Введение к работе
Актуальность проблемы. В связи с интенсивный развитием биохимии, молекулярной биологии и генетики увеличивается интерес исследователей к нуклеотидам и их производным, которые, как известно, выполняют в клетке целый ряд важнейших метаболических функций. С одной стороны, это материал для построения шсокополиыерных молекул нуклеиновых кислот, а также низкомолекулярных соединений типа Kad, fad, КоА, а с другой, они участвуют в ферментативных реакциях как субстраты, кофакторы, аллостерическне эффекторы и источники энергии. Кроме того, им присуща функция посредников гормонального и мециаторного сигнала.
Образование внутриклеточного фонда нуклеотидов осуществляется путем синтеза de novo , а также по "запасному" пути. Боль-, шинство организмов не нуждается в поступлении экзогенных нуклеотидов, так как они могут синтезировать их de novo . Шесте с тем не все ткани многоклеточных используют этот.путь. У некоторых из них более выражена способность к реутилизации готовых азотистых оснований. Тем не менее, в литературе крайне мало сведений о внутриклеточных механизмах, управляющих распределением вновь синтезированных нуклеотидов для выполнения той или иной конкретной функции. Четко не определена роль реутилизационных процессов, как детерминантов скорости синтеза нуклеотидов de novo . Мало внимания уделено тканевым и видовым различиям-зо внутриклеточной регуляции обмена нуклеотидов.
Особый интерес представляйт исследования обмена нуклеотидов в различных тканях птиц. Отсутствие у них цикла мочевины существенно отразилось на функционировании ключевых метаболических реакций и, в частности, на обмене аминокислот, пуриновых и пирими-циновых нуклеотидов. Несмотря на то, что биосинтез пуринов de novo впервые был изучен у голубя, до сих пор детально не исследованы механизмы регуляции этого сложного процесса, который не только обеспечивает организм птиц пуршшуклеотидами,но и является основным путем удаления избыточных форм аминного азота в виде синтезируемой МОЧЄВОІІ кислоты.
Научная информация о путях обмена нуклеотидов в тканях представляет не только теоретический интерес, но может быть полезна при разработке научно обоснованных рационов кормления сельскохозяйственных животных, питания людей, а также поиска фармакологических средств для устранения различных патологических нарушений.
Список сокращешііі: А!.?, АЕР , AIT - адеиозшшоно-, да- и трифос-фаты; си5, GDP, gtp - гуанозинмопо-,.да- и три! ссфаты; imp,
UDP, VHP - уридшшоїіо-, ди- п три^ссфаты; СУР, сдр , CTP - ци-тидашыоно-, ди- и трії-іоа^ати, ІІ.1Р - ішозішмоної'осфат; ХМ? - ксан-тозаншшо^осфат; AR - аденозин; gk - гуанозин; vs - уридин;
OR _ цитидіщ; itf - ксаптозин; IP. - инозин; А - адоиин, g -гуанин, С - цитозин, X - ксантин, Н г гипоксаитин; ALP- s - аде-нилосукцинат; КРФ - кисдьторастворимая йракция.
Цель и задачи работы. Основная цель настоящей работы заключалась в изучении внутриклеточной организации метаболических потоков пуринових и ппришдинсаых нуклеотидов, синтезируемых по альтернативный путям - tie novo и "запасному", а такте в определении рола реутилизациоцных процессов в обеспечении нуклеотидами различных в функциональной отношении тканей цыплят.
Конкретные задачи работы:
-
Определить способность тканей к автономному синтезу нук-леотидов do novo в утилизации готовых азотистых основании и оценить вклад альтернативных путей в обеспечении внутриклеточных процессов нуклеотидами.
-
Определить активности ферментов анаболизма и катаболизма пуринових и диримидиновых нуклеотидов.и проанализировать корреляционные связи между уровнями ферментативной активности и распределением метки низкоиолекулярных предшественников среди нуклео-тидных компонентов.
-
Изучить последовательности реакций, определяющих циклические превращения пуринов и выяснить их роль в осуществлении двух функционально различных процессов - удаление аминного азота и собственно синтеза пуринових нуклеотидов.
-
В опытах ід vivo проанализировать кинетику включения 'тЗ-оротовой кислоты в свободные пиримидиновые нуклеотиды и пири-ииданы РНК и изучить потоки ее превращения.
-
Изучить скорости синтеза РНК в различных тканях в зависимости от интенсивности внутриклеточного синтеза нуклеотидов и активности СТР-оинтетазы,
-
Исследовать анаболическую функцию пуриновых и пиримиди-
новых нуклеотидов, оснований в тканях животных в условиях D-ги-повитаминозной экспериментальной модели с целью нормализации минерального обмена и поиска новых алтирахигических средств.
Научная новизна. На основании проведенных результатов исследований сформулированы и обоснованы научные положения в области биохимии жипотных, сущность которых заключается в следущем. Впервые показано, что синтез мочевой кислоты, как конечного продукта экскреции аминного азота, в печени цыплят происходит по гуаниннуклеотидному пути за счет окисления инозшімонофосфата в ксантозинмоноїосфат (IMP —-А.МР —»-(GMP) —»- ксантин—- мочевая кислота). Тогда как деградационлыа путь (IMP —> инозин —-гипоксантин —»-ксантин —*~ мочевая кислота) заблокирован па стадии превращения гипоксантина в ксантпн из-за крайне низкой активности ксантиндегидрогеназы и но может обеспечить одлималь-ной скорости удаления ашшного азота. Поэтому его следует рассматривать как путь синтеза гипоксантина, используемого другими тканям для образования пуриннуклеотидов.
Показана специфическая для тканей роль пуршшуклеозидных циклоп. В печени инозиновый цикл используется для синтеза гилс— ксангина, а в селезенке и слизистой тонкого кишечника - для его реутилизации. Для гуанозинового цикла характера деградационная функция. В тканях цыплят и крыс обнаружена мало изученная реакция восстановительного дезамшшрованяя SMP, определяющая интенсивный процесс взаимопревращения IMP и GMP. Активность (ЗМР-ре-дуктаэы, катализирующей данную реакции, выше в тканях, эффективно кспользущих реупшізационішй путь образования пуршшуклеоти-дов.
Показано, что скорость синтеза FHK прямо коррелирует о уровнем поступления.оротовоЯ кислоты, а также активностью СТР-синте-тазы и обратно - с уровнем митотической активности тканей цыплят. "Запасной" путь, использующий реутилизационные механизмы, более доступен и эффективен в отношении образования фонда нуклеотидов, как предшественников для синтеза РНК.
В ядерной фракции печени и слизистой тонкого кишечника цыплят обнаружена активность СТР-синтетазы, что является новым фактом , свидетельствующим о наличии в ядро локальной системы превращения UTP в СТР. На основании экспериментальных данных о включении ороговой кислоты в пиримидшювыа нуклеотидк фонда и РНК
и математического моделирования этого процесса постулируется механизм, согласно которому превращение оротовой кислоты в клетках слизистой гонкого кишечника цыплят происходит по двум разобщенным каналам с образованием локальных фондов нуклеотидов, обеспечивающих разные метаболические реакции.
Теоретическая и практическая ценность работы. Настоящая работа вносит весомый вклад в развитие существующих представлений об особенностях обмена пуринових и пиримидиновых нуклеотидов в тканях урикотелкчвских организмов. Новие факты относительно пути удаления белкового азота и важной роли процессов реутилизации в тканях птиц свидетельствуют в пользу существования внутриклеточной компартмвнтализации потоков синтеза и деградации пуринов.
Впервые показаны существенные изменения в обмене пуриновых и пиримидинових нуклеотидов в различных тканях цыплят и крыс в условиях D-гиповитаминоза. Полученные результаты являются теоретическим обоснованием для использования предшественников пуринового и пиримидинового синтеза в качестве компонентов антирахитических препаратов.
Обнаружение нового пути синтеза мочевой кислоты меняет существующее представление о молекулярных механизмах патогенеза широко распространенного заболевания птиц - мочекислого диатеза (подагры) и открывает перспективу совершенствования существующего и разработки новых способов лечения отого заболевания, в первую очередь обуоловлеших генетическими аномалиями.
Основные положения диссортации находят применение в материалах спецкурсов по биохимия нуклеотидов и нуклеиновых кислот, читаемых на кафедрах биохимии Московской ветеринарной академии, Киевского государственного университета, Украинской сельскохозяйственной академии, Харьковского зооветинстптута.
Апробация работы и публикации.Основные положения диссертационной работы были положены на I Всесоюзном симпозиуме "Роль углекислоты и аммонийного азота в процессах бноскнтозп" (Боровск, 1976), Ш (1977), 1У (1982) и У (1987) Украинских биохимических съездах, Всесоюзной конференция "Актуальные проблемы витаминологии" (Москва, 1978), Республиканской научной конференции "Биохимия медицине" (Одесса, 1981), Всесоюзном оовагднии по уволр:цлои-ной физиологии (Ленинград, 1582), У Гсооомзпсм онп;;ш:"н>ском
съезде (Киев,1986), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия с/х кивотшос и Продовольственная программа" (Ташкент, 1Э83). Всего опубликовано 50 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (4 главы), заключения, выводов и списка литературы, содержащего 528 наименований. Объем диссертаций 363 страницы машинописного текста, 61 таблица, 5 схем и 33 рисунка.