение в инкубационную среду ЭДТА обеспечивает сохранение в растворе окисленной формы железа. Для тимоцитов и спленоцитов анализ осуществляли аналогичным способом.
Методы получения биологического материала для экспериментов in vitro
Влияние изолированного введения L-аргинина на формирование карбонильных производных белков L-аргинин представляет собой эндогенное соединение, из которого энзиматически образуется in vivo оксид азота. Тем не менее, путь метаболизма аргинина зависит от активности следующих ферментов: аргининдекарбоксилазы, аргиназы и NO-синтаз [9]. Как показывают результаты исследования, пероральное введение L-аргинина способствует дополнительному образованию метаболитов оксида азота, что может быть связано с доступностью субстрата для NO-синтаз в тимусе и селезенке крыс. Установленным фактом является вазодилататорное действие L-аргинина [59], с этим может быть связано и увеличение доставки аминокислоты, оксида азота и/или его метаболитов с током крови к иммунокомпетентным органам.
Под действием L-аргинина in vivo (рис. 29) и in vitro (рис. 31) общая площадь под кривой окислительной модификации белков селезенки не изменяется относительно контроля, однако спектр поглощения продуктов претерпевает изменения. Так, статистически значимо снижается содержание альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального характера и статистически значимо повышается содержание кетон-динитрофенилгидразонов основного характера. Полученная тенденция указывает на дифференцированный антиоксидантный и прооксидантный эффект L-аргинина.
Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков селезенки под влиянием L-аргинина
В условиях in vivo- и in wYro-моделирования дополнительного синтеза оксида азота субстратом L-аргинином доля первичных и вторичных маркеров селезенки статистически значимо не изменяется относительно контроля (рис. 30, Р = 0,045 р = 1,0 р = 0,36 р = 0,045 р=0,76 Примечание . - статистически значимые отличия относительной контроля (р 0,05) Рис. 31. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков спленоцитов под влиянием 5 мМ L-аргинина Доля первичных и вторичных маркеров окислительного стресса спленоцитов крыс в условиях in vzYro-моделирования дополнительного синтеза оксида азота, Me [min; max] В тимусе крыс, в свою очередь, проявляется четкий антиоксидантный эффект действия L-аргинина in vivo (рис. 33) и in vitro (рис. 35) - снижение количества альдегидных и кетонных форм. е.о.п./гбелка
Примечание . -статистически значимые отличия от контроля (р 0,05) Рис. 33. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков тимуса под влиянием L-аргинин in vitro
Состояние резервно-адаптационного потенциала динитрофенилгидразонов селезенки под влиянием L-аргинина Пероральное введение L-аргинина приводит к истощению резервно-адаптационного потенциала АДНФГ нейтрального характера и увеличению данного показателя АДНФГ основного характера тимуса относительно значений контрольной группы (рис. 39).
Для селезенки общая площадь под кривой окислительной модификации белков в экспериментальной группе сочетанного применения L-NAME на фоне L-аргинина ниже относительно группы L-NAME и не отличается от значений группы L-аргинин, что свидетельствует о корригирующем действии аргинина при использовании L-NAME в дозе 25 мг/кг (рис. 41) и в дозе 200 мг/кг (рис. 42).
Примечание. А - статистически значимые отличия от группы L-аргинина (р 0,05); А - статистически значимые отличия от группы L-NAME (200 мг/кг), р 0,05 Рис. 42. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков селезенки экспериментальной группы L-NAME (200 мг/кг) на фоне L-аргинина относительно группы L-NAME (200 мг/кг) и L-аргинин
Доля первичных и вторичных маркеров селезенки в экспериментальной группе, получавшей L-NAME (25 мг/кг или 200 мг/кг) на фоне L-аргинина статистически значимых различий не имеет относительно значений групп контроля и группы L-аргинин (табл. 6).
Однако, при сопоставлении полученных результатов экспериментальной группы крыс, получавших совместно L-NAME в дозе 25 мг/кг и L-аргинин, с результатами группы животных, получавших только L-NAME в дозе 25 мг/кг, отмечено статистически значимое снижение доли вторичных маркеров и увеличение первичных (табл. 6). Аналогичная тенденция отмечается при использовании L-NAME в дозе 200 мг/кг (табл. 6).
Для тимуса отмечалась несколько иная тенденция, чем для селезенки: при совместном применении L-NAME (25 мг/кг или 200 мг/кг) на фоне аргинина отмечено статистически значимое снижение значения общей площади под кривой спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков относительно значений контрольной группы (табл. 7). При использовании L-NAME в дозе 25 мг/кг статистически значимо снижается содержание альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера относительно значений контрольной группы (табл. 7), а при дозе L-NAME 200 мг/кг - статистически значимо снижается содержание динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера (табл. 7).
Характеристика окислительного карбонилирования белков под влиянием субстрата синтеза оксида азота - L-аргинина
В силу физико-химических свойств оксид азота выполняет роль универсального биологического месседжера. Универсальность действия N0 проявляется в способности регулировать многие физиологические и патофизиологические процессы. Однако, при рассмотрении конкретного действия отмечается двойственность проявления эффектов, например, оксид азота способен как индуцировать [9, 172], так и ингибировать окислительные процессы [170, 196]. Этот факт и ряд других причин позволяют называть молекулу N0 «двуликим Янусом» [172, 176]. В связи с этим, существует две стороны проблемы изучения биологии оксида азота в организме: исследование эффектов избыточной и недостаточной продукции данного вещества [9]. Обнаружение эндогенных ингибиторов синтеза оксида азота привлекает повышенное внимание к проблеме дефицита его образования. По этой причине, в нашем исследовании было изучено влияние 1Ч-нитро-Ь-аргининметилового эфира (L-NAME), представляющего экзогенный аналог эндогенного ингибитора N0-синтаз ассиметричного Ї ІЧ-диметиларгинина (ADMA), на состояние карбонильного статуса и лизосомального цистеинового протеолиза иммуннокомпетентных органов.
При оценке состояния карбонилированных белков в исследуемых моделях применяли разработанный нами способ комплексной оценки окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях, предоставляющий возможность более полного анализа полученных результатов. В условиях L-NAME-индуцированного дефицита синтеза оксида азота in vivo и in vitro общее содержание карбонилированных протеинов в селезенке нарастает. При этом для ткани тимуса in vivo применение L-NAME не оказало влияния ни на концентрацию метаболитов оксида азота, ни на количество карбонильных производных белков. Однако, оказалось, что изолированные тимоциты реагируют на воздействие L-NAME in vitro: изменения концентрации метаболитов оксида азота и общего содержания карбонильных производных белков аналогичны обнаруженным для селезенки. Таким образом, отсутствие изменений обсуждаемых показателей в тимусе in vivo может быть обусловлено малой биодоступностью препарата для данного органа, например, вызванной его капсулярным строением. Известно, что одним из основных путей образования модифицированных белков является прямое воздействие окислителей на аминокислотные остатки боковых радикалов [78]. Вероятно, в условиях дефицита синтеза оксида азота в спленоцитах и тимоцитах ведущей мишенью для повреждения становятся остатки аминокислот, обладающие основными свойствами, о чем свидетельствует обнаруженное нами нарастание содержания альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов основного характера.
Оксид азота относят к числу систем неферментативного контроля уровня активных форм кислорода [48], возможно, именно поэтому, в условиях моделирования дефицита синтеза N0 главным повреждающим агентом становятся активные формы кислорода. Кроме того, обнаруженные изменения могут быть следствием описанного для аналогичной модели [207] снижения активности антиоксидантной системы с нарушением баланса между процессами генерации и дезактивации активных форм кислорода.
Косвенная оценка возможностей антиоксидантной защиты белков может быть осуществлена с использованием показателя резервно-адаптационного потенциала [26, 52]. Нами обнаружено, что под влиянием L-NAME значение резервно-адаптационного потенциала в тимусе и селезенке снижается, что может не только свидетельствовать об истощеннии антиоксидантных систем, но и демонстрировать доступность белковых молекул к повреждающему действию, обусловленную денатурацией молекул [17].
Исследование соотношения первичных (АДНФГ) и вторичных (КДНФГ) маркеров окислительного стресса дает возможность оценить стадию и потенциальную обратимость развития окислительного стресса [52, 53]. Так, под влиянием L-NAME в спленоцитах и ткани селезенки наблюдается увеличение доли вторичных маркеров окислительного стресса относительно значений контрольной группы, что свидетельствует об усугублении окислительного стресса и переходе его в позднюю стадию. Однако, в тимоцитах, несмотря на нарастание общего количества карбонильных производных белков, соотношение первичных и вторичных маркеров не изменяется относительно контроля, что может подтверждать тезис о высоких адаптационных способностях тимуса [14].
Внутриклеточный уровень окисленных белков отражает баланс между процессами формирования карбонильных белков и степенью их деградации протеолитическими системами [12]. Существует предположение, что появление на поверхности белковых молекул гидрофобных групп является пусковым фактором повышения протеолитической чувствительности [17]. Известно, что протеиназы, разрушающие окисленные белки, более селективны к поврежденным основным аминокислотным остаткам [105], нарастание которых было нами обнаружено в условиях дефицита синтеза оксида азота.
Для оценки вклада лизосомального протеолиза в метаболизм модифицированных белков нами было предпринято изучение активности катепсинов в условиях изменения уровня метаболитов синтеза оксида азота.
В условиях in vivo- и in vitro-ингибирования синтеза NO общая активность лизосомальных цистеиновых протеиназ (катепсинов В, L, Н) возрастает. Исследование in vivo показывают, что данное нарастание происходит преимущественно за счет внелизосомальной фракции. Представленный факт указывает на то, что одним из эффектов L-NAME является увеличение выхода лизосомальных протеиназ в цитоплазму. Данный феномен может происходить по двум причинам: благодаря секреции сквозь лизосомальную мембрану или её повреждению [22, 36, 57]. Внутриклеточное высвобождение лизосомальных ферментов вследствие лабилизации мембраны отражает повреждения лизосом [38]. Почти все ферменты лизосомального матрикса и большинство ферментов, встроенных в мембрану лизосом, относятся к группе кислых гидролаз. К наиболее изученным ферментам относится типичный маркерный фермент лизосом - кислая фосфатаза, большая часть активности которой связана с лизосомами [36]. Для оценки причины нарастания активности катепсинов в цитоплазме был произведен анализ коэффициента доли внелизосомальной фракции в общей активности кислой фосфатазы как показатель повреждения лизосомальной мембраны [36].