Введение к работе
Актуальность проблемы. Урокиназа представляет собой внеклеточную протеазу с узкой субстратной специфичностью, принимающую участие в активации плазминогена, регуляции процессов перестройки внеклеточного матрикса и морфогенеза тканей (Andreasen et al., 2000; Tkachuk et al., 1996). Наличие в структуре урокиназы «ростового» домена обеспечивает ее высокоаффинное взаимодействие с урокиназным рецептором на поверхности клеток (Appella et al., 1987). Связывание урокиназы с рецептором приводит не только к локализации внеклеточного протеолиза на поверхности клетки, но и активирует внутриклеточную сигнализацию, стимулирует миграцию и пролиферацию клеток (Chapman, 1997). В настоящее время молекулярные механизмы, лежащие в основе регуляции урокиназой данных процессов, не выяснены.
Урокиназа состоит из трех доменов: «ростового» домена, гомологичного по структуре эпидермальному фактору роста, крингл-дрмена и протеолитического домена. До сих пор считалось, что сигнальные эффекты урокиназы обеспечиваются при связывании урокиназы с клетками благодаря высокоаффинному взаимодействию ее «ростового» домена с урокиназным рецептором. Урокиназный рецептор не имеет трансмембранного и цитоплазматического доменов, а закреплен в мембране с помощью гликозил-фосфатидилинозитолыюго (ГФИ) якоря (Ploug et al., 1991). Данная особенность не позволяет ему непосредственно передавать сигнал от урокиназы внутрь клетки. Поэтому в последние годы ведется поиск других возможных белков-партнеров урокиназы, способных напрямую активировать сигнальные системы клетки. При этом ГФИ-заякоренный урокиназный рецептор может выполнять роль своеобразной «ловушки» урокиназы, связывающей и правильно ориентирующей ее на поверхности клетки (Dumler et al., 1999).
В настоящее время появились данные о возможном участии эндоцитирующих рецепторов из семейства ЛНП-рецептора в опосредовании сигнальных эффектов урокиназы (Goretzki and Mueller, 1998). Предполагается, что они могут регулировать активность урокиназы не только путем ее удаления с клеточной поверхности, но и активируя сигнальные пути, специфичные для данной группы белков. Такое предположение кажется весьма вероятным, поскольку в последние два года появились убедительные доказательства в пользу сигнальной функции эндоцитирующих рецепторов, а также их участия в регуляции процессов миргации клеток и морфогенеза тканей (Cooper and Howell, 1999; Gliemann, 1998; Gotthardt et al., 2000).
Недавно в нашей лаборатории с помощью набора рекомбинантных форм урокиназы, экспрессированных в Е. coli, было показано существование на клетках нового участка связывания урокиназы, взаимодействие с которым не зависит от наличия в ее структуре «ростового» домена. Более того, рекомбинантная форма урокиназы, лишенная «ростового» домена, не только связывается с клетками, но и стимулирует миграцию гладкомышечных клеток сосудов человека (Mukhina et al., 2000; Poliakov et al., 1999). Нами было высказано предположение, что найденный участок связывания может быть вовлечен не только в регуляцию хемотактической активности урокиназы, но и принимать участие в регуляции ее эндоцитоза. Таким образом, идентификация, выделение и характеристика белка, представляющего собой данный участок связывания, является одним из приоритетных направлений в области изучения сигнальных и миграционных эффектов урокиназы.
В связи с этим, цель нашей работы состояла в изучении свойств нового участка связывания урокиназы, отличного от известного урокиназного рецептора.
Для этого мы поставили перед собой следующие экспериментальные задачи:
-
Определить возможность образования in vivo и in vitro формы урокиназы, лишенной «ростового» домена и неспособной связываться с рецептором урокиназы;
-
Провести сравнительный анализ связывания, эндоцитоза и деградации клетками полноразмерной урокиназы и формы урокиназы, лишенной «ростового» домена;
-
Выделить и идентифицировать белок, представляющий собой новый участок связывания урокиназы.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые продемонстрирован новый тип протеолитического процессинга урокиназы под действием плазмина, приводящий к расщеплению связи Lys46-Ser47 в участке, соединяющем ее «ростовой» и крингл- домены. Показано, что форма урокиназы, лишенная «ростового» домена, может образовываться на поверхности клеток. Установлено, что в результате отщепления «ростового» домена урокиназа становится неспособной взаимодействовать с урокиназным рецептором и, в отличие от полноразмерной формы, подвергается быстрому эндоцитозу и внутриклеточной деградации. Показано, что интернализация урокиназы, лишенной «ростового» домена, опосредуется белками из семейства ЛНП-рецептора. Получены результаты, свидетельствующие об ингибировании образования урокиназы, лишенной «ростового» домена, под действием плазмина в присутствии урокиназного рецептора. Высказано предположение, что данное свойство урокиназного рецептора может лежать в основе его способности замедлять шггерналнзацию полноразмерной урокиназы и экспонировать ее длительное время на поверхности клетки. С помощью аффинной хроматографии и лигандного блотгинга проведен поиск белков, способных взаимодействовать с формой урокиназы, лишенной «ростового» домена. Данным методом в лизатах клеток линии U937 и гладкомышечных клетках сосудов человека выявлен белок с кажущейся мол. массой 210 кДа, участок связывания с которым находится в протеолитическом домене урокиназы. Установлено, что этот белок локализуется в плазматических мембранах и состоит из нескольких субъединиц, связанных между собой дисульфидными связями. Методом масс-спектроскопии показано, что в структуре 210-кДа белка находятся иммуноглобулиновые повторы С2 типа, что может объяснять его способность взаимодействовать с различными антителами к иммуноглобулинам. Высказано предположение, что 210-кДа белок может обеспечивать связывание урокиназы без «ростового» домена с поверхностью клеток, а также принимать участие в регуляции ее эндоцитоза и хемотактической активности.
Результаты данной работы могут способствовать более глубокому пониманию молекулярных механизмов функционирования урокиназы, а также вносят определенный вклад в изучение фундаментальной проблемы роли внеклеточных протеаз в регуляции функционального состояния клетки.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях 8th Swiss Workshop of Methodology in Receptor Research (Мочах, Швейцария, 1998), The YD* International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation (Лес Диаблеретс, Швейцария, 1999), XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (Хамамацу, Япония, 2000), на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии РК НІЖ МЗ РФ (24 ноября 2000 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, 1 принята к печати.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 29 рисунками. Список литературы включает 210 источников.