Введение к работе
Актуальность темы
Геронтологические исследования являются приоритетным направлением
современной биологии и медицины. Согласно свободно-радикальной теории старения, старение организмов и связанные с ним болезни обусловлены накоплением повреждений в важнейших клеточных макромолекулах свободными радикалами, oбразующимися в целом ряде биохимических процессов (главным образом, в митохондриях) или под действием внешних факторов (радиация, ксенобиотики и др.) (Harman, 1994; Beckman and Ames, 1998). В отличие от липидов и ДНК, окислению которых посвящается большинство публикуемых в настоящее время работ, свободно-радикальное повреждение белков гораздо менее изучено, хотя описан целый ряд модификаций аминокислотных остатков (Stadtman, 1995; Dean et al., 1997). Вместе с тем, накопление окислительных повреждений в белках может сильно и достаточно быстро нарушить клеточный метаболизм, поскольку, как показывают эксперименты in vitro, окисление нарушает структуру и конформацию белковой молекулы, ее электрический заряд, гидрофобность и связывание лигандов, а также, в случае ферментов, снижает их активность (Fucci et al., 1983; Giulivi et al., 1994). Показано, что содержашіе окисленных белков в клетках животных повышается с возрастом, при различных патологиях и в условиях модельного окислительного стресса (Oliver et al., 1987; Starke-Reed and Oliver, 1989; Sohal et al., 1993). Однако, корреляция между зровнем окислительных повреждении в белках и изменением их свойств при старении или окислительном стрессе in vivo изучена недостаточно. Чувствительность белков к окислительной модификации может различаться (Agarwal and Sohal, 1995; Cabiscol and Levine, 1995; Yan et al., 1997). Выявление предпочтительных мишеней для свободных радикалов в клетке необходимо для понимания механизмов парушения ее метаболизма при старении.
Одной из причин иакопле1шя окисл1нных белков в тканях старых животных может быть сігижеіше активности протеаз, их расщепляющих. Однако, литературные дашгые весьма противоречивы: показано как снижение протеолитической активности (Starke-Reed and Oliver, 1989), так и отсутствие ее изменений в тканях животных с возрастом (Sahakian et al., 1995), что указывает на необходимость дальнейшего изучения данного вопроса.
Значительный интерес представляет поиск и идентификация протеаз, специфичных к окисленным белкам, особенно, способных избирательно расщеплять собственные белки ' организма; выевобождающиеся из гибнущих клеток при патологических состояниях (например, воспаление) и, таким образом, предотвращать развитие аутоиммунного ОтЕета (гипотеза "рестрикциоїшьіх" протеаз (Lefkovits, 1986)). Изучение изменения активности таких протеаз с возрастом может пролить свет на некоторые аспекты нарушения иммунологической толераштности и
повышения аутореактивности при старении.
Цель и задачи нсследования
Целью настоящего исследования явилось изучение накопления окислительных
повреждений белков в тканях лабораторных грызунов разного возраста, а также под действием окислительного стресса, вызванного у-облучением животных, выявление корреляции между окислительным повреждением белков и изменением их свойств in vivo, а также изучение изменения активности протеаз, расщепляющих окисленные белки, с возрастом.
В этой связи были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить чувствительность белков различных субклеточных фракций печени и
селезенки крыс к окислительному повреждению (по уровню карбонильных групп) с
возрастом и под действием у-радиацни.
-
Изучить корреляцию между содержанием окисленных белков в тканях и изменением их свойств (антигешюсти и доступности для протеолиза) in vivo.
-
Исследовать возможность предотвращения накопления окисленных белков и изменения их свойств в тканях у-облученных животных диетическими антиоксидангами и витаминами.
4. Исследовать возможность пострадиационной активации протеаз в
субклеточных фракциях тканей грызунов.
-
Изучить роль нейгрофилов как предполагаемых источников "рестрикционных" протеаз: исследовать их специфичность по отношению к различным белковым субстратам, в том числе, к окисленным in vitro и выделенным из старых животных.
-
Изучить изменение функциональпой активности нейгрофилов (способности к активации "респираторного" взрыва и активности протеаз) с возрастом.
Научная новизна н практическая ценность работы
Проведишые исследования впервые продемонстрировали различную чувствительность субклеточных фракции к окислительному повреждению при старении и под действием у-радиации. Показана возможность предотвращения окислительного повреждения белков под действием у-облучешю введением дополнительных количеств аштиоксидшггов и витаминов в диету. Продемонстрирована пострадиационная акпшация протеаз в субклеточных фракциях тканей грызунов. Полученные данные могут быть использованы для разработки подходов к предотвращению накопления окисленных белков при старении v различных патологиях. Впервые исследовано расщепление различных субстратог протеазами нейгрофилов и показано, что они гораздо более эффективно расщепляют белки из близкородственных видов, что не противоречит гипотезе "рестрикционных' протеаз, а также проявляют специфичность по отношению к белкам модифицировашшм в системе металл-катализируемого окисления. На основаних получешшгх экспериментальных датшх впервые предложено объяснение причіп
нарушения иммунологической толерантности с возрастом с позиций свободно-радикальной теории старения и гипотезы "рестрикционных протеаз".
Аппобация
Материалы диссертации докладывались па Ш и IV чтениях, посвященных памяти академика ЮЛ. Овчинникова (Москва - Пущшю, 1996 и 1998), конференции Геронтологического общества "Старение и долголетие: системный и междисциплинарный подходы" (Москва, 1997), I Международном симпозиуме "Фундаме1ггальньїе науки и альтернативная медицина" (Пущино, 1997), Третьем съезде но радиационным исследованиям (Москва, 1997), IV Международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине и технологии" (Украина, Ялта - Гурзуф, 1998), Ш Пущинской конфереіщии молодых ученых (Пущино, 1998), на заседании научного коллоквиума ФИБХ РАН (1998) и научного семинара ИБК РАН (1999).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и ряд тезисов.
Стпуктупа и объем дпссертации
Диссертация включает в себя введение, обзор литературы по данной теме (из трех
глав), описание материалов и методов, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список литературы, содержащий 339 наименований. Работа изложена па 135 стр. машинописного текста и содержит 18 рисунков и 6 таблиц.
Список сокращений
ABC - смесь ахтиоксидантов и витаминов; АФ - адьювант Фрейнда; АФК -активные формы кислорода; 2,4-ДНФГ - 2,4-дишпрофешілгидразин; НСТ -нитросиний тетразолиевый; ПОЛ - перекисное окисление липидов; РБП -растворимые белки печени; FITC - флуоресцеїні изотаоцианаг, HSA - человеческий сывороточный альбумин; OVA - овальбумин; РМА - форболмиристатацетат.