Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Кобылье молоко и вырабатывавши из него кумыс являются ценными лечебно-диетическими продуктами. Получение кобыльего молока и кумыса осуществляется в весенне-летний период, хотя специализированные санатории должны снабжаться этими продуктами круглогодично. Преодолеть сезонность в производстве кобыльего молока позволяет сублимационная сушка его в летний период, когда избыток молока обеспечивает его заготовку и хранение впрок. Важность увеличения производства лечебно-диетических продуктов подчеркивается в "Основных направлениях экономического и социального развития СССР на 1986-1999 годы...", где поставлена задача "Значительно расширить производство продуктов детского и диетического питания, продуктов, обогащенных витаминами, белковыми и другими компонентами повышенной биологической и пищевой ценности".
Отличительная особенность жира кобыльего молока - высокое содержание эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот (ІШК). Это повышает биологическую ценность кобыльего молока, однако является причиной быстрого его окисления. Применение эффективных и безвредных антиоксидантов, ингибирующих перекисное окисление липидов кобыльего молока, могло бы решить проблему хранения сухого продукта.
Полиненасыщенные жирные кислоты играют роль незаменимых компонентов при биосинтезе липидов клеточных мембран и биологически активных веществ - эйкозаноидов. О степени соответствия пищевого жира целям метаболических потребностей организма можно судить по результатам исследования жирнокислотного состава и функций биомембран (А.А.Покровский, 1973; М.М.Левачев, 1978,1986). Предполагается, что хранение сухого кобыльего ш-
лока сопровождается окислением липидов, которые, попадая в ткани и органы животного организма, могут входить в структуру биомембран, изменяя их функциональные свойства.
Решение вопроса о сроках хранения сублимированного кобыльего молока связано, с одной стороны, с необходимостью познания процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), развивающихся в продукте, и применением аятиоксидантов (АО) для снижения их интенсивности. С другой стороны, - с биологической оценкой степени соответствия липидов сублимированного кобыльего молока длительного срока хранения с антиоксидантами и без них метаболическим потребностям организма в пластическом материале липидной природы. В связи с этим особое внимание обращается на обеспеченность органов эссенциальными ШШК, состояние перекисного окисления липидов в организме и выработку критерия оценки безопасности продукта.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Оценить влияние жира сублимированного кобыльего молока при хранении с антиоксидантами и без них на показатели обмена липидов организма, определить степень его соответствия метаболическим потребностям организма в обеспечении пластической функции липидов в опытах на крысах.
охарактеризовать липидный состав и состояние перекисного окисления липидов сублимированного кобыльего молока при длительном хранении с добавкой антиоксидантов;
выяснить влияние липидов молока, стабилизированного и не стабилизированного антиоксидантами, на особенности липидно-го и жирнокислотного состава печени, плазмы крови, стромы эри-троцитов крыс;
установить влияние жира молока, стабилизированного и не стабилизированного антиоксидантами, на состояние перекисного
окисления липидов печени, плазмы крови, строїш эритроцитов;
определить возможные сроки хранения продукта, стабилизированного антиоксидантами и без них;
дать оценку возможности применения методов анализа перекисного окисления липидов молока в санитарном контроле.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые в эксперименте на крысах установлено, что жир сублимированного кобыльего молока, обеспечивая высокий уровень метаболизации незаменимых линоленовой и лино-левой жирных кислот, способен обогащать лшгады тканей и клеточных мембран ПНЖК и) 3. При этом не происходит изменения интенсивности перекисного окисления липидов в организме.
Уточнено, что гипохолестеринемические свойства, присущие кобыльему молоку и кумысу, определяются значительным содержанием линоленовой кислоты в жире молока. Кроме того, этот жир стимулирует лейкоцитопоэз.
Впервые изучена динамика перекисного окисления липидов сублимированного кобыльего молока при длительном хранении по накоплению перекисных продуктов, уменьшению доли ШШК, увеличению параметров хемилюминесценции.
Доказано, что потребление окисленного жира сублимированного кобыльего молока длительного хранения снижает эффективность метаболизации алиментарных предшественников в полиено-вые жирные кислоты биомембран, влияет на активность перекисного окисления липидов в мембранах, что обусловлено, по-видимому, накоплением перекисных продуктов в период хранения сухого молока.
Показана эффективность применения антиоксидантов для уменьшения и даже полного ингибирования процессов перекисного окисления липидов при хранении сухого молока, благодаря чему удалось предотвратить нежелательные для организма изменения,
связанные с потреблением окисленного жира сублимированного кобыльего молока.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Результаты работы позволили оценить перекисное окисление липидов сублимированного кобыльего молока как фактор, снижающий биологическую ценность продукта и отрицательно влияющий на антиоксидантний статус организма.
Была выяснена возможность замедления и даже полного инги-бированзя перекисного окисления липидов молока с помощью антиоксидантов, т.е. установлены условия для длительного хранения продукта. Показаны сроки, в течение которых сухое молоко сохраняет свои высокие качества как при хранении без антиоксидантов, так и в их присутствии.
Полученные данные являются биохимическим обоснованием целесообразности применения кобыльего молока как биологически ценного лечебно-диетического продукта и расширяют область его использования.
Определение перекисной резистентности эритроцитов можно рекомендовать для выявления изменений отрицательного характера в организме людей, постоянно употребляющих сухие молочные продукты после длительного хранения.
Разработан метод, основанный на применении хемилюминес-ценции, который позволяет выявить ранние нарушения перекисного окисления липидов в молочных продуктах, в частности, в сублимированном кобыльем молоке.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИОСЕРТАДИИ. ЙЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ;
I. Вир сублимированного кобыльего молока при включении в рацион животных способен обогащать липиды тканей и мембран клеток полиненасыщенными жирными кислотами семейства иЗ, обеспечивая высокий уровень метаболизации эссенпиальных жирных
кислот и не изменяя интенсивности перекисного окисления тканевых липидов.
-
Антиоксидант кверцетин и бисалкофен, ингибируя процессы перекисного окисления лшшдов в сублимированном кобыльем молоке, стабилизируют липидный и жирнокислотный состав продукта при длительном хранении.
-
Скармливание окисленного жира сублимированного кобыльего молока вызывает ускорение процессов перекисного окисления липидов в плазме крови и эритроцитарных мембранах. Выраженность этой активации определяется степенью окисленности потребляемого жира.
-
Метод регистрации хемилюминесценции может применяться для раннего выявления ускорения процессов перекисного окисления липидов в сублимированном кобыльем молоке.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на первой научной конференции ЦНИИ ЫМИ, посвященной вопросам клинической и теоретической медицини (г.Уфа, 1983 г.); Республиканской конференции 'Толь молодых ученых и специалистов в развитии научно-технического прогресса" (г.Уфа, 1986 г.); П Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (г.Москва, 1986 г.); Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов" (г.Алма-Ата, 1987 г.); межкафедральной конференции в Башгосыединституте (г.Уфа, 1989 г.); научной конференции отдела биохимии и физиологии Института питания АМН СССР (г.Москва, 1989 г.).
ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации отражены в 8 публикациях.
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, раздела собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомевдаций, внедрения резуль-
татов исследования в практику и указателя литературы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает 196 источников, из них 143 отечественных и 53 зарубежных автора.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Перед сублимационной сушкой в свежее летнее молоко добавляли кверцетин и бисалкофен из расчета 0,02 г на 100 г кира молока {при 1,5 % жирности молока на I л вносили 0,003 г антиоксиданте). Кверцетин (3,5,7,3 ,4і--пентаоксифлавон) утвержден Фармкомитетом СССР 30 июня 1971 г. как витаминное средство. Бисалкофен [2,2 -метилен-бис-(4-метил--6-трет-бутилфенол)] , практически нетоксичен, разрешен Главным санитарно-эпидемиологическим управлением МЗ СССР (08.09.64 г. И I23-S/I35) в качестве термостабилизатора пластмасс, предназначенных для контакта с пищевыми продуктами, питьевой водой, изготовления детских игрушек. Сушка 450 л (19 партий) кобыльего молока осуществлялась на установках ТГ-50 согласно ТУ 49802--80, разработанным НПО "Комплекс" (г.Москва). Анализ сублимированного молока проводили сразу после сушки и через 3,6,9 и 12 месяцев хранения. Исследовали одновременно контрольные образцы, хранившиеся без антиоксидантов, и опытные образцы, хранившиеся с кверцетином и бисалкофеном.
Эксперименты на животных имели своей целью оценить влияние липидов сублимированного кобыльего молока разного срока хранения, стабилизированного и не стабилизированного антиокси-дантами, на ПОЛ тканей и эритроцитарных мембран крыс, на жирно-кислотный состав липидов печени, плазмы крови и стромы эритроцитов. Опыты проводили на 120 растущих крысах-самцах. Исходная масса тела 56,7±2,0 г. Полноценный искусственный рацион включал: белок (казеин) - 24 %, углеводы (маисовый крахмал) - 56 %, жир - 15 %, необходимые минеральные элементы и витамины. Рацио-
ны различались только жировым компонентом. Опытные группы жи-вотных получали жир, выделенный из сублимированного кобыльего молока, хранившегося в течение 3 месяцев без антиоксидантов (I группа), с добавлением кверцетина (П группа) или бисалкофена (Ш группа), хранившегося в течение 9 месяцев без АО (17 группа), стабилизированного кверцетином (У группа) или бисалйофеном (71 группа). Контрольная группа (УЇЇ) получала смесь лярда и подсолнечного масла в соотношении 2:1. Длительность эксперимента 6 недель. По окончании опыта животные забивались декапитапией после эфирного наркоза.
В работе были использованы следующие аналитические методы. В молоке определяли сухое вещество по ГОСТ 3626-73, общую кислотность - по ГОСТ 3624-67, рН - на иономере, общий жир - по ГОСТ 8764-73, влажность сухого молока - по ГОСТ 8764-73, общую окисленность исследовали по Моннину и Шетти в модификации Л.С. Толстухиной (1982 г.). Интенсивность свободнорадикальных процессов при хранении сублимированного кобыльего молока оценивали методом регистрации хемилюминеспенпии, индуцированной ионами двухвалентного железа, на специальной установке (Ю.А.Владимиров, 1972). Мембраны эритроцитов выделяли из цитратной крови. После отделения плазмы, эритроцитарную массу промывали триады физиологическим раствором, эритроциты подвергали осмотическому шоку, снова промывали физраствором, содержащим I мМ ЭДТА, мембраны отделяли центрифугированием при 16 тыс. г в течение 30 минут. Полученный осадок стромы использовали для дальнейших аналитических работ.
Выделение липидов из сухого молока, плазмы крови, стромы эритроцитов, печени крыс проводили по оригинальному методу J.Poloh et ai. (1957 г.). Экстракты обрабатывали в атмосфере азота. В липидных экстрактах определяли диеновые и триено-
вые жирные кислоты с коньюгированныш двойными связями (Инструкция ВНЙЙЖ, 1962 г.; П.В.Кугенев, Н.В.Барабанщиков, ред., 1975 г.). Метиловые эфиры жирных кислот получали по методу Stoffel et ai. (1959). Жирнокислотный состав липидов молока, плазмы крови, стромы эритроцитов определяли методом газохроматического анализа метиловых эфиров жирных кислот на хроматографе "inter-amat" igs -131 с плазменно-ионизационным детектором. Использовали набивную колонку 0,4x200 см, наполненную 10 % silar 10-С на хромосорбе w /Aw . Температура колонки, детектора и инжектора была равна 175, 220 и 240 соответственно. Идентифицировали жирные кислоты путем сравнения со стандартными смесягли жирных кислот. Содержание индивидуальных жирных кислот выражали в процентах от общего количества жирных кислот.
3 экстрактах по Фолчу после вакуумной отгонки растворителя определяли содержание фосфолипидов (А.А.Покровский, ред.,1969), холестерина (А.А.Покровский, ред., 1969), общего жира (В.Г.Колб и соавт., 1982). Накопление малонового диальдегида в гомогенате печени определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (И.Д. Стальная и др., 1977). Количество малонового диальдегида рассчитывали в мкМ/мг белка. Белок в гомогенате определяли методом Lowry et al. (1957). Содержание гемоглобина определяли циангемоглобиновым методом. Количество эритроцитов и лейкоцитов - подсчетом в камере Горяева (Л.В.Козловская и соавт., 1984).
Функциональное состояние мембран эритроцитов крыс оценивали по перекисной резистентности эритроцитов, определяемой микрометодом (А.А.Покровский и соавт., 1964).
Коэффициент эффективности метаболизации эссенциальных жирных кислот эритроцитов подсчитывали по формуле (А.А.Покровский, М.М.Левачев, 1973,1977):
20:4
кэм =
(20:3)+(20:5)+(22:3)+(22:4)+(22:5)+(22:6)
Для гистологических исследований были взяты печень и семенники. Материал фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина и жидкости Карнуа с последующим заключением в парафин и целлоидин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, на ДНК - по Браше, на гликоген и нейтральные мукополисахариды - по Шабадашу.
Результаты обработали вариационно-статистически на ЭВМ. Достоверность оценивали с использованием показателей t и р Стьгадента-Фишера.