Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Внеклеточные везикулы 16
1.1.1 Внеклеточные везикулы клеток млекопитающих - экзосомы и микровезикулы 17
1.1.2 Молекулярный механизм формирования микровезикул 20
1.1.3 Теория паракринной стимуляции регенерации стволовыми клетками и
участие внеклеточных везикул в регенерации и ангиогенезе 25
1.1.4 Концепция бесклеточной терапии на основе внеклеточных везикул 28
1.1.5 Применение внеклеточных везикул для диагностики и терапии
заболеваний 30
1.1.6 Ограничения терапевтического применения внеклеточных везикул 32
1.2 Химическое соединение - цитохалазин В 34
1.2.1 История открытия и структура цитохалазина B 34
1.2.2 Механизм действия цитохалазина В 35
1.2.3 Применение цитохалазина В 38
1.2.4 Получение мембранных везикул с помощью цитохалазина В 41
1.3 Заключение по обзору литературы 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1 Методы работы с мембранными везикулами клеток человека 46
2.2.1 Получение мембранных везикул от клеток человека, обработанных цитохалазином В 46
2.2.2 Приготовление мембранных везикул для анализа методом динамического рассеяния света 46
2.2.3 Приготовление мембранных везикул для анализа методом полимеразной цепной реакции 47
2.2.4 Приготовление мембранных везикул и проведение трансмиссионной электронной микроскопии 47
2.2.5 Приготовление мембранных везикул и проведение сканирующей электронной микроскопии 48
2.2.6 Окрашивание мембранных везикул Phalloidin, специфичным к актину 49
2.2.7. Детекция процесса синтеза белка 49
2.2.8. Подготовка мембранных везикул для исследования стабильности при разных условиях хранения 50
2.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами 51
2.2.1 Выделение тотальной ДНК 51
2.2.2 Выделение плазмидной ДНК 51
2.2.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 52
2.2.4 Электрофорез в агарозном геле 54
2.3 Методы работы с белками 54
2.3.1 Выделение тотального белка 54
2.3.2 Измерение концентрации белка методом бицинхониновой кислоты 55
2.3.3 Иммуноблоттинг 56
2.3.4 Мультиплексный анализ 57
2.4. Методы работы с прокариотическими клетками 58
2.4.1 Культивирование бактериальных клеток 58
2.4.2 Трансформация бактериальных клеток 58
2.4.3 Криоконсервация бактериальных клеток 59
2.5 Методы работы с эукариотическими клетками 59
2.5.1 Культуры клеток человека, культивирование клеточных культур 59
2.5.2 Пассирование клеточных культур 61
2.5.3 Криоконсервация клеточных культур 62
2.5.4 Исследование размера клеточных компонентов методом проточной
цитофлуориметрии с использованием калибровочных частиц 62
2.5.5 Трансфекция культуры клеток человека 63
2.5.6 Окрашивание цитоскелета клеток человека 63
2.5.7 Иммуноокрашивание клеток человека 64
2.5.8 Окрашивание мембранными красителями клеток человека 64
2.5.9 Окрашивание клеток человека красителем CFDA SE 65
2.6 Оценка процесса слияния и переноса содержимого мембранных везикул в клетку-реципиента in vitro 66
2.6.1 Нанесение мембранных везикул, полученных с помощью цитохалазина В, на клетки-реципиенты 66
2.6.2 Оценка количества клеток-реципиентов, обладающих флуоресценцией, и средней интенсивности флуоресценции методом проточной цитофлуориметрии 67
2.7 Оценка проангиогеного потенциала in vitro и in vivo 68
2.7.1 Формирование капилляро-подобных структур эндотелиальными клетками пупочной вены человека на матриксе Matrigel in vitro 68
2.7.2 Подкожная инъекция мембранных везикул и клеток человека в матриксе Matrigel лабораторным животным Rattus norvegicus 69
2.7.3 Гистологическое исследование 69
2.8 Статистическая обработка результатов 70
ГЛАВА 3. Результаты исследований 71
3.1 Получение, исследование размера и молекулярного состава мембранных везикул 71
3.1.1 Характеристика состава фракций, получаемых в процессе выделения мембранных везикул 71
3.1.2 Исследование размера и морфологии мембранных везикул полученных с помощью цитохалазина В 75
3.1.3 Исследование структуры актинового цитоскелета в клетках, обработанных цитохалазином В, и в мембранных везикулах 78
3.1.4 Исследование наличия генетического материала в составе мембранных везикул, полученных с помощью цитохалазина В 80
3.1.4 Исследование процесса синтеза белка внутри мембранных везикул, полученных с помощью цитохалазина В 82
3.2 Исследование взаимодействия и механизма доставки содержимого мембранных везикул в клетку-реципиента 84
3.2.1 Исследование включения мембранного компонента везикул в состав цитоплазматической мембраны клетки-реципиента 84
3.2.2 Исследование переноса трансмембранных белков клетке-реципиенту посредством мембранных везикул 87
3.2.3 Исследование переноса содержимого мембранных везикул в клетку-реципиента 92
3.3 Исследование проангиогенных свойств мембранных везикул, полученных от клеток, обладающих повышенной ангиогенной активностью 100
3.3.1 Исследование способности мембранных везикул индуцировать формирование капилляро-подобной сети эндотелиальными клетками пупочной вены человека на матриксе Matrigel in vitro 100
3.3.2 Исследование молекулярного состава мембранных везикул на наличие проангиогенных факторов 103
3.3.3 Исследование способности мембранных везикул индуцировать ангиогенез in vivo 108
3.4 Оценка стабильности мембранных везикул мезенхимных стволовых клеток человека 114
ГЛАВА 4.Обсуждения результатов 119
Заключение 140
Выводы 144
Список сокращений 146
Список использованной литературы 148
- Молекулярный механизм формирования микровезикул
- Приготовление мембранных везикул для анализа методом полимеразной цепной реакции
- Формирование капилляро-подобных структур эндотелиальными клетками пупочной вены человека на матриксе Matrigel in vitro
- Исследование взаимодействия и механизма доставки содержимого мембранных везикул в клетку-реципиента
Молекулярный механизм формирования микровезикул
Пул внеклеточных везикул неоднороден и включает в себя экзосомы и микровезикулы. Отдельную группу везикул, окруженных цитоплазматической мембраной (ЦПМ) клетки, представляют апоптозные тельца, которые образуются в результате программируемой клеточной гибели. Апоптозные тельца в отличие от экзосом и микровезикул обладают относительно крупными размерами (1000-5000 нм) и имеют иное биологичекое значение (van der Pol et al., 2012). Экзосомы – это внеклеточные везикулы, обладающие размером от 40 до 150 нм (Simpson et al., 2009; Raposo et al., 2013; Ji et al., 2014). Экзосомы являются внеклеточными везикулами эндосомного происхождения. Подтверждением этого является отсутствие в мембране экзосом стандартных ЦПМ белков и наличие белков, характерных для эндоцитозной системы клетки (Thery et al., 2002). Методом трансмиссионной электронной микроскопии было установлено, что экзосомы происходят из внутриклеточных мультивезикулярных телец, которые сливаются с ЦПМ клетки с высвобождением интралюминальных везикул – экзосом во внеклеточную среду (Рисунок 1). В то же время возможно созревание мультивезикулярных телец с образованием лизосом (Рисунок 1) (Choi et al., 2012; van der Pol et al., 2012).
Микровезикулы – мембранные везикулы гетерогенного размера (от 40 до 2000 нм по разным данным), отделяющиеся от поверхности клеток (van der Pol et al., 2012; Akers et al., 2013). Микровезикулы заключают внутри себя цитозольные компоненты, такие как ферменты, факторы транскрипции, молекулы РНК, митохондриальной ДНК (Guescini et al., 2010; Guescini et al., 2010), полученные ими от родительских клеток (VanWijk et al., 2003; Hugel et al., 2005). Несмотря на то, что механизм образования и биохимический состав экзосом и микровезикул отличаются, их физические параметры близки и перекрываются, поэтому разделение экзосом и микровезикул представляет сложную задачу. Использование стандартных методов выделения, основанных на центрифугировании, не позволяет получить чистые фракции экзосом и микровезикул. По этой причине зачастую исследователи для обозначения исследуемого объекта используют общий термин – внеклеточные везикулы (Choi et al., 2012; Choi et al., 2015).
Состав внеклеточных везикул зависит от типа клетки-родителя и стимула, вызвавшего их образование (Jimenez et al., 2003; Leroyer et al., 2010). Основными белками, входящими в состав везикул, являются цитоплазматические белки, белки цитоскелета (актин, тубулин и другие), поверхностные рецепторы (Choi et al., 2013). Липидный компонент внеклеточных везикул обогащен фосфатидилсерином, фосфатидилхолином, Рисунок 1 - Схема образования внеклеточных везикул клеток животных. 1 – образование экзосом, 2 – образование микровезикул. сфингомиелином, ганглиозидом и холестеролом (Choi et al., 2013). Valadi et al. установили, что экзосомы тучных клеток мыши (линия клеток MC/9) и человека (линия клеток HMC-1) содержат микроРНК и мРНК 1300 генов, которые могут быть транслированы в аминокислотную последовательность in vitro (Valadi et al., 2007). Обнаружено, что помимо микроРНК и мРНК внеклеточные везикулы несут небольшое количество 18S и 28S рибосомных РНК (Miranda et al., 2010), а также митохондриальную ДНК (Guescini et al., 2010). Однако вопрос о том, происходит ли включение нуклеиновых кислот и белков во внеклеточные везикулы случайно или существуют механизмы специфичного сортинга, остается открытым. С целью обобщения данных о молекулярном составе внеклеточных везикул, количество которых продолжает стремительно расти, были созданы базы данных – EVpedia (http://evpedia.info) и ExoCarta (http://exocarta.org), которые содержат информацию обо всех обнаруженных во внеклеточных везикулах молекулах. ExoCarta содержит информацию о внеклеточных везикулах клеток млекопитающих, а EVpedia включает информацию о внеклеточных везикулах всех эукариот и прокариот (Choi et al., 2013). Кроме того, было создано Международное общество внеклеточных везикул, которое предложило стандартизировать процедуру выделения везикул, что позволило бы сравнивать данные, получаемые разными исследовательскими группами (Witwer et al., 2013).
Функции внеклеточных везикул в организме многообразны и определяются их составом. Например, известно участие тромбоцитарных микровезикул в свертывании крови, а эндотелиальных микровезикул – в ангиогенезе (Leroyer et al., 2010). Кроме того, обнаружено участие микровезикул в модуляции иммунного ответа; антигенной презентации; переносе сигнальных молекул; стимуляции ангиогенеза; переносе генетической информации, что может выступать в качестве посттранскрипционной регуляции экспрессии генов; росте и метастазировании опухоли путем стимуляции ангиогенеза и переноса онкогенов (van der Pol et al., 2012); распространении патогенов (Mack et al., 2000; Rozmyslowicz et al., 2003; Миллер Г. Г. и др., 2015).
Молекулярный анализ выявил обогащение определенных мембранных липидов и поверхностных белков в составе естественных микровезикул. Было обнаружено, что микровезикулы моноцитов крови и клеточной линии моноцитов (THP-1) несут поверхностные белки - тканевой фактор и гликопротеиновый лиганд-1 P-селектина и у них отсутствует поверхностный белок CD45 (Del Conde et al., 2005). Так как в ЦПМ моноцитов такое распределение поверхностных белков характерно для определенных областей мембраны, обгащенных холестеролом (липидных рафтов), было сделано заключение, что формирование микровезикул происходит в области рафтов (Del Conde et al., 2005). Подтверждением высказанного авторами предположения служит уменьшение высвобождения клеткой микровезикул в результате снижения количества холестерола в ЦПМ (Del Conde et al., 2005). Согласно теории «липидных рафтов» ЦПМ клетки состоит из жидкостно неупорядоченной фазы (от англ. Ld - liquid-disordered), содержащей ненасыщенные глицерофосфолипиды, и жидкостно-упорядоченой фазы (от англ. Lo - liquid-ordered), содержащей насыщенные сфинголипиды и холестерол (Плескова С.Н. и др., 2015). Lo-фаза формируется благодаря стремлению холестерина встроиться в область гидрофобных насыщенных ацильных цепей сфинголипидов (Kaiser et al., 2009) и представляет собой «остовки» гелевой консистенции в жидкой Ld-фазе. Однако область ЦПМ, где преимущественно происходит формирование микровезикул остается спорной, так как другими авторами было обнаружено повышенное высвобождение микровезикул при снижении количества холестерола в ЦПМ клетки, а также при повышении окружающей температуры, что приводит к повышению текучести мембраны, то есть к преобладанию Ld-фазы мембраны (Gonzalez et al., 2009). В то же время нельзя недооценивать роль изгиба мембраны в процессе формирования везикул (McMahon et al., 2005). В настоящее время установлено, что формирование изгиба мембраны клетки обеспечивается белковыми молекулами и липидами, входящими в состав мембраны. Цитоскелет клетки способен вызывать изгиб мембраны с последующим формированием выпячиваний, псевдоподий, выростов, учавствующих в фагоцитозе. Белковые молекулы, обладающие конической формой и входящие в состав мембраны, также вызывают изгибание мембраны (Hanzal-Bayer et al., 2007). Периферические мембранные белки динамин, клатрин, покровные белки I и II (от англ. coat protein - COP), белки, содержащие bar-домены, сближают удаленные участки, формируя изгиб мембраны (McMahon et al., 2005).
Приготовление мембранных везикул для анализа методом полимеразной цепной реакции
Для измерения концентрации тотального белка, выделенного из клеток/МВ-ЦВ человека, использовали метод бицинхониновой кислоты. Сущность метода заключается в восстановлении белковыми молекулами ионов Cu2+ до Cu+ в щелочной среде, которые в свою очередь реагируют с бицинхониновой кислотой (одна молекула Cu+ с двумя молекулами бицинхониновой кислоты) с образованием продукта пурпурного цвета. Продукт имеет максимум поглощения при длине волны 562 нм. Чем больше белка находится в образце, тем насыщеннее его цвет и тем большей абсорбирующей способностью он обладает (Невмержицкая Ю.Ю. и др., 2012).
Реакцию проводили с использованием коммерческого набора Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific, США). Для приготовления рабочего раствора, смешивали Реагент А (раствор, содержащий бицинхониновую кислоту, карбонат натрия, тартрат натрия, бикарбонат натрия в 0,1н NaOH pH 11,25) и Реагент Б (4% CuSO4x5H2O) в соотношении 50:1. Смешивали 25 мкл исследуемого образца и 200 мкл рабочего раствора. Смесь инкубировали при 37С в течение 30 минут. Через 30 мнут вынимали образец из термостата, дожидались, когда температура образца сравняется с комнатной температурой и измеряли уровень абсорбции при 562 нм. Для определения концентрации белка в исследуемых образцах строили калибровочную кривую на основании разведения белка бычьего сывороточного альбумина с известной концентрацией белка. 2.3.3 Иммуноблоттинг
Первым этапом иммуноблоттинга является разделение белков в ПААГ. Для этого тотальный белок клеток/МВ-ЦВ смешивали с 2x буфером Лэммли (62,5 мМ Tris-HCl pH 6.8, 25% глицерол, 2% ДСН, 0,01% бромфенолового синего, в который предварительно добавляли -меркаптоэтанол), в соотношении 1:2 и инкубировали при 95С в течение 5 минут. Образцы наносили в лунки ПААГ (концентрирующий гель – 4%, разделяющий гель – 12%) и осуществляли электрофоретическое разделение белков в трис-глициновом буфере pH 8.3 (25 мM Tris-HCl, 250 мM глицин, 0.1% ДСН) с использованием электрофоретической камеры MINI-Protean TETRA (BioRad, США), оснащенной источником питания PowerPac Basic (BioRad, США).
Перенос белков на PVDF-мембрану (BioRad, США) осуществляли с использованием системы полусухого переноса Semi-Dry Transfer Cell Trans-Blot SD (BioRad, США). Эффективность переноса оценивали окрашиванием Ponceau S (Хеликон, Россия). Блокирование неспецифического связывания антител осуществляли путем инкубирования PVDF-мембраны в 5% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) (кат.№A9418-5G, Sigma, США). Окрашивание первичными антителами VEGF (кат.№sc-152 SantaCruz,США) 1:100, FGF2 (кат.№F5180 Sigma, США) 1:200, -actin (GenScript, США)1:1000 осуществляли в растворе 5% БСА в течение 12 часов при 4С. Далее отмывали PVDF-мембрану от неспецифично связавшихся первичных антител трижды в растворе TBS (20 мM Tris-HCl, 150 мM NaCl, 0.1% Tween 20). Окрашивание вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, осуществляли в растворе 5% БСА в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Далее отмывали PVDF-мембрану от неспецифично связавшихся вторичных антител трижды в растворе TBS.
Детекцию белков на мембране производили с помощью коммерческого набора Dual-Luciferase Reporter Assay System (Primega, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Результаты иммуноблоттинга фиксировали с помощью прибора ChemiDoc XRS+ (BioRad, США). Анализ цитокинов, хемокинов и факторов роста проводили с использованием технологии мультиплексного анализа. Данный метод основан на применении флуоресцентных частиц, окрашенных двумя флуоресцентными красителями в разном соотношении, максимальное возможное число разных популяций частиц -100, в результате чего возможна детекция до 100 различных аналитов в одном образце. Частицы определенного цвета несут антитела, конъюгированные с биотином, к одному виду аналита, после связывания с целевыми аналитами, проводят детекцию фикоэритрином, конъюгированным со стрептавидином. В результате, определенный цвет частиц указывает на детектируемый аналит, а интенсивность флуоресценции данных определенных частиц пропорциональна концентрации исследуемого аналита в образце. Исследование молекулярного состава МВ-ЦВ и МСК-ЖТ человека осуществляли с использованием Human Cytokine 27-Plex Panel (BioRad, США), в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Образцы инкубировали с флуоресцентными частицами в течение 1 часа без доступа света. Далее частицы дважды отмывали ФСБ с помощью прибора Bio-Plex Pro Wash Station (BioRad, США). Инкубировали с фикоэритрином, конъюгированным со стрептавидином в течение 10 минут. Далее частицы трижды отмывали ФСБ с помощью прибора Bio-Plex Pro Wash Station (BioRad, США). Анализ осуществляли с использованием прибора Bio-Plex 200 Systems (BioRad, США).
Формирование капилляро-подобных структур эндотелиальными клетками пупочной вены человека на матриксе Matrigel in vitro
По сравнению с осадком, полученным после первого этапа центрифугирования, пик сдвинулся в сторону меньшего размера структур – возросла доля компонентов размером 1,34-5,1 мкм, на которые приходится около 60% от всех компонентов осадка (Рисунок 5 Б). Пик составляют ядерные компоненты клетки и крупные МВ-ЦВ, что подтверждается данными флуоресцентной микроскопии (Рисунок 4 Г-Е).
Осадок, полученный после заключительного этапа центрифугирования (Рисунок 4 Ж-И), состоит исключительно из мембранных везикул, так как окрашивание ядерным красителем не выявило наличия ядерных структур (Рисунок 4 З), при этом обнаружено окрашивание цитоплазматическим красителем сферических структур (Рисунок 4 И), представляющих собой МВ-ЦВ. Таким образом, последний этап центрифугирования позволяет получить фракцию МВ-ЦВ, которая согласно данным флуоресцентной микроскопии свободна от клеток, ядер и крупных фрагментов клеток. Таким образом, применение метода последовательного центрифугирования позволяет на первом этапе при низких скоростях центрифугирования осадить крупные объекты – клетки и ядра, на втором этапе при повышении времени центрифугирования осадить оставшиеся крупные объекты – ядра и крупные МВ-ЦВ, на последнем этапе центрифугирования при увеличении времени и скорости центрифугирования осадить МВ-ЦВ.
Метод проточной цитофлуориметрии с использованием стандартных приборов, не обладающих специальным, усиливающим сигнал прямого светорассеяния детектором, не позволяет детектировать субмикронные структуры. Поэтому с целью определения размера полученных МВ-ЦВ, мы использовали прибор Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK). Определение размера частиц и молекул основано на измерении динамического рассеяния света частицами, которые хаотично движутся в растворе, согласно теории Броуновского движения. Измерение фракции МВ-ЦВ производилось в ФСБ, кривые распределения МВ-ЦВ по размерам представлены на Рисунок 6А. Согласно полученным нами данным, размер МВ-ЦВ варьирует от 164,2 нм до 3580 нм (Рисунок 6 Б). Основная масса МВ-ЦВ (84,6%) обладает размером от 164,2 нм до 712,4 нм с пиком в области 295,3 нм, и небольшая доля МВ-ЦВ (15,4%) обладает размером от 825нм до 3580нм (Рисунок 6 Б).
Однако метод измерения размера частиц на основании динамического рассеивания света не обладает достаточной достоверностью в отношении гетерогенной системы биологических частиц, поскольку не способен отличить единичные МВ-ЦВ от агрегатов. Поэтому для подтверждения полученных результатов и визуализации морфологии и структуры МВ-ЦВ, мы применяли методы трансмиссионной (просвечивающей) и сканирующей электронной микроскопии (ТЭМ и СЭМ, соответственно). Согласно данным ТЭМ, получаемые нами структуры представляют собой окруженные ЦПМ везикулы клеток человека (Рисунок 7 А). При этом во фракции МВ-ЦВ не было обнаружено целых клеток и ядер. С помощью метода СЭМ, который позволяет исследовать поверхностную морфологию объекта, было установлено, что МВ-ЦВ имеют сферическую форму и гладкую поверхность (Рисунок 8 А).
Согласно данным ТЭМ размер МВ-ЦВ варьирует от 100 нм до 1700 -1800 нм. Основная масса МВ-ЦВ (76,22% от общего количества МВ-ЦВ) обладает размером 100-600 нм (Рисунок 7 Б). Размер МВ-ЦВ, установленный методом СЭМ, составляет от 100 нм до 1700 - 1800 нм. Основная масса МВ 77 ЦВ (80% от общего количества МВ-ЦВ) обладает размером 100-600 нм (Рисунок 8 Б).
Анализ структуры и размера мембранных везикул, полученных с помощью цитохалазина В, методом трансмиссионной электронной микроскопии. А – структура мембранных везикул. Б – гистограмма, отражающая распределение мембранных везикул по размеру.
Анализ морфологии и размера мембранных везикул, полученных с помощью цитохалазина В, методом сканирующей электронной микроскопии. А – морфология мембранных везикул. Б – гистограмма, отражающая распределение мембранных везикул по размеру. Размер МВ-ЦВ, установленный методом СЭМ, совпадет с данными, полученными с помощью ТЭМ. Согласно данным, полученным с помощью прибора ZetasizerNano и приведенным выше, во фракции МВ-ЦВ встречаются структуры размером до 3580 нм. Данные динамического рассеивания света не были подтверждены методами ТЭМ и СЭМ и, вероятно, объясняются ограничениями метода, связанными с дополнительной детекцией агрегатов МВ-ЦВ.
Таким образом, согласно данным ТЭМ и СЭМ, метод получения МВ-ЦВ с помощью цитохалазина В и последующего центрифугирования позволяет получать свободную от клеток и ядер и стабильную по размерам фракцию МВ-ЦВ.
Известно, что мишенью действия цитохалазина В являются актиновые микрофиламенты. Для исследования структуры актинового цитоскелета в клетках, обработанных цитохалазином В, и в МВ-ЦВ, мы использовали специфичное к актину вещество – фаллоидин, конъюгированное с флуоресцентным красителем. Фаллоидин является микотоксином, который эффективно связывается и стабилизирует F-актин (Cooper, 1987). Для визуализации ЦПМ, отграничивающей содержимое клеток и мембранных везикул от внешней среды был использован мембранный краситель DiD. На Рисунок 9 представлены полученные нами результаты. В нативных клетках HEK293FT филаменты актина выглядят вытянутыми и непрерывными, образующими скопления в области выростов клетки (Рисунок 9 А). В клетках HEK293FT, обработанных цитохалазином В в концентрации 10мкг/мл в течение 30 минут, наблюдается изменение структуры актинового цитоскелета (Рисунок 9 Г). Под действием цитохалазина В актиновый цитоскелет теряет непрерывность, а фрагменты актиновых нитей приобретают вид подмембранных «островков» (Рисунок 9 Г).
Исследование взаимодействия и механизма доставки содержимого мембранных везикул в клетку-реципиента
В результате проведенных исследований было установлено, что эффективность доставки флуоресцентного красителя в клетку-реципиента зависит от концентрации наносимых МВ-ЦВ и концентрации загруженного в МВ-ЦВ вещества. Однако вопрос - являются ли доставленные вещества функционально активными в клетке-реципиенте, оставался открытым.
Для исследования способности МВ-ЦВ доставлять в клетку-реципиента функционально активные биомолекулы, был осуществлен перенос генетической информации посредством МВ-ЦВ. Для детекции процесса переноса генетической информации посредством МВ-ЦВ в клетку-реципиента, была использована плазмидная конструкция - pEGFP-N2, несущая ген зеленого флуоресцентного белка egfp (от англ. enhanced green fluorescence protein). В качестве клеток-доноров МВ-ЦВ и в качестве клеток-реципиентов были выбраны клетки линии HEK293FT. Известно, что клетки HEK293FT несут в геноме большой Т-антиген вируса SV40, который способствует репликации плазмид, содержащих точку начала репликации SV40 (например, pEGFP-N2). Таким образом, трансфекция клеток HEK293FT плазмидой pEGFP-N2 приведет к репликации плазмиды и увеличению количества копий плазмидной ДНК в клетках-донорах МВ-ЦВ, что повысит частоту включения плазмидной ДНК в состав МВ-ЦВ. Перенос даже единичной молекулы плазмидной ДНК (pEGFP-N2) в клетку-реципиента посредством МВ-ЦВ приведет к репликации плазмиды внутри клеток-реципиентов, увеличению количества продуктов экспрессии гена egfp и в результате к усилению интенсивности флуоресценции в зеленой области спектра клеток-реципиентов.
Клетки-доноры МВ-ЦВ (HEK293FT) трансфицировали плазмидой pEGFP-N2 с помощью траснфицирующего реагента Turbofect (ThermoFisher Scientific, США). Эффективность трансфекции была оценена методом проточной цитофлуориметрии и составила 99,6% GFP+-клеток (Рисунок 18). Рисунок 18 - Гистограмма, отражающая интенсивность флуоресценции клеток HEK293FT через 24 часа после трансфекции плазмидной ДНК pEGFP-N2. Пик зеленого цвета – отрицательный контроль, нетрансфицированные клетки; пик красного цвета – трасфицированные клетки HEK293FT.
МВ получали с помощью цитохалазина В через 24 часа после трансфекции клеток-доноров HEK293FT плазмидной ДНК. МВ-ЦВ наносили на клетки-реципиенты (HEK293FT), через 48 часов инкубации оценивали процесс переноса плазмидной ДНК посредством МВ-ЦВ. С целью подтверждения того, что фракция МВ-ЦВ не содержит клеток, которые могли внести в анализ ложноположительный результат, в качестве отрицательного контроля, МВ-ЦВ были нанесены в культуральный планшет, содержащий полную питательную среду. В результате инкубирования МВ-ЦВ в полной среде в течение 48 часов при 37С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2, в культуральном флаконе клеток обнаружено не было.
Процесс переноса генетической информации в виде плазмидной ДНК посредством МВ-ЦВ был исследован методом ПЦР. При использовании праймеров специфичных к последовательности гена egfp были обнаружены специфичные продукты амплификации в образцах: клетки HEK293FT, трансфицированные плазмидной ДНК pEGFP-N2 (положительный контроль); МВ-ЦВ, полученные от трансфицированных плазмидной ДНК клеток HEK293FT; клетки-реципиенты (HEK29FT) через 48 часов инкубирования с МВ-ЦВ; МВ-ЦВ через 48 часов инкубирования в питательной среде (Рисунок 19). Наличие специфичного продукта амплификации в МВ-ЦВ, выделенных от трансфицированных клеток HEK293FT, клетках HEK293FT через 48 часов после инкубирования с МВ-ЦВ и его отсутствие в контрольных клетках (клетки-реципиенты HEK293FT) свидетельствует о том, что в клетки-реципиенты посредством МВ-ЦВ была перенесена плазмидная ДНК.
Рисунок 19 - Электрофореграмма продуктов ПЦР при использовании праймеров, специфичных к последовательности гена egfp. М – маркер; 1 – клетки HEK29FT, трансфицированные плазмидной ДНК pEGFP-N2; 2 – клетки-реципиенты HEK29FT; 3 – мембранные везикулы, полученные от клеток HEK29FT, трансфицированных плазмидной ДНК pEGFP-N2; 4 – клетки-реципиенты HEK29FT через 48 часов инкубации с мембранными везикулами; 5 – МВ-ЦВ через 48 часов инкубирования в питательной среде; 6 – отрицательный контроль.
Количество специфичного продукта амплификации в образце клеток-реципиентов HEK293FT через 48 часов после инкубирования с МВ-ЦВ значительно больше, по сравнению с образцом МВ-ЦВ через 48 часов инкубирования в питательной среде, при использовании в ПЦР одинаковой концентрации ДНК-матрицы (Рисунок 19). Это свидетельствует о том, что выявленный специфичный продукт амплификации в образце клеток-реципиентов через 48 часов после нанесения МВ-ЦВ, не является результатом детекции плазмидной ДНК в составе МВ-ЦВ, которые могли присутствовать в остаточном количестве. Поскольку клетки линии HEK293FT содержат в геноме большой Т-антиген вируса SV40, в них происходит репликация плазмидной ДНК pEGFP-N2, содержащей точку начала репликации SV40. Таким образом, внутри клеток-реципиентов произошла репликация плазмидной ДНК pEGFP-N2, доставленной посредством МВ-ЦВ, что привело к увеличению копий гена egfp и объясняет вышеописанное нарастание специфичного продукта амплификации в образце клеток-реципиентов HEK293FT через 48 часов после инкубирования с МВ-ЦВ.
Поскольку кодируемый плазмидой pEGFP-N2 белок обладает флуоресценцией, процесс переноса посредством МВ-ЦВ, транскрипционной активности плазмидной ДНК с последующей трансляцией в клетке-реципиенте можно детектировать с помощью метода флуоресцентной микроскопии. Через 24 часа после трансфекции клетки-продуценты HEK293FT были окрашены витальным мембранным красителем DiD (Рисунок 20 А-Г). Далее от трансфицированных плазмидной ДНК и окрашенных DiD клеток HEK293FT получали МВ-ЦВ, которые наносили на неокрашенные клетки-реципиенты (HEK293FT). Через 48 часов инкубации клетки-реципиенты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа AxioObserver Z1 (CarlZeiss, Германия). В культуре клеток-реципиентов HEK293FT, на которые были нанесены МВ-ЦВ, были обнаружены клетки, экспрессирующие EGFP (Рисунок 20 Д). На поверхности клеток-реципиентов были детектированы области ЦПМ, окрашенной DiD (Рисунок 20 Е), что свидетельствует о том, что произошло слияние мембран МВ-ЦВ и клеток-реципиентов. Некоторые из клеток-реципиентов, на поверхности которых были обнаружены вставки ЦПМ МВ-ЦВ, обладали флуоресценцией в зеленой области спектра (Рисунок 20 Ж,З). При этом в отрицательном контроле – клетки HEK293FT, на которые была нанесена «голая» плазмидная ДНК, флуоресцентный сигнал в зеленой области спектра отсутствовал.