Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Свободнорадикальное перекисное окисление липидов в норме и при критическом состоянии .
1.1 Биологическая роль процессов липидпероксидации и антиоксидантной защиты организма...
1.2 Метаболизм липидов и активность процесса липидпероксидации крови в физиологических условиях и патологических состояниях организма .
1.3 Особенности процесса липидпероксидации у больных при кардиохи-рургических вмешательствах в условиях искусственного кровообращения..
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования
2.1 Материалы исследований...
2.2 Методы определения показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты .
2.2.1 Экстракция липидов из эритроцитов и плазмы крови...
2.2.2 Определение скорости окисления и периода индукции липидов ..
2.2.3 Определение диеновых коньюгатов .
2.2.4 Определение концентрации общих липидов...
2.2.5 Определение спектра фосфолипидов и холестерола
2.3 Определение активности компонентов ферментативной антиоксидант-ной защиты эритроцитов
2.3.1 Активность супероксиддисмутазы...
2.3.2 Активность каталазы
2.4 Статистическая обработка результатов...
ГЛАВА 3 Результаты исследований .
3.1 Оценка липидпероксидации в эритроцитах и плазме крови в зависимо-сти от влияния компонентов анестезии и режима искусственного кровооб-ращения в интраоперационный и ранний послеоперационный периоды .
3.1.1 Исследование липидпероксидации в эритроцитах в условиях много-компонентной анестезии на основе кетамина или изофлурана и ламинарно-го режима перфузии
3.1.2 Особенности липидпероксидации в плазме крови под влиянием мно-гокомпонентной анестезии на основе кетамина или изофлурана и ламинар-ного режима перфузии .
3.1.3 Исследование процесса липидпероксидации в эритроцитах и плазме крови в условиях многокомпонентной анестезии на основе изофлурана и пульсирующего режима перфузии .
3.2 Оценка динамики спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови в зависимости от влияния компонентов анестезии и режима искусственного кровообращения в интраоперационный и ранний послеопе-рационный период .
3.2.1 Динамика спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови в условиях многокомпонентной анестезии на основе кетами-на и ламинарного режима перфузии .
3.2.2 Динамика спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови в условиях многокомпонентной анестезии на основе изофлу-рана и ламинарного режима перфузии .
3.2.3 Динамика спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови в условиях многокомпонентной анестезии на основе изофлу-раном и пульсирующего режима перфузии .
3.3 Оценка активности супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах в зависимости от влияния компонентов анестезии и режима перфузии в ин-траоперационный и ранний послеоперационный период
ГЛАВА 4 Обсуждение результатов
Заключение .
Выводы .практические рекомендациип .
Список использованных сокращений
Список литературы
- Метаболизм липидов и активность процесса липидпероксидации крови в физиологических условиях и патологических состояниях организма
- Определение скорости окисления и периода индукции липидов
- Особенности липидпероксидации в плазме крови под влиянием мно-гокомпонентной анестезии на основе кетамина или изофлурана и ламинар-ного режима перфузии
- Динамика спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови в условиях многокомпонентной анестезии на основе изофлу-раном и пульсирующего режима перфузии
Введение к работе
Актуальность исследования. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает одно из первых мест в рейтинге основных причин летальных исходов в Российской Федерации и большинства развитых стран мира [Хохлов О.А., 2013; Бородулин В.И. и др., 2015]. Хирургическая коррекция коронарной недостаточности осуществляется при выполнении операций аортокоронарного шунтирования (АКШ), которые часто выполняют в условиях искусственного кровообращения (ИК). Операции АКШ приводят к активации цепных воспалительных реакций, сопровождающихся повышением в крови и органах эндогенных катехоламинов, интерлейкинов, протеолитических ферментов [Светлова Н. Ю., 2006; Доценко С.В. и др., 2015]. В результате развивается окислительный стресс, формируются нарушения метаболического характера [Чумакова С.П. и др., 2012; Цыган Н.В. и др., 2015; Мороз Г.Б. и др., 2016]. При АКШ поражается эндотелий сосудов микроциркуляции сердца и паренхиматозных тканей, в которых усиливается процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) и снижается антиоксидантная защита (АОЗ) [Елдырев А. Ю., 2013; Рузов В.И. и др., 2014]. Использование анестезиологических средств во время АКШ приводит к изменениям в системе ПОЛ-АОЗ, за счет анти- или прооксидантного эффекта [Сто-рожук П.Г. и др.,1999], фармакологического прекондиционирования компонентов анестезии [Лихванцев В.В. и др., 2013, 2014; Мороз В.В. и др., 2012; Лев-ченкова О.С. и др., 2016]. Во время ИК эритроциты подвергаются деформационному и окислительному воздействию, это активирует процессы ПОЛ и повышает риск интраоперационного и постперфузионного кровотечения [Дементьев И.И. и др., 2008, 2010; Vercaemst L., 2008]. Развитие окислительного стресса может усиливаться в зависимости от выбора ламинарного или пульсирующего режима перфузии ИК, при этом не получено данных о неоспоримых преимуществах одного метода перфузии над другим [Бунятян A.A., 2005; Ши-ганов М. Ю. и др., 2008; Voss B., 2009; Пыленко С.А. и др., 2015]. Анализ доступной литературы не выявил работ, которые позволяют оценить развитие окислительного стресса под влиянием компонентов анестезии на основе изо-флурана, в сравнение с внутривенными анестетиками, а также в зависимости от режима перфузии, что подчеркивает актуальность проведенного исследования.
Таким образом, влияние компонентов анестезии и режима ИК на выраженность процесса липидпероксидации в клетке, при кардиохирургических вмешательствах, может являться одним из факторов, позволяющих оценить эффективность используемых методов защиты от ишемии, перфузионных повреждений, развития нарушений гемостаза и, несомненно, представляет значительный теоретический и практический интерес.
Цель исследования: Оценить показатели перекисного окисления липи-дов и антиоксидантной защиты, спектра липидов эритроцитов и плазы крови у кардиохирургических больных, в зависимости от влияния многокомпонентной анестезии с кетамином или изофлураном и режима искусственного кровообращения, в периоперационный и ранний послеоперационный периоды.
Задачи исследования:
-
Исследовать показатели перекисного окисления липидов и антиокси-дантной защиты в эритроцитах и плазме крови больных, в условиях многокомпонентной анестезии на основе кетамина или изофлурана и ламинарного режима искусственного кровообращения.
-
Установить активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах больных, в условиях многокомпонентной анестезии на основе кетамина или изофлурана и ламинарного режима искусственного кровообращения.
-
Изучить динамику спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови больных, в условиях многокомпонентной анестезии на основе-кетамина или изофлурана, а так же определить взаимосвязь с показателями пе-рекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты при ламинарном режиме искусственного кровообращения.
-
Исследовать динамику показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты, спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови больных, в условиях многокомпонентной анестезии на основе изофлурана и пульсирующего режима искусственного кровообращения.
-
Провести сравнительный анализ динамики показателей липидперокси-дации, спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови больных, выявить прогностический характер исследуемых показателей, в зависимости от влияния компонентов анестезии и режима искусственного кровообращения.
Новизна исследования:
-
Новыми данными являются результаты сравнительного исследования показателей липидпероксидации в эритроцитах и плазме крови, в условиях многокомпонентной анестезии на основе кетамина или изофлурана, в зависимости от режима искусственного кровообращения при выполнении операций аортокоронарного шунтирования в периоперационный и ранний послеоперационный период. Установлена разнонаправленная динамика показателей на ин-траоперационном этапе, в зависимости от компонентов анестезии, не получено различий в динамике показателей раннего послеоперационного периода.
-
Впервые показано снижение скорости окисления липидов, повышение антиоксидантной защиты и недостоверное изменение содержания общих липи-дов, в эритроцитах и плазме крови, в условиях многокомпонентной анестезии с изофлураном и пульсирующего режима искусственного кровообращения
-
Впервые установлено прогрессирующее повышение коэффициентов ФЭА/ФХ, ФЭА/СХС, ЭХС/СХС и снижение ОХС/ОФЛ в эритроцитах, к 3-м суткам в сравнении с предоперационным уровнем, в условиях многокомпонентной анестезии с изофлураном.
-
Выявлены более выраженные изменения показателей липидпероксида-ции, спектра фосфолипидов и холестерола, характерные для липидов эритроцитов, в отличие от липидов плазмы крови, в исследуемых условиях.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы обосновывают целесообразность определения показателей липидпероксидации, спектра фосфолипидов и холестерола эритроцитов для оценки адекватности
– 4 –
протокола анестезии, в обеспечении защиты клеток крови от гипоксии и перфу-зионных повреждений.
Снижение антиоксидантной защиты и активация перекисного окисления липидов в эритроцитах кардиохирургических больных усиливают необходимость использования в протоколе анестезий компонентов с антиоксидантными или цитопротекторными свойствами.
По материалам исследования подготовлены и опубликованы методические рекомендации для специалистов клинико-биохимических лабораторий:
-
Анализ состояния пероксидного окисления и антиоксидантной защиты крови при критических состояниях - Тюмень: ТюмГНГУ, 2014. – 38 с.
-
Влияние выбора режима перфузии на развитие окислительного стресса у больных при хирургических операциях в условиях искусственного кровообращения - Тюмень: ТюмГНГУ, 2014. – 26 с.
-
Оценка влияния современных ингаляционных и внутривенных анестетиков на состояние системы липидпероксидации крови у больных при кардиохирургических операциях в условиях искусственного кровообращения -Тюмень: ТюмГНГУ, 2014. – 38 с.
По результатам исследования издана монография: Роль компонентов анестезии в активации окислительного метаболизма липидов крови - Тюмень: ТюмГНГУ, 2015. – 80 с.
Получено 4 акта внедрения результатов научно-исследовательской работы. Анализ комплекса показателей состояния системы ПОЛ-АОЗ в эритроцитах и плазме крови включен в рекомендательный протокол при лечении кардиохи-рургических больных в условиях ИК отделений анестезиологии и реанимации ГБУЗ ТО ОКБ №1 и №2 (г. Тюмень).
Методология и методы исследования:
Клинические испытания выполнены в отделении анестезиологии и реанимации ГБУЗ ТО ОКБ №1 (г. Тюмень), анестезии проводил анестезиолог-реаниматолог В.А. Петров. Лабораторные исследования проведены на базе кафедры биохимии ГБОУ ВПО ТюмГМУ, заведующий С.Л. Галян.
Отбор крови для анализа осуществляли из периферической вены больного за 12 часов до оперативного вмешательства (1-й этап исследования), во время операции (2 – 4-й этапы исследования - до начала ИК, по окончании перфузии, по окончании операции), а также на 1-е и 3-и сутки раннего послеоперационного периода (5 - 6-й этапы исследования).
Этапы исследования характеризуются различным характером влияния совокупности факторов на динамику ПОЛ-АОЗ липидов крови, включающих хирургический стресс, влияние компонентов анестезии и режима перфузии ИК, а также процесса реперфузии тканей после длительной гипоксии.
Биохимические методы исследования. Липиды из эритроцитов и плазмы крови выделяли методом экстракции смесью растворителей геп-тан:изопропанол - 2 (1:1, по объему), использовали 10 - кратный избыток. Исследуемые показатели ПОЛ-АОЗ, спектра фосфолипидов и холестерола оценивали в фазе гептана.
Содержание первичных продуктов окисления липидов диеновых конью-гатов (ДК, мкмоль/мл) определяли спектрофотометрическим методом по величине оптической плотности при А,=232 нм гептанового раствора липидов. Общие липиды (ОЛ, мг/мл) оценивали фотоколориметрическим методом по величине оптической плотности при >.=534 нм, после предварительной реакции липидов с фосфорнованилиновым реактивом [Ушкалова В.Н. и др., 1987].
Показатели скорости окисления (СО, мм3 /мин), а также периода индукции (ПИ, мин/мл) липидов определяли по кинетической кривой после окисления, инициированного динитрилазобисизомасляной кислотой [Ушкалова В.Н. и др., 1987]. Использовали волюмометрический метод для определения объема поглощенного кислорода. ПИ выражали по времени поглощения пробой липидов 25 мм3 кислорода из воздуха, показатель характеризует активность не ферментативного компонента АОЗ липидов. СО рассчитывали на линейном участке кинетической кривой, показатель отражает устойчивость липидов к перекис-ному окислению.
Содержание спектра фосфолипидов (мкмоль/мл): ФЭА (фосфатидилэта-ноламин), ФХ (фосфатидилхолин), ФС (фосфатидилсерин), СФМ (сфингомие-лин), ЛФХ (лизофосфатидилхолин), а также сумму общих фосфолипидов (ОФЛ) определяли фотоколориметрическим методом при ^=260 нм после реакции неорганического фосфора с малахитовым зеленым. Компоненты фосфолипидов предварительно выделяли из смеси методом тонкослойной хроматографии. Количественное определение (мкмоль/мл) неэтерифицированного (свободного) холестерола (СХС) и эфира холестерола (ЭХС) определяли фотоколориметрическим методом при А,=540 нм по реакции с хлоридом железа III [Кар-пищенко В.С., 2002].
Ферментативные компоненты АОЗ оценивали в эритроцитах спектрофотометрическим методом: супероксиддисмутазу (SOD, ус.ед./мл эр.) по активности торможения реакции восстановления нитросинего тетразолия при А,=540 нм, каталазу (КАТ, мкмоль/минл) - после реакции с Н202 при ^=260 нм [Кар-пищенко В.С., 2002].
Холестеролсинтезирующую функцию печени и леци-
тин:холестеролацилтрансферазы (ЛХАТ) в сыворотке крови, определяли путем процентного отношения содержания фракций ФЭА, ФХ, СХС эритроцитов на этапах исследования [Илюкевич Г.В. и др., 2002].
Анализ результатов. Статистическая обработка результатов проводилась с применением пакета программ Statistica v.6.0. Количественные значения исследуемых показателей приведены как среднее значение М и стандартное отклонение. Тестирование параметров нормального распределения проводилось с помощь критериев Колмогорова-Смирнова, уровень статистической значимости различий оценивали, вычисляя доверительный коэффициент Стъюдента (t), значимыми считали различия при р<0,05. Использовали метод ранговой корреляции Спирмена (г) для анализа характера взаимосвязи исследуемых переменных. Сравнительный анализ показателей проводился с помощью процентных отношений.
Положения, выносимые на защиту:
-
Динамика показателей липидпероксидации, спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови, определяется компонентами протокола анестезии с кетамином или изофлураном.
-
Особенности влияния компонентов анестезии на динамику исследуемых показателей липидпероксидации проявляется на предперфузионном этапе и усиливается или ослабевает на этапе перфузии, и зависит от спектра липидов в эритроцитах и плазме крови.
-
Активацию липидпероксидации в эритроцитах и плазме крови, можно уменьшить, используя многокомпонентную анестезию с изофлураном и пульсирующий режим искусственного кровообращения.
Степень достоверности и апробация работы:
Обоснованность и достоверность научных положений и выводов настоящего исследования подтверждается достаточным по объему клинических наблюдений (124 пациента), биохимических исследований процессов липидпе-роксидации в эритроцитах и плазме крови (14 показателей), этапов исследования (6 этапов), выбором современных биохимических и аналитических методов, а также корректными методами статистической обработки.
Результаты исследования и основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на Евразийском конгрессе с международным участием (Екатеринбург - 2013, 2015), Всероссийских научных конференциях (Санкт-Петербург - 2014; Тюмень - 2013, 2014; Новосибирск - 2012), международных научных конференциях (Санкт-Петербург - 2011, 2012, 2015; Вена - 2014).
Личный вклад автора состоит в проведении патентно-
информационного поиска, в постановке и выполнении биохимических исследований, в анализе и обобщении результатов исследования, их статистической и математической обработке, подготовке публикаций и внедрении результатов исследования.
Объем и структура работы. Диссертация включает введение, главы обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований и их обсуждение, а также заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы из 284 наименований, в том числе 99 – на иностранном языке. Объем диссертации 124 страницы машинописного текста, содержит 18 рисунков и 23 таблицы.
Метаболизм липидов и активность процесса липидпероксидации крови в физиологических условиях и патологических состояниях организма
Липиды, как необходимый компонент биологических мембран клетки, имеют преимущественно фосфолипидную природу, содержание которых состав-ляет 40-90% от общего их количества. Спектр высших жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов, определяют функциональную активность мембраны клетки, обеспечивают энергетический баланс, выполняют барьерную, транспорт-ную и защитную функции, участвуют в регуляци мембраносвязанных ферментов. Существует определенная зависимость физиологической активности мембраны клетки от степени ненасыщенности жирнокислотных компонентов. Наибольший процент в составе фосфолипидов биомембран приходится на пальмитиновую, пальмитоолеиновую, олеиновую, линолевую и арахидоновую кислоты [5, 125, 126, 196, 245]. Мембраны эритроцитов представлены – арахидоновой (5,7-20,3%), в состав тромбоцитов входит до 18% олеиновой и 16% линолевой кислот, липиды сыворотки крови имеют в составе от 21 до 34% линолевой кислоты. Указанные кислоты относятся к ненасыщенным соединениям, увеличение их доли в мембра-не обеспечивает снижение микровязкости и повышение деформационных колеба-ний в клетках, что обеспечивает обмен веществ и энергии между вне- и внутри-клеточным пространством на физиологическом уровне [140]. Общие липиды в сыворотке и плазме крови человека варьируют в широком интервале концентраций от 2,8 до 8,0 г/л, триглицериды при этом содержатся в количестве от 0,3 до 3,8 г/л; содержание свободного холестерола составляет 0,4-2,1 г/л; состав фосфолипидов колеблется от 1,4 до 2,9 г/л. Спектр фосфолипидов представлен ФХ на 2,5-3,1 г/л, ФЭА обнаружено от 1,1 до 2,0 г/л, плазмалогены содержатся от 0.07-0,08 г/л, а содержание СФМ составляет от 0,1 до 0,5 г/л [8, 30]. Следует отметить существенную разницу в составе спектра липидов в зависимо-сти от возраста и пола человека, географической зоны проживания [5].
В составе мембран эритроцитов [27] и тромбоцитов [21, 27] обнаружено 55-75% фосфолипидов, а также до 25% холестерола и его эфира. При этом во внеш-нем липидном слое мебраны клетки обнаружено до 70% ФХ, а также СФМ от 80 до 85%, внутренний слой биомембраны представлен на 80-90% ФЭА и ФС.
Вариабельность абсолютного содержания липидов, как и их жирнокислот-ного спектра, в физиологических условиях находится в широком интервале в за-висимости от вида ткани, органа, биологической жидкости. Изменения в содер-жании спектра холестерола и жирнокислотных компонентов в составе фосфоли-пидов в клетках и плазме крови значительно усиливаются при атеросклерозе со-судов, ишемической болезни сердца, развитии инфаркта миокард, патологии пе-чени и др. [7, 16, 50, 57, 60, 62, 70, 92, 116, 120, 187, 212, 221, 224, 262].
Изменение спектра липидов биомембран происходи в направлении сниже-ния относительной концентрации фосфолипидов и увеличения содержания спек-тра холестерола, выраженность указанных процессов значительно зависит от раз-вития патологического состояния.
Увеличение концентрации ЛФХ в тромбоцитах больных сахарным диабе-том 1-го типа, при одновременном уменьшении содержания ФЭА и ФС, приводит к снижению в клетках энергетических процессов и сопровождается спонтанной агрегацией клеток [42, 132, 133]. При хронических заболеваниях печени показано снижение в гепатоцитах содержания полиненасыщенных (С18:2 , С20:4) и повышение концентрации насы-щенных (С16:0) и моноеновых (С18:1) кислот [50, 126, 128]. Одновременно установ-лено отсутствие различий спектра жирных кислот в составе фосфолипидов и триглицеридов в сыворотке крови и гепатоцитов печени.
Выявлено уменьшение концентрации свободных высших жирных кислот и повышение их полиненасыщенности в сыворотке крови у больных бронхиальной астмой [11]. В сыворотке крови больных с острыми формами панкреатита разной этиологии [5] регистритуется увеличение содержания общих липидов от 5,2 до 5,9 мг/л и жирных кислот С16:0, С16:1, С18:1, при сопряженном уменьшении таких ки-слот как арахидоновая, линолевая и стеариновая. В патогенезе многих заболеваний ведущее место занимают процессы сво-боднорадикального окисления, таких как сердечно-сосудистые заболевания [176], сахарный диабет [42], атеросклероз [44, 95, 96], заболевания печени [41, 77] и др. Опухолевая патология молочной железы характеризуется изменением спектра липидов в эритроцитах и плазме крови [72, 166, 178].
Подробно описано изменение уровня общих, нейтральных липидов и фос-фолипидов, а также их жирнокислотного состава в различных органах экспери-ментальных животных, в сыворотке крови больных атеросклерозом и гипертони-ческой болезнью [5, 83, 89, 95, 170, 175].
В эритроцитах больных с ишемической болезнью сердца выявлено увели-чении содержания ФЭА, фосфатидных кислот и свободного холестерола при од-новременном снижении ФХ [158, 200, 244, 249]. Жирнокислотный состав фосфо-липидов характеризуется повышением содержания насыщенных и олеиновой ки-слот и снижением жирных кислот высокой полиненасыщенности. Установлена корреляция между увеличением содержания холестерола и триглицеридов в ли-пидах сыворотки крови с риском развития ИБС [53, 96, 97, 175]. Активация про-цесса липидпероксидации вызывает латеральную миграцию фосфолипидов, менее устойчивых к окислению, на плазматическую поверхность мембраны. Указанные структурно-функциональные изменения мембран клеток крови, повышают их способность к спонтанной агрегации, особенно тромбоцитов, что активирует про-цесс внутрисосудистого свертывания крови [21, 35, 36, 147]. Усиление перекисно-го окисления липидов в клетках крови сопровождается изменениями в их способ-ности к синтезу коагуляционных факторов и деформационным изменениям, уча-стия в адгезионных и агрегационных процессах, [21, 115, 1478, 158]. В этиопато-генезе ИБС одно из ведущих мест принадлежит возникновению очага ишемии сердечной мышцы, препятствующего необходимому объему кровотока коронар-ных артерий [109, 209, 243]. Таким образом, спектр жирнокислотного состава липидов биомембран яв-ляется определяющим при прочих равных в активации процессов перекисного окисления липидов в эритроцитах, затем в сыворотке и плазме крови.Указанный ряд активности ПОЛ обеспечивается высокой концентрацией легко окисляемых пента - и гексаеновых кислот в составе эритроцитов, которые практически отсут-ствуют в липидах плазмы и сыворотки крови. Наибольшей устойчивостью к окисления обладают фосфатидилэтаноламины и фосфатидилхолины микросом и митохондрий. Жирнокислотный спектр фосфолипидов мембран и скорость их пероксид-ного окисления находятся в прямой зависимости от состава и концентрации анти-оксидантов системы АОЗ клетки [20, 34, 37, 39, 40, 62, 63, 114, 175, 208, 226, 233, 235]. Активация ПОЛ, вне зависимости от факторов ее повышающих, приводит однозначно к уменьшению концентрации антиоксидантов в системе АОЗ и сни-жению скорости окисления, за счет повышения содержания более устойчивых к окислению компонентов липидов [11, 15, 19, 20, 21, 128, 217, 245]. Так, уменьше-ние содержания a-токоферола в клетках крови повышает склонность к атероскле-ротическим изменениям в сосудах [96, 97], развитию ишемической болезни серд-ца [124, 175, 219], как и других патологий [15, 63, 64].
Определение скорости окисления и периода индукции липидов
Выбор аппроксимирующей функции определяли по наименьшему среднеквадратичному отклонению (R2) от данных эксперимента и расчетного уравнения функции апроксимации (у). Для данных нашего исследования наименьшее R2 сооветствует параболической зависимости.
Первичными продуктами окисления липидов являются a - метиленовые коньюгированные (или сопряженные) гидропероксиды полиненасыщенных выс-ших жирных кислот, которые образуются на стадии продолжения цепи свободно-радикальных реакций. Диеновые коньюгаты в ультрафиолетовой области с максимумом при = 232-234 нм характеризуются интенсивным поглощением. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000 [90].
Концентрацию диеновых коньюгатов (ДК, мкмоль/мл субстрата) проводили по формуле: где: А – величина оптической плотности исследуемого раствора; 4 – анализи-руемый объем гептанового экстракта после разделения фаз (4 мл); V – объем эритроцитов или плазмы крови; К – коэффициент разбавления, равный 10; 27000 - молярный коэффициент экстинции (=232 нм).
Фосфорно-ванилиновый реактив (ФВР) при взаимодействии с триглицерида-ми, фосфолипидами, холестеролом, а также свободными высшими жирными ки-слотами образует соединения, которые окрашивают раствор в малиновый цвет. Концентрацию образующихся липидсодержащих соединений определяют фото-колориметрическим методом при длине волны = 534 нм Измерения проводили на фотоэлектроколориметре КФК-2-УХАЛ-4.2, используя стандартные диагно-стические наборы PALIVA – Lachama [90]. При измерениях в качестве контроль-ного раствора использовали гептан.
Концентрацию общих липидов рассчитывали по формуле: где: ОЛ – содержание общих липидов в субстрате; 8 – содержание липидов в стандартном растворе в мг/мл; Dпр. - оптическая плотность исследуемой пробы; Dст. – величина оптической плотности стандартного раствора липидов; К – равный 1, учитывает разбавление при экстракции липидов.
Содержание спектра фосфолипидов, а также сумму общих фосфолипидов определяли фотоколориметрическим методом после реакции неорганического фосфора с малахитовым зеленым. Компоненты фосфолипидов предварительно выделяли из смеси методом тонкослойной хроматографии [75]. Выделение индивидуальных ФЛ проводили методом тонкослойно хромато-графии с использованием элюирующей смеси СН3Сl:СН3ОН:NН3:Н2О. Идентифи-кацию фракций фосфолипидов проводили в камере парами кристаллического йо-да. В соответствии с величинами Rf, фракции фосфолипидов располагаются в сле-дующей последовательности (вверху - вниз): фосфатидилэтаноламин, фосфати-дилхолин, сфингомиелин, фосфатидилсерин, лизофосфатидилхолин. Содержание индивидуальных фосфолипидов определяли по неорганическому фосфору после реакции с малахитовым зеленым в фосфомолибденовой кислоте (реактив С). Оп-ределяли оптическую плотность опытной пробы при длине волны = 660 нм про-тив контроля (1 мл воды и 2 мл реактива «С»). Концентрацию индивидуальных фосфолипидов определяли по формуле: где: СФЛ.– концентрация фосфолипидов; Dк – оптическая плотность контрольно-го раствора, Dоп – оптическая плотность опытного раствора; 0,32 – коэффициент для перерасчета массы неорганического фосфора на молярную массу фосфолипи-дов.
Определение общего холестерола проводили после предварительного уда-ления растворителя из пробы под вакуумом до сухого остатка [75]. Полученный образец растворяют в 1 мл 0,1% раствора хлорида железа (III) в ледяной уксусной кислоте и серной кислоты (2 мл). Полученный раствор спектрофотометрируют при длине волны = 540 нм против контрольной пробы раствора холестерола. Концентрацию общего холестерола (ОХС) определяют по формуле: где: ОХ – концентрация общего холестерола в исследуемом образце; 200 – ко-эффициент перерасчета в размерность мг/100 мл; 5,18 - коэффициент перевода в ммоль/л; Еоп - оптическая плотность раствора исследуемого образца; Ест - оптиче-ская плотность стандартного раствора холестерола.
Особенности липидпероксидации в плазме крови под влиянием мно-гокомпонентной анестезии на основе кетамина или изофлурана и ламинар-ного режима перфузии
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) в настоящее время занимает одно из первых мест среди главных факторов смертности населения (55 %) в России [35, 36]. Для решения указанной проблемы разрабатываются новые медикаментозные и немедикаментозные средства, в том числе частое применение находят в практи-ке реваскуляризаиии миокарда операции аортокоронарного шунтирования (АКШ) [19, 45, 162]. Следует отметить, что в большинстве случаев кардиохирургические операции выполняют в условиях искусственного кровообращения (ИК) [19, 46, 172]. Использование новых методов анестезиологической защиты, совершенство-вание аппаратного обеспечения при выполнении искусственногокровообращения, высокий профессиональный уровень хирургов и перфузиологов обеспечивают на-дежную безопасность операций АКШ. Хирургическое лечение больных ИБС по-зволяет в течение продолжитеьного времени сохранить нормальную работоспо-собность сердца, выдерживать физические нагрузки, что существенно повышает их качество жизни. Контактирование форменных элементов крови с поверхностью элементов экстракорпорального контура вызывает активацию целого ряда воспалительных реакций организма [33, 34, 37]. В результате, изменяется функциональная актив-ность эндотелия капилляров и их проницаемость, что влечет за собой поврежде-ние тканей легких, печени и др. паренхиматозных органов [11, 35, 43, 202]. В клетках органов усиливаются процессы пероксидного окисления липидов и сни-жается антиоксидантный потенциал биомембран [2, 34, 51, 56, 61, 122, 123]. После проведения ИК возможны нарушения функциональной активности почек различной степени [11, 38, 108, 155]. В печени повышается содержание ферментов липолиза, при одновременном угнетении синтеза фосфолипидов, бел-ков, в результате снижается в крови уровень белка, а также факторов, которые оп-ределяют активность системы свертывания в крови [14, 17, 28, 30, 41, 146]. Основной проблемой современной перфузиологии, анестезиологии и реа-ниматологии является интраоперационный гемолиз эритроцитов, как результат деформационного воздействия в экстракорпоральном контуре аппарата ИК и раз-вития окислительного стресса [9, 11, 35, 55, 56, 80, 223, 271, 261]. Развитие окис-лительного стресса может усиливаться за счет гипероксии в процессе выполнения ИК и использования ИВЛ [179, 180, 184], а также от используемого режима аппа-ратов ИК, влияние которого на активность ПОЛ остается предметом дискуссии [182, 183]. Кардиохирургическое обеспечение операции предполагает использо-вание фармакологических корректоров гемостаза, кардиопротекторов, анестезио-логических средств, которые могут изменять равновесие в системе ПОЛ-АОЗ [41, 73, 74, 81, 85, 91, 104, 107, 163, 164, 165, 185].
Многофакторная зависимость развития окислительного стресса эритроци-тов в условиях ИК и его патогенетическая значимость при формировании после-операционных осложнений определяет необходимость, в дополнение к стандарт-ному мониторингу гемодинамики у кардиохирургических больных, использовать лабораторные методы анализа свободнорадикального процесса в период выпол-нения оперативного вмешательства, а также во время послеоперационной тера-пии. Предлагаемый лабораторный мониторинг ПОЛ-АОЗ повысит оценку эффек-тивности и адекватности используемого протокола анестезии от ищемических и перфузионных повреждений в тканях при операциях с применением ИК. Обзор научной литературы позволил выявить закономерность ответной ре-акции системы ПОЛ-АОЗ организма на разнообразные факторы воздействия, ко-торая заключается в активация ПОЛ при сопряженном снижении антиоксидант-ного потенциала клетки. Однако, стресс-ответ на различные факторы различается по степени выраженности, продолжительности во времени и динамикой показате-лей ПОЛ, АОЗ, спектра липидов, которые необходимо анализировать и учитывать при формировании групп пациентов исследуемой патологии.
Для анестезиологичского обеспечения кардиохирургической операции ши-роко применяют внутривенные анестетики [48, 43, 52, 54, 66, 68, 73, 76, 179], а также ингаляционные анестетики [61, 121, 146]. В нашем исследовании в качестве базисного анестетика выбраны кетамин, который активирует процессы ПОЛ [176] и изофлуран, имеющий противоположное действие, установленное при холеци-стэктомии [32, 146]. Наиболее широко обсуждается в литературе для изофлурана эффект защиты клеток органов от ишемии-реперфузии, выявленный однозначно в эксперименте и имеются противоречивые данные клинических исследований [51, 52, 104, 110, 113, 137]. Одновременно в протокол анестезий включены фентанил и тиопентал натрия, которые ингибирют процесс ПОЛ, как в экспериментальных [164], так и клинических условиях, установленных при холецистэктомии [29, 62]. Фентанил в эксперименте повышает защиту кардиомиоцитов, ативность КАТФ каналов [110, 1371]. Тиопентал натрия, в отличие от фармакокинетики изофлура-на и кетамина, относится к липофильным анестетикам, обладает способностью кумулироваться в жировых клетка. При этом кетамин, как водорастворимое со-единение, растворяется в плазме крови, в отличие от изофлурана [47]. Как правило больные ИБС принимают различные фармакологические сред-ства в предоперационной терапи как основной, так и сопутствующих патологий, которые могут существенно влиять на интенсивность процесса ПОЛ-АОЗ. В связи с этим, при формировании групп пациентов появляется необходимость выявления возможного диапазона изменений значений исследуемых показателей системы ПОЛ-АОЗ по сравнению с таковыми у здорового человека (контрольная группа). Анализируемые данные исследуемых показателей системы ПОЛ-АОЗ име-ют статистически достоверные различия (р 0,05) в эритроцитах и плазме крови контрольной группы (п = 25) и предоперационное обследование больных ИБС (п =124) (таблица 3.1; рисунок 4.1-4.3). Активация процесса ПОЛ и снижение актив-ности компонентов АОЗ как в эритроцитах, так и в плазме крови выявлена у больных ИБС. Это подтверждается статистически достоверным повышением со-держания первичных продуктов липидпероксидации ДК (56,29%, p 0,01 и 19,26%, p 0,05) соответственно. Одновременно выявлено статистически досто-верное снижение скорости окисления (СО) липидов в эритроцитах (42,58%, p 0,01) и повышение в плазме крови (33,34%, p 0,01), при сопряженном сниже-нии антиоксидантной активности (88,50% и 32,16%) в обоих субстратах.
Динамика спектра фосфолипидов и холестерола в эритроцитах и плазме крови в условиях многокомпонентной анестезии на основе изофлу-раном и пульсирующего режима перфузии
Анализ результатов выполненного исследования позволяет утверждать, что во время оперативного лечения больных ИБС формирующийся хирургический стресс вызывает существенные изменения в системе ПОЛ-АОЗ. Указанные изме-нения показателей имеют разнонаправленную динамику, глубина которых зави-сит от предоперационного уровня липидпероксидации и адекватности анестезио-логического протокола защиты. Хирургическое вмешательство является опреде-ляющим фактором активации липидпероксидации и подавления АОЗ на предпер-фузионном этапе. Выявленная динамика изменений в системе ПОЛ-АОЗ, является ответной адаптационно-компенсаторной реакцией организма к действию сово-купности таких факторов, как хирургическая травма и воздействие анестезиоло-гических средств. Полученные данные позволили установить, что более выраженная актива-ция липидпроксидации в мембранных и плазматических липидах проявляется в условиях многокомпонентной анестезии с кетамином, в отличие от изофлурана, в процессе выполнения искуственного кровообращения. Выявленная динамика по-казателей ПОЛ сопровождаются нарушением равновесия в процессах липолиза и липогенеза. На это указывает снижением концентрации ОЛ к 3-м суткам в срав-нении с предоперационным уровнем в исследуемых группах пациентов.
Воздействие средств анестезии на интенсивность процесса ПОЛ-АОЗ отра-жается наилучшим образом в установленном характере взаимозависимости между спектром липидов и скоростью их свободорадикального окисления. Существен-ная разница в диапазоне изменений показателя скорости окисления в эритроцитах или плазме крови в группах сравнения может отражать различный механизм вли-янии анестезиологических средств на изменения спектра липидов, которые позволяют повысить защиту от свободнорадикального окисления. Интенсификация ПОЛ в эритроцитах в условиях многокомпонентной ане-стезии с кетамином, в большей степени определяется прооксидантными свойст-вами кетамина, а вводимые концентрации фентанила, обладающего антиокси-дантными свойствами, не обеспечивают эффективного торможения процесса ли-пидпероксидации в процессе операции. Приведенные данные позволяют утвер-ждать, что введение тиопентала натрия на этапе перфузии ограничивает свобод-норадикальные процессы.
Интенсификация ПОЛ в эритроцитах активирует процесс липолиза фосфо-липидов под действием фермента фосфолипазы А2, что сопровождается значи-тельным увеличением ЛФХ и ФЭА, указанные изменения свидетельствуют о на-рушении равновесия в процессах липолиза и липогенеза. Зачительное повышение концентрации ФЭА способствует активности внутрисосудистого тромбообразо-вания, указанный процесс может усилиться в условиях гипоксии в результате на-рушения структуры эритроцитов и тромбоцитов, усиления в них ПОЛ. Одно-врнменно, увеличение содержания фосфатидиэтаноламина снижает активность ответной воспалительной реакции организма до физиологического уровня, за счет содержания полиненасыщенных жирных кислот в его составе. Компоненты анестезии в сочетании с хирургическим стрессом влияют на морфофункциональные свойства эритроцитов, за счет повышения интенсивности процесса липидпероксидации в мембране клетки, подавления активности компо-нентов антиоксидантной защиты, изменения спектра холестерола и фосфолипи-дов. Оценка интенсивности процесса ПОЛ-АОЗ под влиянием компоненты ане-стезии на основе изофлурана показала, по сравнениюс кетамином, более эффек-тивную защиту мембраны эритроцитов от агрессивного действия активных ради-калов. Стабилизирующий характер действия изофлурана наиболее выражен во время использования искусственного кровообращения и последующим процессом реперфузии тканей. Важной характеристикой глубины нарушений в системе ПОЛ-АОЗ, адекват-ности анестезиологической защиты мембран эритроцитов от гипоксического и перфузионного повреждения является снижение липолитического коэффициента ОХС/ОФЛ. В наших исследованиях снижение коэффициента ОХС/ОФЛ в эритро-цитах установлено в условиях многокомпонентной анестезии с изофлураном к концу операции. В условиях анестезии с кетамином показано повышение коэф-фициента ОХС/ОФЛ в эритроцитах в сравнении с предоперационным уровнем.
Известно, что операции на сердце с искусственным кровообращением вы-зывают нарушения функций отдельных органов, в том числе и печени. Эти нару-шения касаются прежде всего ее синтетической и детоксикационной функций. В результате этих процессов возникают такие послеоперационные осложнения, как длительность восстановления сознания и когнитивных функций, а также реабили-тации больного после операции. Маркером восстановления морфоструктуры и функции мембран клетки, в том числе и гепатоцитов печени, может служить ди-намика активности фермента лецитин : холестеролацилтрансферазы в сыворот-кекрови и выброс холестерола в кровь, синтезруемого в печени. На это указывает прогрессирующее повышение коэффициентов ЭХС/СХС ФХ/СХС, ФЭА/СХС в эритроцитах к окончанию операции с наибольшей выраженностью в условиях многокомпонентной анестезии с изофлураном и пульсирующим режимом ИК.
Эффективность компонентов анестезии на основе изофлурана в регуляции процесса ПОЛ имеет мембранотропный характер, который проявляется измене-нием спектра липидов в направлении повышения окислительной стабильности. В данном случае реализуются свойства изофлурана к анестетическому преконди-ционированию в совокупности с антиоксидантной активностью фентанила и тио-пентала натрия. Проведенное исследование однозначно показало перспективность примене-ния показателей ПОЛ-АОЗ в сравнительной оценке эффективности компонентов анестезии и режима перфузии искусственного кровообращения, в направлении повышения защиты организма от операционного стресса.