Введение к работе
Актуальность темы исследования. Общее число генов, экспрессирующихся в клетках человека или других млекопитающих составляет, вероятно, не менее, чем 50 000-100 000. Из них от' 10 000 до 20 000 генов экспрессируется в каждой соматической клетке. В настоящее 'время анализ экспрессии генов в клетках различных типов проводится " на уровне белковых продуктов с использованием метода двумерного электрофореза. Применение этого метода позволяет одновременно определять содержание 1 000 - 2 000 индивидуальных белков, каждый из которых составляет не менее 0,001% от общего клеточного белка, и анализировать их количественные изменения в клетках и тканях при дифференцировке, патологических состояниях, вирусных заражениях, лекарственной терапии, интоксикация и других воздествиях на организм.
Для обнаружения и клонирования генов, дифференциально экспрессирующихся при различных воздействиях, используется также метод дифференциального скрининга кДНК-библиотек, выявляющий изменения на уровне мРНК. Метод основан на сравнительной гибридизации кДНК-библиотеки определенных клеток (тканей) с радиоактивно-меченными препаратами мРНК (кДНК), выделенных из того
Принятые сокращения:
дэРНК - дифференциально экспрессирующаяся мРНК; ПААГ полиакриламидный гель'; M-MLV - вирус лейкемии мышей Колония; AMV -вирус миобластоза птиц; HIV-1 -вирус иммунодеффицита человека 1; RT-PCR - полимеразная цепная реакция, проведенная на кДНК; dTTP(3'F) - 3'-фтор-2'3'-дидезоксириботимидин-5'-трифосфат; dTTPC3 'Ш?) - 3'-амино-2' ,3'-дидезоксириботимидин-5'-трифосфат; dTTP(3'N,7 - 3'-азидо-2',3'-дидезоксириботимидин-5'-трифосфат; агаТТР(3 НН?) - 3'-амино-3'-дезоксиарбинотимидин-5'-трифосфат; araTTP(3'N.,7 - З'-азидо-З'-дезоксиарабинотимидин-5'-грифосфат; ddUTP(5АА);-2' 3'-дидезокси-5-(3-амикопропенил-)-уридин-5'-трифос-фат; ddUTP(5A,\»Bio), ddUTP(5AA-Fam) , ddUTP(5AA-Joe) , dUTP(5AA-Кох), ddUTP(5;>.A-TMR) - 5-аллиламино-производные ddUTP, имеющие в качестве репортерках групп биотиновый или флуоресцентные остатки.
же источника до и после воздействия, требует длн анализа нескольких месяцев работы и сотни микрограмм поли(А)"*~РНК. Кроме того, в конечном итоге он малоинформативен, поскольку приводит к получению единичных клонов дифференциально экспрессирующихся мРНК (дэРНЮ.
В настоящей диссертационной работе предлагается новый метод фингерпрингинга РНК, позволяющий проводить количественное сравнение популяций поли(А)*РНК без конструирования кДНК-библиотек. Всего несколько дней и 10 микрограмм поли(А)+РНК требуется исследователю для того, чтобы с помощью этого метода получить данные по изменению относительных концентраций нескольких сотен индивидуальных мРНК. Последующее определение первичной структуры кДНК, представленных отдельной полосой на электрофореграмме и соответствующих индивидуальным дэРНК, позволяет идентифицировать эти РНК по сопоставлению, с банком данных нуклеотидных последовательностей, а также дает возможность амплифицировать и клонировать полноразмерные кДНК, что особенно важно для неизвестных мРНК.
Цель исследования заключалась в разработке нового удобного и информативного метода сравнительного анализа содержания индивидуальных мРНК в популяциях поли(А)*РНК, основанного на получении коротких кДНК-продуктов дискретной длины, соответствующих практически каждой индивидуальной мРНК.
Новизна результатов. В диссертационной работе предложен новый метод фингерпринтинга РНК. Представлены данные, демонстрирующие возможность одновременно анализировать с помощью этого метода экспрессию большого числа генов, что является важным шагом в изучении изменения генной активности и ее регуляции. Метод
был применен и показал свою информативность при анализе спектров поли(А)+РНК различных тканей человека у различных индивидуумов. Выявлены изменения представленности отдельных РНК при циррозе печени и миоме матки человека по сравнению с нормальными тканями, а также при дифференцировке клеток эмбриональной карциномы мыши F9. Дальнейшее развитие метода, включающее прямое секвенирование коротких кДНК-продуктов, предоставило новые возможности для обнаружения и клонирования генов, изменяющих свою экспрессию и ходе дифференцировки, опухолевого процесса и т.д.. В ходе исследования проведен анализ субстратных и терминаторных свойств новых синтезированных 5-аллиламиновых производных ddUTP для различных обратных транскриптаз. Получены новые данные о влиянии первичной структуры и длины праймера на эффективность синтеза кДНК обратной транскриптаэой M-MLV с полностью комплементарного матрице праймера и праймера с единичными некомплементарными нуклеотидами.
Практическая ценность работы. Предложенный метод позволяет изучать регуляцию экспрессии ансамблей генов наряду с методами двумерного электрофореза белков и дифференциального скрининга кДНК-библиотек. Анализ спектров поли(А)+РНК может дать ценную информацию для понимания механизмов тканеспецифической регуляции экспрессии генов, и позволяет обнаруживать гены, которые изменяют свою эь. прессию при воздействии на клетку различных агентов, влияющих на ее дифференцировку, клеточный цикл, мутагенез и т.д.. Кроме того, полученные результаты по праймерной и субстратной специфичности обратных транскриптаз могут быть применены в секвенировании и амплификации ДНК и РНК, а также в ингибиторном анализе полимеризующих ферментов.
Апробация работы, Результаты работы были представлены на V Всесоюзной конференции по структуре, функции и биосинтезу нуклеиновых кислот в Пущино в 1991 г., на III Международной конференции "Геном человека" в Сан-Диего (США) в 1991 г., на II Международной Гауссовой конференции в Мюнхене (Германия) в 1993 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи и одно тезисное сообщение.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы" и "Список литературы", работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включающего 16 рисунков, 11 таблиц и список литературы, содержащий 110 ссылок.