Введение к работе
Актуальность работы. Сорбитдегидрогеназа (СДТ) - фермент, широко распостранешшй в клетках прокариотов (Horwltz et al., 1964) и эукариотов (Lenning, 1984). СДТ осуществляет обратимое, ЫАБ+-зави-симое дегидрирование сорбита до фруктозы. Функционирование полиоль-ного пути метаболизма глюкозы, ключевым ферментом которого служит СДТ, имеет важное физиологическое значение: 1) как аварийный путь снижения алиментарной гипергликемии 2) как система, обеспечивающая трансгидрогеназную реакцию (передача восстановительных эквивалентов в системе nad/nadph з) как источник глицерина в обмене липидов.
Первая публикация о выделении и частичной очистке СДТ появилась еще в 1962 году (Smith, 1962), но только в 80-ых годах возник значительный научный интерес к исследованию функционирования поли-ольного пути и СДТ. Он бил инишкссван пскнятием предположения об обусловленности возникновения диабетических патологий осмотическим дисбалансом клетки, который, в свою очередь, напрямую зависит от активности СДТ (Kinoshita et al., 1981). В условиях диабетической гипергликемии количество метаболизирусмой через этот путь глюкозы возрастает. Это приводит к накоплению сорбита в клетках, который не способен проникать через клеточные мембраны, и осмотическому дисбалансу, инициируя, таким образом, развитие диабетических осложнений (катаракта, отек мозга, ретинопатия, нейропатия). Несмотря на активное изучение этого вопроса сведений в литературе об условиях функционирования и свойствах СДТ мало.
В связи с этим, исследование функционирования СДТ в норме и патологии, возможностей и принципов регуляции ее активности является актуальным и имеет важное научное значение.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление функционирования полиольного пути метаболизма глюкозы в печени и изучение некоторых физико-химических и кинетических свойств СДТ. При этом решались следующие задачи: 1) подбор условий выделения, очистки и хранения СДТ из цитоплазмы клеток печени быка; 2) определение оптимума рН, молекулярной массы, зависимости от температуры и ионной силы, выявление множественных молекулярных форм фермента; 3) исследование кинетических характеристик СДТ из печени быка при различных значениях рН; 4) влияние Сахаров и фосфосахаров, некоторых ингибиторов; 5) изучение стереоспецифичности; 6) проведение сравнительного анализа активностей СДТ с ферментами маркерами -алкогольдегидрогеназой (АДГ) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой (Г6ФДТ).
Научная новизна работы. Нами установлено, что в печени быка.
крысы, суслика и собаки активно функционирует полиольный путь метаболизма глюкозы. Выявлено ингибирующее действие ряда углеводов и продуктов их метаболизма на активность СДТ. Полученные результаты могут свидетельствовать в пользу регуляторного влияния фосфосахаров на функционирование полиольного пути в печени. Изучение стереоспе-цифичности СДГ показало, что на ферментативную активность влияет не только цис-2,4 дигидроксиконфигурация, но и длина углеродной цепи полиола. Данные кинетических исследований СДГ выявили, что в щелочных условиях (рН 9,0 и 10,0) и концентрации субстрата (3,0-4,0 мм") фермент начинает проявлять кооперативные свойства, о чем свидетельствует увеличение коэффициента Хилла. Подробно изучено влияние ионной силы, температуры и рН на активность СДГ.
Практическая значимость работы. Представленные в диссертации результаты расширяют и углубляют сведения о полиольном пути метаболизма глюкозы. Выявление активного функционирования этого пути и условий его регуляции в норме и патологии, а также изучение физико-химических и кинетических характеристик СДГ, может способствовать разработке лекарственных препаратов при лечении диабета и диабетических осложнений. Полученные данные могут также найти применение в медико-биологической практике, в биотехнологии.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции молодых ученых (Пущино, 1988), Всесоюзной конференции по гиСернации (Пущино, 1990), заседании кафедры физико-химической биологии МГУ (1992) и расширенном семинаре кафедры физико-химической биологии МГУ (1995).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (методы и объект исследования), пяти глав, представляющих основные результаты работы и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на стр машинописного текста, содержит 27 рисунков и 7 таблиц.