Введение к работе
Актуальность проблемы
В последнее время психрофилы и их ферменты привлекают к себе все большее внимание исследователей вследствие своей специфической способности функционировать в условиях низкой температуры окружающей среды. Психрофильными называются организмы, способные выживать и успешно развиваться в условиях пониженной температуры. Психрофилы широко представлены в живом мире и включают представителей как про-, так и эукариот. На сегодняшний день в эту группу включены многие бактерии, грибы, растения и некоторые виды животных (насекомые и позвоночные). Несмотря на чрезвычайно широкое распространение и разнообразие, психрофилы сравнительно мало изучены. Благодаря повышенной каталитической эффективности адаптированные к пониженным температурам ферменты рассматриваются в качестве ценных инструментов для биотехнологических целей, медицинской и пищевой промышленности.
Помимо практической значимости использования психрофильных ферментов в практических целях следует отметить важность проведения фундаментальных исследований, связанных с изучением структурных основ повышенной каталитической эффективности ферментов организмов, обитающих при пониженных температурах.
Молекулярные основы функционирования психрофильных ферментов к настоящему моменту неизвестны. Сравнение первичных структур ферментов-гомологов показывает, что аминокислотные остатки, формирующие их активные центры и субстрат-связывающие районы, высоко консервативны. Этот факт, в совокупности с данными о том, что ферменты психрофилов характеризуются, как правило, заметно сниженной термостабильностью, позволил выдвинуть и отчасти подтвердить гипотезу, объясняющую их высокую удельную активность повышенной гибкостью молекулы. Однако данная гипотеза является весьма общей, и, по-видимому, неприложима к ряду конкретных случаев.
В этом смысле чрезвычайно большой интерес для исследователей представляют адаптированные к пониженным температурам трипсины и трипсиноподобные ферменты. Трипсины позвоночных - одни из наиболее изученных представителей сериновых протеиназ, и поэтому сравнительный анализ аминокислотных последовательностей, третичной структуры, кинетических параметров, физико-химических свойств мезофильных и психрофильных ферментов и их мутантных форм может пролить свет на механизм адаптации к пониженным температурам.
В результате проведенного недавно широкомасштабного скрининга психрофильных микроорганизмов был обнаружен и идентифицирован штамм Serrratia proteomaculans, продуцирующий разнообразные протеиназы, в том числе, активные при пониженной температуре (Костенко Ю.Г. и др. 2001. Патент РФ № 2175350). Результаты проведенных медико-биологических
испытаний показали, что данный штамм не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.
Объектом исследования настоящей работы является обнаруженная и выделенная нами ранее неизвестная протеиназа из психрофильного грамотрицательного микроорганизма Serratia proteamaculans.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является выделение, очистка и структурно-функциональная характеристика новой психрофильной протеиназы из S. proteamaculans (PSP). Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:
Разработка методики выделения и очистки PSP.
Установление N-концевой последовательности фермента и определение полной аминокислотной последовательности PSP.
Получение рекомбинантного фермента.
Исследование физико-химических и энзиматических свойств PSP.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые выделена и очищена до гомогенного состояния ранее не описанная сериновая протеиназа с трипсиновой специфичностью из грамотрицательного психротолерантного микроорганизма S. proteamaculans. Установлена первичная структура фермента, определено, что новая протеиназа относится к семейству олигопептидаз В (клан SC, семейство S9A по номенклатуре MEROPS).
Показано, что PSP является первой описанной психрофильной олигопептидазой В. Получен рекомбинантный фермент, проведен субстратно-ингибиторный анализ, исследованы физико-химические свойства PSP. Выявлено, что по своим субстратно-ингибиторным свойствам PSP заметно отличается от ранее описанных олигопептидаз.
Обнаружена высокая гомология аминокислотной последовательности PSP с последовательностями олигопептидаз В патогенов человека и животных - Yersinia pestis, Salmonella enterica, Trypanosoma cruzi, Klebsiella pneumoniae, Leishmania amazonensi, рыб и земноводных -Aeromonas hydrophila, растений - Erwinia carotovora. В настоящее время большинство бактериальных олигопептидаз В известны лишь по нуклеотидным последовательностям. Высокая гомология PSP с олигопептидазами из других источников позволяет использовать PSP в качестве модели для поиска лекарственных препаратов против бактериальных и протозойных патогенов.
Апробация работы и публикации
Основные материалы диссертации были представлены на VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2006), XIV, XV, XVI международной конференции и дискуссионном научном клубе
«Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Украина, 2006, 2007, 2009), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы», ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России 2007-2012 годы» (Москва, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009). Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).
По теме диссертации опубликовано 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 172 наименований. Работа изложена на 109 страницах, содержит 35 рисунков и 17 таблиц.