Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Традиционно основной объем работ по биоэнергетике проводится на клетках и митохондриях млекопитающих и микроорганизмов, данных об энергетическом метаболизме клеток эктотермных позвоночных крайне мало. В результате, несмотря на быстрый прогресс в понимании принципов функционирования энергетической машины клетки, мы мало знаем об ее эволюции.
Исследования энергетического метаболизма эктотермных позвоночных интересно еще с одной точки зрения. Спектр экологических адаптации этих животных необычайно широк, и многие условия, такие как переохлаждение, голодание, обезвоживание, существование в условиях крайне скудного снабжения кислородом, являющиеся для большинства млекопитающих стрессорными, патологическими или вообще несовместимыми с жизнью, оказываются приемлемыми для холоднокровных животных в определенные фазы их жизненных циклов. Многие экготермные позвоночные обладают способностью снижать скорость метаболизма в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды, что позволяет им экономить энергетические ресурсы в течение длительного времени. Поэтому изучение окислительного метаболизма клеток эктотермных животных может быть полезным при формировании новых терапевтических подходов для защиты клеток от последствий гипоксии, нарушений водно-солевого обмена, неправильного питания или голодания.
ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целями работы явилось 1) изучение структуры энергетического метаболизма (соотношения между основными процессами, сопряжённьтми с потреблением кислорода, производством и потреблением АТФ) клеток эктотермных позвоночных на примере гепатоцитов миноги Lampetra flmnatilis и лягушки Rana temporaria; сравнение полученных результатов с литературными данными для гепатоцитов млекопитающих; 2) Изучение феномена обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах миноги в зимние месяцы преднерестовой миграции.
1) Определить скорость потребления кислорода гепатоцитами миног и лягушек. ' Оценить вклад в потребление^- кислорода клетками митохондриального и немитохондриального дыхания, потребления кислорода
в процессе окислительного фосфорилирования и в результате утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий; определить вклад активного транспорта натрия и калия в скорость производства и потребления АТФ в клетке.
-
Сравнить скорости потребления кислорода гепатоцитами миноги и лягушки со скоростями потребления кислорода клетками печени других эктотермных позвоночных разной массы тела и млекопитающих. На основании полученных данных построить зависимость скорости потребления кислорода гепатоцитами от массы тела для эктотермных позвоночных.
-
Подтвердить наличие депрессии энергетического метаболизма в клетках печени миног в период преднерестовой миграции; исследовать механизмы регуляции окислительного метаболизма в гипометаболическом состоянии; изучить влияние замедления скорости метаболизма на жизнеспособность изолированных клеток и поддержание в них ионного гомеостаза.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ. В результате проведенных исследований впервые было продемонстрировано, что несмотря на 3-5 кратные различия в скорости клеточного дыхания, вклад в потребление кислорода клетками таких процессов как митохондриалъное и немитохондриальное дыхание, потребление кислорода, обусловленное окислительным фосфорилированием и утечкой протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, а также потребление кислорода в результате функционирования Na7K+АТФазы одинаково в исследованных гепатоцитах и в гепатоцитах крысы. Впервые было получено уравнение зависимости скорости потребления кислорода гепатоцитами от массы тела у эктотермных позвоночных. На изолированных гепатоцитах миноги был исследован феномен обратимой метаболической депрессии, который выражается в 2-Зх кратном снижении скорости потребления кислорода клетками, снижении интенсивности окислительного фосфорилирования, существенном уменьшении содержания АТФ в клетках. Впервые были исследованы гфинципы регуляции энергетического метаболизма при обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах мигрирующих на нерест миног. Также была получена ценная информация об активности Na7K*АТФазы в клетках, находящихся в гипометаболическом состоянии.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений о принципах функционирования и
регуляции энергетического метаболизма у экготермных позвоночных, выявлении черт сходства и различия биоэнергетики клеток экто- и эндотермных позвоночных. Обнаружена взаимосвязь скорости потребления кислорода гепатоцитами холоднокровных позвоночных и массы тела, сходная с известной для млекопитающих, а также сходная организация энергетического метаболизма в клетках этих животных. Эти закономерности позволяют по-новому взглянуть на проблему многократных различий в скоростях метаболизма между экто- и эндотермными позвоночными. Результаты исследования регуляции энергетического метаболизма при обратимой метаболической депрессии позволяют глубже понять феномен в целом, сформировать представления о принципах выживания клеток при низких скоростях дыхания и производства АТФ, что может найти применение в медицине. В процессе работы усовершенствована методика выделения гепатоцитов (Lappova and Leibush, 1995), что сделало.ее пригодной для выделения жизнеспособных і-епатоцитов, находящихся в гипометаболическом состоянии Также, была разработана новая методика определения нуклеотидов в биологических образцах методом высокоэффективной анионообменной жидкостной хроматографии, которая нашла практическое применение в лабораториях Научно-исследовательского центра Медицинской Академии последипломного образования, а также в Клинике нервных болезней Военно-Медицинской Академии.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования, докладывались на Втором съезде Биохимического общества РАН в Москве 19-23 мая 1997; XXXIII Международном Конгрессе физиологических наук в Санкт-Петербурге 30 июня -5 июля 1997; XIX Конгрессе Европейского общества сравнительной физиологии и биохимии в Турку, Финляндия, 23-26 августа 1998; в течение 2ой Финско - Русской школы "Рост и развитие. От молекул к организму", проходившей с 6 по 13 февраля 1998 на базе Хельсинского Университета в Финляндии. Методика определения адениновых нуклеотидов методом ВЭЖХ была представлена на Десятом Международном Симпозиуме по капиллярному электрофорезу и изотахофорезу в Праге, Чехия, 17-20 сентября 1996, Международном Конгрессе по аналитической химии в Москве 15-21 июня 1997 и на 22ом Международном Симпозиуме по хроматографии в Риме, Италия, 13-18 сентября 1998. В декабре 1997 г работа получила вторую премию на конкурсе научных работ молодых сотрудников Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Работа занимает 138 страниц, содержит 17 рисунков и 16 таблиц и состоит из следующих глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Список литературы содержит 272 источника, 8 на русском и 264 на английском языке.