Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на уже имеющиеся болаа чем 2000 продуцентов сайт-специфических зндонуклэаз (рсстряктаз), помск новых продуцентов проводится so все больших масштабах. Это обусловлено том обстоятельством, что обнаружение экдовухлеаз с новыми спацифячкосгяии расширяет возможности конструирования рекомбянантных ДНК, секаенмрованкя ДНК я RFLP-вкалкза зукариогный геномов. Обнаружение фермента с " новой специфичностью иногда приводит к совершенно новым технологиям в -еі.ної якиекеряи. Часто оказывается, что новый штвих- продуцент эидонуклз&зы с: уже известной специфичность» синтезирует фермент в большей количестве или более стабильный, тогда при производства фермента новому штамму отдают предпочтение.
Сайт-слецяфическяв эндонуклейзы я ивтклазы важалй обьэкт дяя решения проблемы белок-нуклеинового узнавания. Прв этом зспектге использования этик ферментов ваяно кмв.ь ятамкы-продуцэнты, которые позволяют получать количества рэстркктаэ и иєтелез достаточные для физико-химических экспериментов.
До последнего времени основное внимание мсслэцозателай сосредотачивалось на одном компоненте системы рестрикции-модификации, на сайт-специфических эндонуклэгзая, поскольку они являются основным инструментом генной янжонерни. Однако, а послвдиэа врэмя стало ясно, что на основе сайг-специфических иетилаз яогут быть разработаны перспективные методы для решения задач гонкой зкиенерик. В качестве примера можно привести кетоды увеличения специфичности расщепления ДНК рестриктазакк после её продваритель-кого метилироваккя, технику «пяты Ахиллеса> я другке метода.
Таким образом, задача пояска новых продуцентов рестриктаз и метилаз остаётся актуальной и в настоящее время. особенно перспективен поиск штамков продуцентоа этик фе^кангоа сради термофильных микроорганизмов, поскольку белки из теркофвшь!!ЫХ макроорганизмов более стабильны при хранении я болеа устс5чквы к различным денатурирующим бегок воздействиям, чем их аналоги яз кезофилышх организмов. Кроме того после клонирования геиов термофильных микроорганизмов в Е. coli существенно упрощавїся процедура выделения соответствую!»!!» бел.чои, поскольку a большинстве таких случаев значительная очистка достигается простым прогревом экстракта рекомбинанта.
Цель а задачи исследования. Задачей исследования былс выдэявнке ферментов скстен рестрикции-кодификация из штаммов Bscilles ~ cereus 83 и Bacillus licheniformis 736, опродзленіае субстратно! специфичности выделанных рєстрмктаз и точен расееплэния ДНК этими ферментанх. Шалью работы был также поиск новых продуцентов ^айт-специфических эндокуклеаз из природных изояятсв термофильных бактери8 э надежде найти продуценты рестриктаз с новой специфичностью .
Ядулшя новизна. В клетках В. cereus 83 и В.licheniformis 736
зпгрзы обнаружены сакт-специфхческие эндонукеаэы К
соотватствушцсв км ие.илазы. Создана коллекция из 100 штампов терязфжпькых бактерий. Проведён скрининг коллекции на наличие рестрижтаз. Найден штамн-продуцент {Bacillus species ЦІЦ) рестряктазы с :-:02ой специфичностью. Разработаны схемы ОЧКСТКК дс фунадлокально чистого состояния рестриктаз из штанков В. cereus 83 3. licheniformis 736, В. species Ш11 и сайт-специфических метхлаа яз В.versus S3 к Б.licheniformis 736. Определены субстратная специфичность к течки расщепления ДНК для рестриктаз ВсеЗЗІ, BIi73SI. BspLUlllK BspLUllII. Растриктаза ВсеВЗЇ обладает нової специфичностью. Она узнает на ДНК нзпалиндрокную последова-
5'-CTTGAG1jN^-3*
тэльнссть из S иуклаотндов и расщепляет
З'-СААСТСЫК^-Б'
ДНК Еблмзи сайта, как указано стрелками. Она относится И IV ткну сайт-слецнфическик экдонунлзаз, поскольку стимулируется а-арэиозкл-Ь-нвтконнно-ч я не стимулируется ІТ&. РострнкТбЗі Bspimil узкаат новую палиндромную последовательность A*CATGT I рас^эпляэг эе, как указано стрелкой.' BcpLUllII являете) лзошмзомером ХЬ&Х, a B1;','3SI - изошизомер Ес< 311.
Практическая ценность работы. Рестриктазы Все831 и BspLUllT. являются новыми аналитическими реагентами -при изучении структурі ДКХ и новыми инструментами для конструирования рекомбинантных ДНК. BspLUllI дает липкие кончики, идентичные липкин кончикан, производимый рестркктазамк Ncol к ScpHI. Следовательно, парі BspLU' II с Kcol к BcpHI с Wcol могут быть использованы ДЛІ ферментативной селекции рекомЗнкантких ДНІС. В состав узнаваено) последовательность ScpLUllI входит триплет AUG (кодон нетионина) і поэтому эта рестриктаза можег быть использована дл/ конструирования суперпрпдуцентов с хннкчиск* синтезированным] генами. Сакт-спецкфические эндон;клепзы 81І7361 к BspLUIli:
П9л1*этся из013*3вкерани ужа известных рвстрихтаз ВсоЗХІ я Sbal. Выяод Bllt36t sa штаикё Я, llchetiiformis делает этот штеии перспективной альтернативой штакиу й.соіі зі а качестэ продуцента рвстрпнтзы огвй специфичности. Выделение сайг- спецкфячзсйах метялаэ М ВП733Ї и, Н ВсеВЗІ вткрызает возможность полной характерястйки систем йлдифйкацни'рестрякцяи а аганках B.Hchetiifortnla В.сегеив 83.
Апробация рдбош, Материалы диееэртамйй яокладызалксь на ежегодной научной конференция Института бзгка fAU t1333 г. 5 ж Геряакс-йосіочкоаЕропвйскон совещании по коордтїнацмя s биотвянйло-
ГЯЯ 1-4 ЙЙНЯ 1903 Г,
Публикации. По ньтврк&язк аиссерт&ц»» опубликовано 4 рабоїн, 1 работа находятся в печати,
объем и структура диссертации, Диссертаций состоят кз введения, обзора литературы, описания натеркалов я методов йсслвдоаания, результатов я ах обсужден»4, 8Ы88йов я спкска цитируемой лятературы.