Обмен нуклеиновых кислот печени и состояние липидтранспортной системы сыворотки крови при стумуляции регенераторной гипертрофии печени Осочук, Сергей Стефанович

Введение к работе

Актуальность проблемы: Несмотря на большое количество фунда-нтальных и прикладных исследований, посвященных восстановлению впежденной печени, смертность при печёночной и гепатоцеребраль-й недостаточности остаётся высокой (70-90%) и не имеет явной нденции к снижению ( Гальперин Э.И..Неклюдова Е.А. и др.,1975; іаковский А.И. .Кричевский А.Л. и др. ,1978; IWiofson С. S. etol. 69; Scbrruct W.,SekettsC.e. ,1975).

мер урбанизации общества и развития медицины увеличивается роятность воздействия на печень: рост травматизма, действие раз-:чных гепатотоксических химических веществ, в том числе и ряда ікарств, повышение частоты и объёма оперативных вмешательств на >ганах гепатобилиарной системы и др. (Блюгер А. Ф. 1978; Блюгер Ф. ,1980; Лопухин Ю.М. .Молодёнков М.И. и др. 1977). В связи с этим юретические и практические исследования, посвященные восстанов-ми» повреждённой печени, остаются актуальными и необходимыми.

настоящего времени большинство работ по изучению воссталови-ільньїх процессов печени производились на модели Хигинса и Андер-:на (1931), согласно которой у лабораторных крыс удаляли 70% мас-і печени. Восстановление оставшейся части печени происходит по мнципам регенераторной гипертрофии органа. Сокращённо этот про-!сс мы называем "регенерация печени". Анализ опубликованных ра-ІТ, посвященных регенерации печени, показал недостаточное решение іух важных вопросов: I) Каким образом воздействия на печень, мо-глирующие скорость её регенерации, сопряжены с функцией регенери-тощих гепатоцитов? 2) Как влияет предварительное повреждение пе-!ни на течение восстановительных процессов в органе? Для решения 'их врпросов следует учитывать, что регенерация печени у крыс ус-івно протекает в 2 фазы: (1-3'сутки, в деление вступают преимуще-'венно гепатоциты) митотичеекая фаза и (6-14 сутки) гипертрофиче-сая фаза. Поскольку вступление гепатоцитов в митотическую фазу зляется синхронным, создаются оптимальные условия для изучения !йствия различных физических и химических факторов на процессы іеточного деления. При этом важен подбор таких факторов (фармако-ігических, эндогенных агентов), которые, не вмешиваясь в механизм ітоза, могли бы включить большее число гепатоцитов в митотическую ізу, и это, в свою очередь, могло бы обеспечить более быстрое вос-'ановление массы органа. Такие факторы необходимы для восстановле-

ния печени, повреждённой механическими, радиационными, токсическими и другими воздействиями. Среди таких факторов наиболее перспективными являются эндогенные гепатотропные ростовые вещества (Губерниев М.А.Дейкина Е.М.,1964; Кусень СИ..Стойко Р.С, 1985; fV_y Ш., St8et J. et at , 1984; MeaclJ.. _tfaustoM ,1989), в том числе выделяемые системой моноциты-клетки Купфера при введении экзогенных бактериальных полисахаридных комплексов, например продигиозана (Ермольева З.В..Вайсберг Г.Е.,1976; Маянский Д.Н., Щербаков В.И.,1980).

Однако темп восстановления повреждённой печени не должен быть самоцелью, поскольку важен конечный результат, а именно функциональная полноценность регенерирующей печени в рамках её гомеоста-тической роли. Для этого целесообразно оценить функциональную способность гепатоцитов во второй - гипертрофической стадии регенера-ционного процесса. Учитывая вклад печени в поддержание гомеостаза, функциональную'способность гепатоцитов целесообразно изучить путё» исследования экспортируемых из печени белков и функционирующих в кровеносном русле, например, белков липидтранспортной системы.

Цели и задачи работы. Целью исследования было изучение действш продигиозана и рибоксина на процессы пролиферации и восстановление функциональной активности клеток печени в условиях острой печёночной недостаточности, вызванной массивной резекцией, затравкой тет-рахлорметаном и облучением ионизирующей радиацией; В соответстві с отой целью в диссертационной работе поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние продигиозана и рибоксина на содержание РНК и включение С-оротата в быстрометящуюся РНК клеток регенерируюсь печени крыс.

2. Исследовать влияние продигиозана и рибоксина на содержание и удельную активность ДНК клеток регенерирующей печени крыс.

3. Оценить действие продигиозана и рибоксина на состояние липидтрг спортной системы в процессе регенерационной гипертрофии печени.

4. Изучить процессы, означенные в задачах 1-3. в условиях предвар; тельного повреждения печени, вызванного введением тетрахлорметана и внешним гамма-облучением.

Научная новизна результатов. Впервые приведены доказательства что продигиозан способен стимулировать процессы транскрипции в ин-тактной печени и процессы репликационного синтеза ДНК в регенерирующей печени крыс, сопровождаемые более быстрым восстановлением і

шзтров липидтранспортной системы. Описан ряд новых неизвестных
інєе фактов: "" " "„ " ~~

продигиозан сдвигает пик включения ''Н-тимидина в ДНК ядер клеток ?генериругацей печени на 5 часов к моменту операции;

продигиозан усиливает включение С-оротата в быстро-метящуюся Ж ядер и митохондрий клеток регенерирующей печени;

в конце митотичеркой фазы регенерационного процесса продигиозан тособствуат более раннеьу восстановлению количества экспортируете из печени ЛПШ.

Впервые показано, что продигиозан, прииенёнкий на фоне введения зтрахлорметана, вызывает в регенерирующей печени неизвестные разе изменения:

выявлен новый пик в содержании ДНК клеток печени через 13 часов )сле операции;

установлено увеличение удельной активности ДНК митохондрий через 5 часов, а ядер клеток - через 19 часов после операции частичной юатэктомии;

показано значительное увеличение включения С-оротата во все жученные фракции быстрометящейся РНК. Впервые высказано предположение о биостимулирующем гепатотроп-

м действии продигиозана с учётом прокоторной роли митохондрий в

туляции репликационных процессов в печени. Впервые оделены положительные и отрицательные качества действия

одигиозана и рибоксина по отдельности и в комплексе на показате-обмена нуклеиновых кислот и состояние липидтранспортной системы

и регенерации повреждённой свободными радикалами и не повреждён-

й печени. Новыми являются данные о способности комплекса проди-

озан+рибоксин усиливать репарационный синтез ДНК и одновременно

епятствовать снижению содержания апопротбинов ЛПШ при действии

ниэирущего излучения в дозе I Гр,

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проченных исследований показывают необходимость двухэтапного подхо-

в поиске и обосновании модуляторов регенерационной гипертрофии тени. I. Обоснована необходимость дальнейших фундаментальных ис-здований по выделению эндогенных гепатотропных факторов шноци-эно-макрофагального происхождения с целью создания новых лекарст-*ных препаратов, а также по совершенствованию экзогенных целена-івленньїх влияний на моноцитарно - макрофагаяьную систем с целью

модификации ее гепатотрошой активности. 2. Обоснована необходимость дальнейшей разработки подходов к оценке экспортной функции печени, как наиболее адекватного способа изучения функциональной зрелости регенерирующих гепатоцитов.

Практическая ценность работа определяется рекомендацией комплекса продигиозан+рибоксин для стимуляции регенерационных процессов в печени, составляющей в эксперименте около 4 часов. Определены состояния печени, при которых целесообразно применение продигиозана (изначально не повреждённая печень) или рибоксина (изначальное токсическое повреждение печени) в условиях её последующей регенерации. Обоснован тетрахлорметановый нагрузочный тест, позволяющий в эксперименте оценить эффективность модуляции регенерационных процессов. Для дальнейшего экспериментально-клинического испытания целесообразно рекомендовать:

5. Применение продигиозана и сходных полисахаридных и липополиса-харидных комплексов в предоперационном периоде в хирургической ге-патологии.

6. Применение продигиозана и рибоксина с целью стимуляции репарационного синтеза ДНК при внешнем гамма-облучении в дозах порядка I Гр.

7. Более широкое применение рибоксина при токсико-экологических повреждениях печени с целью коррекции нарушений липидтранспортной системы, а следовательно профилактики развтия атеросклероза.

Основные положения, выносимые на публичную защиту.

8. Продигиозан стимулирует процессы в митотическую фазу регенераторной гипертрофии печени независимо от исходного повреждения печени тетрахлорметаном.

9. Продигиозан стимулирует процессы в гипертрофическую фазу регене рационной гипертрофии печени, способствуя восстановлению функционирования липидтранспортной системы.

10. Рибоксин обеспечивает положительное влияние на восстановление липидтранспортной системы у крыс после 70%-ной частичной гепатэктс мии предварительно повреждённой тетрахлорметаном печени.

11. Комплекс препаратов продигиозан+рибоксин стимулирует репарациоь ный синтез ДНК в регенерирующей печени крыс, облучённых в дозе I I

Апробация работы. Результаты проведенных исследований и полок* ния диссертации докладывались и обсуждались на внутриинститутских

ференциях молодых специалистов (Витебск,1990, 1991,1992), меж-эраторном семинаре НИИ биологической и медицинской химии РАМН сква, 1992), международной конференции "Экологическая патоло-и её фармакокоррекция",(Чита,1991), 4 Республиканском съезде чей - лаборантов,(Гродно, 1992), 9 международном конгрессе зазваний печени (Базель,1992). Jo материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Збъём и структура диссертации. Диссертация изложена на 210 стра-ах машинописи и состоит из введения, аналитического обзора ли-атуры, дагодкчзской главы, 2 глав изложения полученных резуль-зв, обсуждения полученных результатов, выводов, практических эмендаций и литературного указателя» Работа содержит 42 табли-л 17 рисунков. Список цитируемой литературы включает 358 библио-фических наименований. Збъекты и методы исследований.

эта выполнена на 553 белых, беспородных, лабораторных крысах -цах со средней массой тела 180 - 2000г. Операцию удаления 30% и массы печени производили в соответствии с классическим методом інса и Андерсена (І93І). Контрольные животные подвергались лож-операций, включая лапаротомкю без удаления долей печени. Затрав-гетрахлорметаном производили двумя способами. Для предваритель-э повреждения печени тєтрахлорметан вводили трёхкратно в желудок эз зонд в смеси с оливковым маслом 1:1 (об/об) по 0,7мл смеси на ;у с интервалом 48 часов между введениями. В качестве пробы на гояние регенераторных процессов в печени тєтрахлорметан вводили жратно внутрибрюшинно в дозе 0,15мл на крысу. Однократное облу-іе осуществляли на гамма-установке УГУ-420 с мощностью дозы 2,7'

Гр 1с и фокусным расстоянием Зм, в дозах 0,5; 1,0 и 5,0 Гр. эацию 70% частичной гепатэктомии производили спустя 72 часа пос-гретьего введения тетрахлорметана или спустя 16 суток после облу-w крыс (период максимального развития транзиторной радиационной гапопротеинэмии)(А.А.Чиркин и соавторы 1990-1992). Продигиозан уши внутрибрюшинно за 24 часа до операции частичной гепатэктомии >зе 1мл 0,005% раствора (Д.Н.Маянский и соавт.,1985). Рибоксин \kt.v внутрибрюшинно в дозе 1мл 20% раствора, трёхкратно и пяти-?но, с .суточным интервалом между введениями, после операции. Кон-[ьным животным вводили 1мл физиологического раствора хлорида нат-внутрибрюшинно. В основных сериях животных забивали через 24 ча-

ca, 4, б и 10 суток после операции частичной гепатэктомии. Для определения максимумов митотической акивности и интенсивности включения %-тимидина в ДНК, крыс забивали с интервалом 3 часа в диапазоне 13-28 часов после операции частичной гепатэктомии.

Обмен нуклеиновых кислот изучали в образцах печени, замороженных в жидком азоте. Интенсивность синтеза ДНК оценивали по включе нию %-тимидина, который вводили за 2 часа до декаяитации животин в дозе 100 мкКи/крыса (О.Ю.Абакумова и соавт.,1989). Интенсивност синтеза быстрометящейся РНК оценивали по включению С-оротата, к торый вводили за I час до декапитации в дозе 40 мкКи/крыса (О.Ю. Абакумова и соавт.,1989). Выделение ядер и околоядерного (ОЯМ) ма териала а также митохондрий и Sjg фракции производили методом диф ференциального центрифугирования (0.Ю.Абакумова,1977; cietmaa/1?.Х Macumotfa ОУи. et oi. ,1974). Количество ДНК и РНК определяли спек трофотометрически (вйобеС Q. , Potted Y.R,. ,1968). Для определения радиоактивности нуклеиновых кислот использовали фильтры "Сынпор" 3 (ЧСФР), сцинтилляционную жидкость ЖС-8 и сцинти -ляционный счётчик СБС-2 с эффективности счёта 60%. Радиоактивность кислоторастЕ римой фракции подсчитывали в жидкости Брзя. Удельную активность расчитывали на 1мг ДНК или РНК соответствующей фракции.

В сыворотке крови определяли содержание триглицеридов и общих липидов с помощью наборов фирмы "Лахема"(ЧСФР). Липопротеины разд ляли преципитационным методом (Н.В,Перова,1983) и определяли соде жание холестерина ЛПЩ,ЛП0НПДПНП (В.Г.Колб, В.С.Камышников 1982) Фосфолипидный состав ЛПВП оценивали методом тонкослойной хроматографии (В.Л.Зубер,1982) а содержание общих фосфолипидов ЛГЩП - ао Свенбергу и Свеннерхолму (Н.В.Перова,1983). Белково-липидный сосі основных лишпротеинов исследовали по прописи М.П.Антонова и coai 1986. Подсчёт митозов и двуядерных клеток производили в срезах о* рашенных гематоксилин-эозином. Статистическая обработка данных щ водилась методом вариационной статистики с использованием критери Стъюдента.