Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16-58
1.1. Сахарный диабет и его связь с нарушениями функций цнс 17
1.2. Инсулиновая сигнальная система мозга в норме и при сахарном диабете 18
1.2.1. Инсулин и инсулиновые рецепторы в мозге 18
1.2.2. Инсулиновая сигнальная система в ЦНС 21
1.2.3. Функции инсулина в ЦНС 24
1.2.4. Дисфункции в инсулиновой сигнальной системе мозга при сахарном диабете и их роль в развитии метаболических и когнитивных расстройств 27
1.2.5. Подходы, направленные на восстановление инсулиновой системы мозга 30
1.3. Серотониновая сигнальная система мозга в норме и при сахарном диабете 34
1.3.1. Структурно-функциональная организация серотониновой сигнальной системы и распространенность серотониновых рецепторов в ЦНС 35
1.3.2. Нарушения в серотониновой системе мозга при диабетической патологии и пути для их коррекции 38
1.3.3. Подходы, направленные на восстановление серотониновой системы мозга 42
1.4. Дофаминовая сигнальная система мозга в норме и при сахарном диабете 43
1.4.1. Структурно-функциональная организация дофаминовой сигнальной системы 44
1.4.2. Дисфункции дофаминовой системы мозга при сахарном диабете и метаболическом синдроме 47
1.4.3. Роль дофаминовой системы мозга в контроле пищевого поведения 48
1.5. Меланокортиновая сигнальная система мозга в этиологии и патогенезе сахарного диабета 50
1.5.1. Структурно-функциональная организация меланокортиновой сигнальной системы 51
1.5.2. Нарушения в меланокортиновой сигнальной системе гипоталамуса и их роль в развитии метаболического синдрома и предиабетических состояний 53
1.5.3. Взаимосвязь между меланокортиновой и другими сигнальными системами гипоталамуса 56
ГЛАВА 2. Материалы и методы 59-74
2.1. Экспериментальные животные 59
2.2. Химические реактивы 59
2.3. Экспериментальные модели диабета
2.3.1. Модель острого сахарного диабета 1-го типа 60
2.3.2. Модель мягкого пролонгированного сахарного диабета 1-го типа 60
2.3.3. Модель неонатального сахарного диабета 2-го типа 61
2.3.4. Модель метаболического СД2, вызванного высокожировой диетой 62
2.4. Биохимические показатели развития диабета 62
2.4.1. Определение содержания глюкозы в крови и моче 62
2.4.2. Тест на толерантность к глюкозе и инсулину 63
2.4.3. Характеристика липидного статуса 63
2.4.4. Определение содержания инсулина в сыворотке крови крыс 63
2.5. Водный тест Морриса 64
2.6. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени, совмещенная с обратной транскрипцией 65
2.6.1. Выделение тотальной РНК 65
2.6.2. Обратная транскрипция, совмещенная с полимеразной цепной реакцией 66
2.6.3. Полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени (qPCR) 66
2.6.4. Анализ данных полимеразной цепной реакции с детекцией в реальном времени (qPCR) 67
2.7. Выделение фракций частично очищенных плазматических мембран из тканей мозга или из тканей гипоталамуса 68
2.8. Определение активности аденилатциклазы 68
2.9. Определение ГТФ-связывания G-белков 69
2.10. Иммуноблоттинг 70
2.11. Определение специфического связывания инсулина с клеточными мембранами мозга и печени 72
2.12. Статистическая обработка полученных результатов 73
ГЛАВА 3. Результаты 75-131
3.1. Функциональные нарушения в ЦНС у самцов крыс с острым сахарным диабетом 1-го типа 75
3.1.1. Характеристика стрептозотоциновой модели острого сахарного диабета 1-го типа у самцов крыс.. 75
3.1.2. Характеристика инсулиновой системы в мозге крыс с острым сахарным диабетом 1-го типа 76
3.1.3. Функциональная активность аденилатциклазной системы в мозге крыс с острым сахарным диабетом 1-го типа 79
3.2. Функциональные нарушения в ЦНС у самцов крыс с пролонгированным мягким сахарным диабетом 1-го типа и влияние на них интраназально вводимого инсулина 82
3.2.1. Характеристика стрептозотоциновой модели пролонгированного мягкого сахарного диабета 1-го типа у самцов крыс и ее обработка интраназально вводимым инсулином. 82
3.2.2. Функциональная активность аденилатциклазной системы в мозге крыс с пролонгированным мягким сахарным диабетом 1-го типа и влияние на нее длительной обработки интраназально вводимым инсулином 84
3.2.3. Влияние обработки интраназально вводимым инсулином крыс с мягким сахарным диабетом 1-го типа на негативную регуляцию аденилатциклазы агонистами дофаминовых и серотониновых рецепторов в гипоталамусе 89
3.2.4. Пространственная память и способность к обучению у крыс с пролонгированным мягким сахарным диабетом 1-го типа 92
3.3. Метаболические параметры и функциональная активность сигнальных систем у самцов крыс с неонатальной моделью сахарного диабета 2-го типа и влияние обработки интраназально вводимыми инсулином и серотонином 95
3.3.1. Метаболические показатели у самцов крыс с неонатальной моделью СД2 и влияние на них обработки интраназальным инсулином и серотонином 95
3.3.2. Изучение инсулиновой сигнальной системы в печени самцов крыс с неонатальной моделью СД2 и влияние на нее обработки животных интраназальным инсулином и серотонином 100
3.3.3. Влияние интраназально вводимого инсулина на функциональную активность чувствительной к гормонам и нейромедиаторам аденилатциклазной сигнальной системы в гипоталамусе самцов крыс с неонатальным СД2 104
3.3.4. Влияние интраназально вводимого серотонина на функциональную активность чувствительной к гормонам и нейромедиаторам аденилатциклазной сигнальной системы в гипоталамусе самцов крыс с неонатальным СД2 108
3.4 Влияние интраназального инсулина и серотонина на когнитивные функции крыс с неонатальной моделью сахарного диабета 2-го типа 113
3.4.1. Метаболические показатели у самок крыс с неонатальной моделью СД2 и влияние на них обработки интраназальным инсулином и серотонином 113
3.4.2. Специфическое связывание инсулина с мембранами мозга и печени самок крыс с неонатальной моделью сахарного диабета 2-го типа 117 3.4.3. Влияние обработки самок крыс с неонатальной моделью сахарного
диабета 2-го типа интраназально вводимыми инсулином и серотонином на
их пространственную память и способность к обучению 120
3.5. Метаболические и гормональные нарушения у самцов крыс с
сахарным диабетом 2-го типа, вызванным высокожировой диетой и низкими дозами стрептозотоцина, и влияние обработки интраназально вводимым серотонином 124
3.5.1. Метаболические изменения у крыс с высокожировой моделью СД2 и влияние обработки интраназально вводимым серотонином 125
3.5.2. Нарушение регуляции АЦ в гипоталамусе крыс с высокожировой моделью СД2 и влияние обработки интраназальным серотонином 129
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 132-148
4.1. Нарушения в гормональных сигнальных системах мозга при сахарном диабете 1-го и 2-го типов 132
4.2. Механизмы действия интраназально вводимого инсулина в условиях диабетической патологии и его эффекты на гормональные системы мозга, метаболические показатели и когнитивные функции 139
4.3. Механизмы действия интраназально вводимого серотонина в условиях диабетической патологии и его эффекты на гормональные системы мозга, метаболические показатели и когнитивные функции 144
Заключение 149-150
Список сокращений 151
Список литературы
- Структурно-функциональная организация серотониновой сигнальной системы и распространенность серотониновых рецепторов в ЦНС
- Модель метаболического СД2, вызванного высокожировой диетой
- Функциональная активность аденилатциклазной системы в мозге крыс с острым сахарным диабетом 1-го типа
- Механизмы действия интраназально вводимого инсулина в условиях диабетической патологии и его эффекты на гормональные системы мозга, метаболические показатели и когнитивные функции
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) диагностирован более чем у 360 миллионов человек, из которых около 10 % страдают сахарным диабетом 1-го типа (СД1) с характерными для него острым дефицитом инсулина и сильно выраженной гипергликемией, и 90 % – сахарным диабетом 2-го типа (СД2), который характеризуется инсулиновой резистентностью, нарушенной толерантностью к глюкозе, дислипидемией. Пациенты с СД имеют тяжелые осложнения со стороны сердечно-сосудистой, нервной, эндокринной, выделительной систем. Несмотря на большой прогресс, достигнутый в последние годы в изучении СД1 и СД2, этиология и патогенез этих заболеваний изучены недостаточно, что тормозит развитие новых технологий для их лечения, своевременной диагностики и профилактики. В последние годы появились данные о том, что важную, а порой и определяющую, роль в развитии СД и его осложнений играют изменения активности сигнальных систем мозга, вовлеченных в регуляцию функций ЦНС и периферических органов и тканей, причем эти изменения могут возникать как вторично, на фоне выраженных метаболических расстройств, характерных для СД, так и первично, являясь одними из причин метаболических и функциональных нарушений, которые при неблагоприятном сценарии переходят в СД2 (de la Monte, 2009; Шпаков, Деркач, 2015; Shpakov et al., 2015; Gaspar et al., 2016). Вследствие этого, коррекция нарушений в нейромедиаторных и гормональных системах мозга может рассматриваться как один из перспективных путей для лечения СД и его осложнений, охватывающих как ЦНС (когнитивный дефицит, диабетическая энцефалопатия), так и периферию (диабетическая кардиомиопатия, нефропатия и др.). Однако до сих пор данные о том, какие сигнальные системы мозга и в какой степени вовлечены в этиологию и патогенез СД весьма немногочисленны и противоречивы. Несмотря на большое число разработок, в условиях клиники практически не используются подходы для лечения СД и его осложнений, основанные на коррекции инсулиновой и других сигнальных систем мозга, чья активность в наибольшей степени меняется при СД1 и СД2. Вследствие этого проблема изучения роли функциональных нарушений в сигнальных системах мозга при СД, а также поиск эффективных путей для их восстановления, как подхода для лечения диабетической патологии, в настоящее время является одной из актуальных и первоочередных задач молекулярной эндокринологии и биохимии.
Наибольший интерес среди сигнальных систем мозга, которые могут быть вовлечены в
этиологию и патогенез СД, представляют меланокортиновая, серотониновая, дофаминовая и
лептиновая системы, поскольку известно, что патологические изменения в них ведут к
нарушению пищевого поведения и периферического метаболизма, инсулиновой
резистентности, дисфункциям со стороны нервной, эндокринной и сердечно-сосудистой систем. Значительное внимание приковано к инсулиновой системе мозга, функции которой нарушены как при СД1, вследствие системного дефицита инсулина в организме, так и при СД2, в условиях нарушения транспорта гормона в мозг и развития инсулиновой резистентности. В гипоталамусе инсулиновая система тесно связана с меланокортиновой и лептиновой системами, вследствие чего нарушения в ней, возникающие в условиях СД, приводят к нарушению ее взаимодействия с другими гипоталамическими системами, что усиливает дезинтеграцию сигнальных систем в гипоталамических нейронах и приводит к метаболическим и функциональным нарушениям на периферии. Однако взаимосвязи между центральными сигнальными системами и нарушениями в них в условиях СД1 и СД2 плохо изучены, что не позволяет выяснить динамику развития гормональных нарушений в ЦНС и определить их роль в развитии патогенетической картины СД.
Несмотря на то, что коррекция сигнальных систем мозга с помощью фармакологических препаратов может представлять собой весьма эффективный подход для лечения СД и его осложнений, достижения в этой области весьма скромные. Среди препаратов, которые сейчас рекомендуют для лечения СД и предупреждения его осложнений, агонист дофаминовых рецепторов 2-го типа (ДА2Р) бромокриптин. Его антидиабетический эффект был обнаружен относительно случайно при лечении бромокриптином пациентов с сочетанием болезни Паркинсона и СД2. Попытки создать эффективные препараты для восстановления инсулиновой
системы мозга на основе ингибиторов инсулиндеградирующего фермента и
протеинфосфотирозинфосфатазы 1B успеха не принесли. В этой связи большие перспективы вновь связывают с интраназальным способом введения инсулина, который прошел апробацию в условиях клиники и используется для лечения болезни Альцгеймера (Derakhshan, Toth, 2013; Novak et al., 2014). Однако при СД интраназально вводимый инсулин (ИИ) практически не используется, что связано с плохой изученностью молекулярных механизмов и мишеней его действия в ЦНС. За последние 15 лет появились данные о положительном влиянии селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, повышающих уровень серотонина в синаптической щели, на метаболические показатели у пациентов с СД2 (Goodnick, 2001; Lustman, Clouse, 2005). В то же время данные о влиянии системного повышения уровня серотонина в ЦНС на метаболические показатели при СД2 отсутствуют, что не позволяет использовать препараты, активирующие серотониновую систему мозга, для лечения диабетической патологии. На решение некоторых из этих проблем направлено предпринятое нами исследование.
Цели и задачи исследования
Цель работы состояла в изучении функционального состояния гормональных сигнальных систем в мозге крыс с сахарным диабетом 1-го и 2-го типов и влияния длительной обработки диабетических животных интраназально вводимыми инсулином (ИИ) и серотонином (ИС) на активность этих систем и зависимые от них метаболические показатели.
В соответствии с этим в конкретные задачи исследования входило:
1. Провести сравнительное изучение гормональной регуляции аденилатциклазной
сигнальной системы (АЦСС) в мозге крыс с краткосрочной моделью острого СД1 и с
пролонгированной моделью мягкого СД1 и сопоставить возникающие нарушения с
выраженностью гипергликемии и гипоинсулинемии.
2. Исследовать влияние длительной обработки крыс с мягким СД1 с помощью ИИ на
функциональную активность АЦСС мозга и метаболические показатели животных.
3. Исследовать метаболические показатели и функциональную активность
гормоночувствительной АЦСС в гипоталамусе и инсулиновой сигнальной системы в печени
крыс с неонатальной моделью СД2 и влияние на них длительной обработки ИИ и ИС.
4. Изучить метаболические показатели и функциональную активность АЦСС в
гипоталамусе крыс с метаболической моделью СД2, вызванной высокожировой диетой и
низкими дозами стрептозотоцина, а также влияние на животных длительной обработки ИС.
5. Исследовать пространственную память и способность к обучению у крыс с мягким
СД1 и неонатальным СД2, и влияние на них длительной обработки ИИ и ИС.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В мозге крыс с экспериментальными моделями СД1 и СД2 меняется функциональная
активность чувствительной к серотонину, дофамину и меланокортиновым пептидам АЦСС,
вовлеченной в регуляцию энергетического обмена и инсулиновой чувствительности.
2. Длительная обработка крыс с СД1 и СД2 с помощью ИИ вызывает частичное
восстановление активности серотониновой, дофаминовой и меланокортиновой систем мозга и
функционального взаимодействия между ними.
-
У крыс с СД1 и СД2 при длительной обработке ИИ улучшаются метаболические показатели и, в случае неонатального СД2, повышается чувствительность тканей к инсулину.
-
Длительная обработка крыс с СД2 с помощью ИС приводит к восстановлению активности сигнальных систем гипоталамуса и зависимых от них метаболических показателей.
-
Длительная обработка крыс с СД1 и СД2 с помощью ИИ и ИС улучшает показатели пространственной памяти и способность к обучению, сниженные в условиях диабетической патологии.
Научная новизна
Впервые показано, что в мозге крыс с различными моделями СД1 нарушена активность гормоночувствительной аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС), причем в наибольшей степени ослаблялись ингибирующие аденилатциклазу (АЦ) каскады, реализуемые через Gi-белки. В гипоталамусе крыс с мягким СД1 снижалась экспрессия Gi-сопряженных
серотониновых рецепторов 1B-подтипа и ДА2Р и ослаблялась передача через них гормональных сигналов, причем длительная обработка ИИ частично их восстанавливала. Впервые показано, что обработка ИИ диабетических крыс приводила к снижению уровня глюкозы при сохранении относительной гипоинсулинемии, что указывает на повышение чувствительности тканей к инсулину. Впервые выявлены нарушения в гормоночувствительной АЦСС в гипоталамусе крыс с метаболической моделью СД2, вызванной высокожировой диетой и низкими дозами стрептозотоцина (СТЗ). У животных также отмечались инсулиновая резистентность, нарушенная толерантность к глюкозе, дислипидемия. Их обработка с помощью ИС улучшала метаболические показатели и частично восстанавливала регуляцию АЦ в гипоталамусе агонистами ДАР, меланокортиновых (МКР) и релаксиновых рецепторов. Впервые обнаружено, что в гипоталамусе крыс с неонатальной моделью СД2 ослаблены гормональные сигналы, реализуемые через ДА2Р и МКР 4-го типа (МК4Р). Обработка ИС восстанавливала активность гипоталамических ДА2Р- и МК4Р-путей, повышая экспрессию генов для ДА2Р и МК4Р, усиливала ингибирующее влияние серотонина на АЦ, изменяла соотношение между каскадами, реализуемыми через различные типы серотониновых рецепторов (СР) (Gs-сопряженные С4,6,7Р/Gi-сопряженные С1Р), ДАР (ДА1Р/ДА2Р) и МКР (МК3Р/МК4Р). Обработка диабетических крыс ИИ также восстанавливала АЦ сигнальные каскады в гипоталамусе с той лишь разницей, что соотношение ДА1Р и ДА2Р в пользу ингибирующего ДА2Р-пути менялось вследствие ослабления экспрессии и активности ДА1Р. Впервые показано, что ИИ и ИС частично восстанавливают чувствительность к инсулину и толерантность к глюкозе у крыс с неонатальным СД2, что иллюстрируется восстановлением инсулиновой сигнальной системы в печени. Полученные данные подтверждают гипотезу о центральном генезе метаболических расстройств при СД2, и указывают на перспективность применения регуляторов гормональных систем мозга для их коррекции. Впервые продемонстрирован восстанавливающий эффект длительной обработки ИИ и ИС на пространственную память и способность к обучению у крыс с пролонгированным мягким СД1 и неонатальным СД2, что является весомым аргументом в пользу применения ИИ и ИС для коррекции когнитивных дисфункций, типичных для СД1 и СД2.
Теоретическое и практическое значение работы
Получены доказательства в пользу важной роли нарушений в гормональных сигнальных
системах мозга в этиологии и патогенезе СД2. Показано, что они являются одними из причин
метаболических дисфункций, а их восстановление с помощью ИИ и ИС приводит к повышению
инсулиновой чувствительности и нормализации углеводного и липидного обмена. Изучение
нарушений в сигнальных системах мозга, регулируемых через различные типы ДАР (ДА1Р,
ДА2Р), МКР (МК4Р, МК3Р) и СР (С1Р, С4,6,7Р), позволило установить причинно-следственные
взаимосвязи между этими нарушениями и функциональными и гормональными дисфункциями,
возникающими в условиях диабетической патологии. Исследование функциональных
изменений в сигнальных системах гипоталамуса при обработке крыс с СД2 с помощью ИИ и
ИС позволило выявить некоторые молекулярные механизмы и мишени их действия, и связать
их с эффектами такой обработки на метаболические показатели. Установлен и доказан
терапевтический потенциал ИИ и ИС на нарушенные в условиях СД1 и СД2 метаболические
функции, что указывает на их эффективность для коррекции этих заболеваний. Установлено,
что ИИ и ИС улучшают некоторые когнитивные функции, сниженные при СД, что
свидетельствует о возможности их практического применения в клинике для лечения и
профилактики ассоциированного с СД когнитивного дефицита и диабетической энцефалопатии.
Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и
медицинских факультетов Санкт-Петербургского и Московского государственных
университетов, Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии и других вузов биологического, медицинского и фармацевтического профиля.
Апробация работы
Результаты исследования представлены на VIII Всероссийской конференции
«Нейроэндокринология-2010» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской конференции
«Алмазовские чтения-2011» (Санкт-Петербург, 2011), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011), XIV Международном совещании и VII Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), III Конференции Молодых ученых Института цитологии (Санкт-Петербург, 2012), Пятой международной конференции по когнитивной науке (Калининград, 2012), Всероссийской конференции «Братья Орбели и развитие современной науки» (Санкт-Петербург, 2012), XXII съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), IX Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2015» (Санкт-Петербург, 2015).
По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ, в том числе 10 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора
Все экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, получены лично автором или при его непосредственном участии. Автор проводил статистическую обработку полученных данных, осуществлял их анализ и обобщение, принимал участие в подготовке публикаций по материалам работы.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 176 страницах, включая 41 рисунок и 16 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 253 ссылки.
Благодарности. Работа выполнялась при финансовой поддержке Программы Российского Научного Фонда № 14-15-00413, Молодежного гранта РФФИ № 12-04-32034, Федеральной целевой программы министерства образования и науки РФ (соглашение № 8486), грантов Правительства Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых, молодых кандидатов наук в 2012 и 2015 годах.
Структурно-функциональная организация серотониновой сигнальной системы и распространенность серотониновых рецепторов в ЦНС
Традиционно первостепенное значение в развитии СД и МС отводится нарушениям в инсулиновой сигнальной системе. Не является исключением и инсулиновая сигнальная система мозга, которая вовлечена в регуляцию фундаментальных клеточных процессов в нейронах и через центральные механизмы контролирует метаболические и ростовые процессы на периферии, в том числе чувствительность периферических тканей к инсулину [12, 15, 16, 17]. Нарушения в этой системе, являющиеся причиной резистентности нейронов к инсулину, выявляются не только при СД 2-го типа, предиабетических состояниях и МС, но и играют важную роль в развитии нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера [18].
После обнаружения инсулина в мозге более 30 лет назад Хавранковой и соавторами [19] вопрос о его происхождении в ЦНС является одной из интригующих проблем нейрохимии. Здесь превалируют две точки зрения. В соответствии с первой, инсулин синтезируется на периферии -клетками, и уже затем поступает в мозг через высоко специализированную транспортную систему гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [15]. Так при повышении уровня периферического инсулина сначала наблюдается повышение его концентрации в мозге, а уже позднее в цереброспинальной жидкости. Инсулинтранспортная система в различных областях мозга существенно различается, что приводит к дифференциации проницаемости инсулина для различных популяций нейронов, вследствие чего гипоталамус, продолговатый мозг, варолиев мост имеют более высокую концентрацию инсулина, а в затылочная кора и таламус – сравнительно низкую [20]. Инсулинтранспортная система существенно меняется в условиях голодания, переедания, при ожирении и старении, у пациентов с СД 2-го типа и болезнью Альцгеймера [21, 22].
В соответствии со второй точкой зрения инсулин может синтезироваться в мозге, а его концентрация в периферическом кровотоке слабо сказывается на уровне гормона в ЦНС. Эти представления базируются на обнаружении мРНК для инсулина в гипоталамусе, гиппокампе и культурах нейронов [23]. С помощью ПЦР мРНК для инсулина была выявлена в ЦНС эмбрионов крыс и новорожденных животных, то есть еще до того, как поджелудочная железа начинает продуцировать инсулин. Поскольку мРНК для инсулина была идентифицирована в культуре нейронов из эмбрионального мозга кроликов [24], предполагается, что синтез инсулина в мозге происходит, в основном, на ранних стадиях онтогенеза, когда этот гормон необходим для регуляции нейрогенеза и нейродифференцировки.
Молекулярные механизмы, лежащие в основе продукции и секреции инсулина нейронами и -клетками, сходные и включают деполяризацию АТФ-чувствительных калиевых каналов [25]. Продуцирующие инсулин клетки являются электрически возбудимыми и отвечают деполяризацией и экзоцитозом на гормональные стимулы и повышение уровня глюкозы. Деполяризация синаптосом, полученных из мозга взрослых крыс, индуцирует секрецию инсулина, что указывает на накопление гормона в синаптических везикулах окончаний нейронов [26]. Обнаружено также, что синаптосомы, как и -клетки, секретируют инсулин в ответ на повышение уровня глюкозы [27].
Рецепторы инсулина (ИР) в мозге были открыты Хавранковой и соавторами в 1978 году [28]. В дальнейшем появились многочисленные 20 Рис. 1.1. Регулируемые инсулином сигнальные каскады. IRS1/2 – инсулинрецепторные субстраты 1-го и 2-го типов; p85 и р110 ФИ-3-К – p85 регуляторная и р110-каталитическая субъединицы фосфатидилинозитол-3-киназы; PI-3,4,5-P3 – фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат; GLUT4 – инсулин-зависимый глюкозный транспортер 4-го типа; PDK – фосфоинозитол-зависимая протеинкиназа; AKT – протеинкиназа B (AKT-киназа); PKC – протеинкиназа С; GSK3 – киназа-3 гликогенсинтетазы; FKHRL1 – транскрипционный фактор-1 семейства Forkhead; BAD – антагонист BCL2 в клеточной гибели; mTOR – серин/треониновая протеинкиназа; p70S6K – p70-рибосомальная S6-киназа; PDE3B – цАМФ-зависимая фосфодиэстераза 3B-подтипа; Shc – адапторный SH2/-коллагеноподобный белок; GRB2 – адапторный белок-2, связанный с рецепторами ростовых факторов; SOS – обменный белок (Son of Sevenless), вызывающий ГДФ/ГТФ обмен; Ras – малый ГТФ-связывающий белок ras-семейства; Raf – Ser/Thr-специфичная протеинкиназа; MEK1/2 – киназы митогенактивируемых протеинкиназ; ERK1/2 – митогенактивируемые протеинкиназы; p70S6K – p90-рибосомальная S6-киназа; CREB – цАМФ-зависимый транскрипционный фактор; c-Fos и c-Jun – транскрипционные факторы Fos- и Jun-семейств, соответственно; Elk-1 – транскрипционный фактор, содержащий ETS (E26 transformation-specific) домен; STAT1/3 – трансдукторы сигнала и активаторы транскрипции 1-го или 3-го типов; ESR – эстрогеновый рецептор. доказательства о присутствии ИР в ЦНС [5, 15]. Было установлено присутствие активных ИР в гипоталамусе, гиппокампе, мозжечке, таламусе, коре головного мозга, обонятельных луковицах, зубчатой извилине, моторной коре. По структуре и фармакологическим характеристикам нейрональные ИР (ИР-A) сходны с ИР на периферии (ИР-B). Однако между ИР-A и ИР-B имеется ряд различий. ИР-А по молекулярной массе уступает ИР-B, что связано с более легкой -субъединицей ИР-А. Уровень гликозилирования ИР-B выше, чем для ИР-A. Избыток инсулина в периферических тканях приводит к быстрому снижению числа функционально активных ИР-B вследствие их десенситизации и даун-регуляции, в то время как повышение уровня гормона в ЦНС существенно не влияет на ИР-А, что предотвращает быстрое развитие инсулиновой резистентности. Таким образом, несмотря на то, что ИР-А и ИР-B связываются с одним и тем же гормоном, их активация в ЦНС и на периферии обеспечивает различные пути регуляции активности как самих рецепторов, так и регулируемых ими сигнальных каскадов
Модель метаболического СД2, вызванного высокожировой диетой
Для оценки специфического связывания 125I-инсулина выделяли фракцию клеточных мембран мозга и фракцию плазматических мембран печени.
Гетерогенную фракцию клеточных мембран мозга получали из больших полушарий по модифицированному методу Хавранковой и соавторов [28]. Мозг гомогенизировали на льду в гидрокарбонатном буфере (10 мМ NaHCO3, pH 7.5) с ингибиторами протеаз. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 1500 об/мин. Осадок удаляли, супернатант разводили тем же буфером и центрифугировали 30 мин при 80000 x g (Beckman, UP-62). Осадок ресуспендировали в буфере, отбирали аликвоты и использовали для оценки связывания.
Фракцию плазматических мембран печени получали по модифицированному методу Невилла [227]. Печень гомогенизировали в гидрокарбонатном буфере (10 мМ NaHCO3, pH 7.5) с ингибиторами протеаз. Гомогенат фильтровали через 4 слоя марли, центрифугировали 20 мин при 3500 об/мин. Супернатант удаляли, осадок разводили буфером, затем добавляли к этой суспензии 69 %-ный раствор сахарозы, доводя плотность раствора до 1.408. Осадок наслаивали на 69 % раствор сахарозы, а поверх материала наслаивали 42.3 % раствор сахарозы (плотность 1.405) и центрифугировали в градиенте плотности сахарозы 90 мин при 100000 x g (Bеckman, UP-62). Слой над сахарозой собирали, отмывали от сахарозы при центрифугировании в буфере без сахарозы в течение 30 мин при 80000 g. Полученный осадок мембран ресуспендировали в буфере, отбирали аликвоты и использовали для оценки связывания.
Для определения специфического связывания 125I-инсулина с плазматическими мембранами тканей, инсулин метили хлораминовым методом с использованием изотопа Na125I («Изотоп», Россия) с последующей очисткой на колонке с целлюлозой. Радиоактивность определяли на -счетчике NZ322 (Венгрия). Активность полученного 125I-инсулина составляла 160-180 мкКи/мг.
Специфическое связывание 125I-инсулина определяли с помощью конкурентного вытеснения связанного с рецептором меченого гормона немеченым [228]. С этой целью 125I-инсулин инкубировали с мембранами в присутствии различных концентраций немеченого гормона (0.1-1000 нг/мл). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 10 мкг/мл немеченого лиганда. По окончании инкубации (16 ч, +4С) связанный с рецепторами меченый инсулин отделяли центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин) и считали радиоактивность осадка [229]. Для анализа кривых конкурентного вытеснения использовали преобразование данных в координаты Скэтчарда [230]. Применительно к гормон-рецепторным взаимодействиям зависимость Скэтчарда имеет вид: связанный гормон (B) /свободный гормон(F)= K([R0] – [HR]). Для рецепторов инсулина характерна вогнутость (двухфазность) графика Скэтчарда. Согласно принятой двухрецепторной модели расчет применялся отдельно для высокоаффинных и низкоаффинных рецепторов.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в программе «Microsoft Office Excel 2007» с помощью надстроек «AtteStat 12.5» и «Daniel s XL Toolbox 6.52». Данные представлены в виде M ± SD (как среднее ± стандартное отклонение) и M ± SEM (как среднее ± стандартная ошибка среднего). Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения двух зависимых/независимых выборок с нормальным распределением использовали парный/двухвыборочный t-критерий Стьюдента, для сравнения трех и более групп – дисперсионный анализ: вводили поправку Бонферрони. Данные, не удовлетворяющие критериям нормального распределения и не прошедшие тест на равенство дисперсий, обрабатывали с применением непараметрических методов: для сравнения двух независимых групп использовали U-критерий Манна-Уитни, для сравнения зависимых выборок – критерий Уилкоксона, для сравнения трех и более групп – тест Крускалла-Уоллиса с последующим попарным сравнением с применением критерия Данна. Статистически значимыми считались отличия при уровне значимости P 0.05
Функциональная активность аденилатциклазной системы в мозге крыс с острым сахарным диабетом 1-го типа
Далее исследовали функциональное состояние АЦСС в мозге крыс с оД1. Базальная активность АЦ и ее стимуляция GppNHp и форсколином в синаптосомальных мембранах, выделенных из стриатума, коры больших полушарий, гипоталамуса и гиппокампа крыс с острым, 30-ти суточным, СД1, снижались незначительно, что свидетельствует о сохранении каталитических функций АЦ и ее сопряжения с Gg-белками в тканях мозга в условиях острого СД1. О сохранении функций G-белков свидетельствует отсутствие изменений базального уровня ГТФ-связывания в мозге диабетических крыс в сравнении с этим показателем у контрольных животных (табл. 3.3). Таблица 3.3. Базальная и стимулированная GppNHp и форсколином активность АЦ (пмоль цАМФ/мин на мг белка) и базальный уровень ГТФ-связывания (пмоль [8-3H]-GppNHp/мг белка) в тканях мозга крыс с 30-тисуточным острым СД1 в сравнении с этими показателями у контрольных животных (M ± SD) Группа крыс Активность аденилатциклазы ГТФ-связывание
Примечание: # - в скобках приведены стимулирующие АЦ эффекты негормональных агентов, в процентах. Стимулирующие АЦ эффекты GppNHp и форсколина (оба - 10"5 М) в контроле приняты за 100%. - по сравнению с контролем, P 0.05.
В то же время, гормональные эффекты на активность АЦСС в условиях острого СД1 менялись в значительной степени. Хотя изменения были гормоно-и рецепторспецифичными, в целом в мозге диабетических животных отмечали ослабление передачи как стимулирующих, так и ингибирующих АЦ сигналов.
Стимулирующие АЦ эффекты серотонина, неселективного С1A/7Р-агониста 8-OH-DPAT, а также пептидных гормонов релаксина и PACAP-38 достоверно снижались при СД1 (группа оД1), причем АЦ эффекты релаксина и PACAP-38 ослаблялись в среднем в три раза (табл. 3.4). Также отмечали значительное снижение стимулирующих ГТФ-связывание эффектов серотонина, 8-OH-DPAT, релаксина и PACAP-38, причем, как и в случае АЦ эффектов, стимуляция ГТФ-связывания релаксином и PACAP-38 была ослаблена очень значительно, составляя 44 и 42 % от таковой в контроле (табл. 3.4).
В мозге диабетических крыс достоверно снижались ингибирующие АЦ эффекты всех исследованных гормонов – селективного С1BР-агониста 5-НОТ, ДА2Р-агониста бромокриптина и пептидного гормона соматостатина (табл. 3.5). Ингибирующие эффекты оценивали по влиянию гормонов на предварительно стимулированную форсколином активность фермента. В еще большей степени при СД1 снижалась стимуляция гормонами, ингибиторами АЦ, базального уровня ГТФ-связывания, что связано с нарушением ими активации Gi-белков. Так если ингибирующий АЦ эффект 5-НОТ в мозге диабетических крыс был снижен на 56 %, то стимуляция им ГТФ-связывания была ослаблена на 73 % (табл. 3.5). Таблица 3.4. Стимуляция гормонами активности АЦ и ГТФ-связывания в тканях диабетических и контрольных крыс (M ± SD) Гормон Повышение активности АЦ над уровнем базальной активности # Повышение ГТФ-связывания над базальным уровнем ##
Таким образом, передача гормональных сигналов через АЦСС в мозге крыс с 30-тисуточным СД1 была сильно нарушена, что отражает общее тяжелое функциональное состояние животных вследствие длительной сильно выраженной гипергликемии и абсолютного дефицита инсулина. Изменения в стимулирующих АЦ сигнальных каскадах характеризовались отчетливо выраженной гормональной и рецепторной специфичностью, в то время как регулируемые различными по природе гормонами ингибирующие АЦ каскады ослаблялись примерно в одинаковой степени. Так стимулирующие АЦ эффекты EMD-386088 и 8-OH-DPAT, которые активируют сопряженные с Gs-белками СР 6-го и 7-го типов, при СД1 снижались слабо, в то время как АЦ эффект серотонина, активирующего все известные типы Gs-сопряженных СР, снижался более чем в два раза. Эти результаты свидетельствует о том, что при тяжелых формах СД1 в мозге диабетических крыс ослабляются в основном функции сопряженных с Gs-белками СР 4-го типа, которые наряду с СР 6-го и 7-го типов являются мишенями действия серотонина. При этом стимулирующий АЦ эффект дофамина при СД1 почти не менялся, а незначительное снижение стимуляции дофамином ГТФ-связывания, вероятно, связано с ослаблением функции Gi-белков, которые также являются мишенями его действия. В пользу этого свидетельствуют наши данные о существенном ослаблении ингибирующего активность АЦ и стимулирующего ГТФ-связывание эффектов бромокриптина, агониста Gi-сопряженных ДА2Р.
Характеристика стрептозотоциновой модели пролонгированного мягкого сахарного диабета 1-го типа у самцов крыс и ее обработка интраназально вводимым инсулином
Самцов крыс Wistar в возрасте пяти месяцев обрабатывали СТЗ в дозе 40 мг/кг (группа мД1). Обработку СТЗ затем повторяли дважды – на 10-й день в дозе 35 мг/кг и на 80-й день в дозе 30 мг/кг. Массу тела, содержание глюкозы и инсулина в крови животных измеряли перед началом эксперимента, а также через 9 (перед второй обработкой), 19, 75 (перед третьей обработкой) суток после первой обработки и через 210 дней (в конце эксперимента) перед забоем. Для изучения влияния длительной терапии интраназально вводимым инсулином (ИИ) на метаболические и гормональные параметры у крыс с 210-тисуточной моделью мягкого СД1, использовали дозу гормона 0.48 МЕ/крысу, которую вводили ежедневно как диабетическим, так и контрольным крысам в течение 135 дней, начиная с 75-го дня после первой обработки животных СТЗ. Животные, которые не обрабатывались ИИ, вместо него в те же сроки и в тех же объемах получали растворитель инсулина – 0.1 М цитратный буфер (pH 4.5).
Таким образом были сформированы 4 группы крыс – контроль (К), контрольные животные, которых обрабатывали ИИ (КИ), группа крыс с мягким СД1 (мД1), диабетическая группа, которую лечили ИИ (мД1И) (табл. 3.6). Таблица 3.6. Масса тела, концентрация глюкозы и инсулина в крови крыс с пролонгированным мягким СД1 в сравнении с таковыми у контрольных животных того же возраста (М± SD) ND - концентрацию инсулина не определяли. Масса тела, г Глюкоза, мМ Инсулин, нг/мл
Механизмы действия интраназально вводимого инсулина в условиях диабетической патологии и его эффекты на гормональные системы мозга, метаболические показатели и когнитивные функции
С помощью ГТТ и оценки уровня инсулина и глюкозы было показано, что у самок крыс с неонатальной моделью СД2, с одной стороны, отмечается резистентность тканей к инсулину и, с другой, умеренный инсулиновый дефицит, что типично для изучаемой модели заболевания. Далее нами было предпринято исследование рецепторного компонента инсулиновой сигнальной системы – ИР, причем как в мозге для оценки чувствительности к инсулину ЦНС, так и в печени для оценки периферической инсулиновой чувствительности. Для этого измеряли специфическое связывание радиактивно меченого [125I]-инсулина с плазматическими мембранами, которые были выделены из тканей мозга и печени самок крыс с различными сроками неонатального СД2 – с ранними (110 суток) и поздними (190 суток) стадиями заболевания, и сравнивали эти показатели с таковыми у контрольных животных.
На основе анализа кривых конкурентного вытеснения [125I]-инсулина и анализа специфического связывания в координатах Скэтчарда (табл. 3.12) установлено, что в мозге диабетических крыс возраста 110 и 190 суток, что соответствует примерно одному и трем месяцам после манифестации СД2, уровень связывания, а следовательно и общее число ИР не меняются. Слабо менялось и соотношение высоко- и низкоаффинных форм ИР. В контроле это соотношение составило 0.093, у диабетических крыс возраста 110 и 190 суток – 0.078 и 0.073, соответственно [237].
На основе анализа кривых конкурентного вытеснения [125I]-инсулина и анализа специфического связывания в координатах Скэтчарда (рис. 3.4.3) установлено, что в печени крыс возраста 190 суток уровень специфического связывания [125I]-инсулина с фракциями плазматических мембран достоверно снижался на 27 % (табл. 3.13). Это снижение было обусловлено как уменьшением числа высокоафинных ИР (на 24 %), так и низкоаффинных ИР (на 23 %). Значения Kd для инсулинового связывания в печени, как и в мозге, менялись незначительно [236].
Параметры рецепторного связывания [125I]-инсулина с плазматическими мембранами, выделенными из печени крыс с неонатальной моделью СД2 в сравнении с контрольными животными Группа Уровеньсвязывания,%/0.5 мг Высокоаффинные рецепторы Низкоаффинные рецепторы Kd Ro Kd Ro Контроль (n = 8) 15.3 + 1.9 2.15 + 0.37 305 + 25 55.9 + 9.6 4470 + 325 нД2с, 190 суток (n = 8) 11.2+1.0 2.02 + 0.38 233+32 57.3 + 7.3 3425+410 Примечание. Kd константа диссоциации (нМ); Ro, число рецепторов (фмоль/0.5 мг мембранного белка). Данные представлены в виде М ± SEM различия между диабетическими и контрольными крысами статистически значимы при Р 0.05.
а – кривые конкурентного вытеснения [125I]-инсулина, который специфически связывается с плазматическими мембранами, выделенными из печени контрольных и диабетических крыс. Обозначения: К – контрольная группа, нД2с – крысы с неонатальным СД2, продолжительностью 190 суток. , - достоверные отличия параметров диабетических крыс от таковых у контрольных крыс, P 0.05, P 0.01, соответственно. б, в – анализ специфического связывания [125I]-инсулина в печени контрольных (б) и диабетических нД2с (в) крыс в координатах Скэтчарда. Обозначения: 1 – высокоаффинные ИР, 2 – низкоаффинные ИР. 120 Влияние обработки самок крыс с неонатальной моделью сахарного диабета 2-го типа интраназально вводимыми инсулином и серотонином на их пространственную память и способность к обучению Далее оценивали когнитивные функции здоровых и диабетических самок крыс с помощью тестирования пространственной памяти в ВТМ.
Показано, что контрольным крысам в первой серии экспериментов на обучение потребовалось три дня, а информация о местоположении цели сохранялась на момент начала второй серии экспериментов. Продолжительность и динамика изменений латентного периода у контрольных крыс с интраназальным введением инсулина (группа КИ) достоверно не отличалась от соответствующих показателей у контрольных животных, не получавших инсулин, на всем протяжении тестирования (рис. 3.4.4). Диабетические животные (группа нД2с) в первой серии экспериментов затрачивали на поиск платформы в среднем в два раза больше времени, чем контрольные крысы (рис. 3.4.4 и рис. 3.4.5). Необходимо отметить, что динамика снижения времени поиска у диабетических крыс была в 2–3 раза ниже в сравнении с таковой в контроле. Во второй серии и динамика снижения продолжительности латентного периода у диабетических крыс была в 3–4 раза ниже, чем у контрольных животных. Также в обеих сериях тестирования наблюдались значительные различия в траекториях плавания контрольной группы и группы нД2с, особенно в начале второй серии экспериментов (рис. 3.4.6). Эти данные указывают на развитие когнитивного дефицита у крыс с неонатальным СД2, что выражается в ухудшении показателей их пространственной памяти в сравнении со здоровыми животными [238]. нД2с - диабетические крысы без введения инсулина (самки); нД2Ис - диабетические крысы с введением ИИ (самки). Горизонталь - дни тестирования; вертикаль - сумма времени поиска платформы, сек. Первая серия: 1-5 сутки; вторая серия: 35-39 сутки. Данные представлены в виде MігSD. - различия между нД2с и нД2Ис достоверны при P 0.05.
Интраназальное введение инсулина диабетическим крысам (группа нД2Ис) в среднем в 2.5-3 раза сокращало латентный период в обеих сериях экспериментов (рис. 3.4.5). При этом максимальный эффект гормона (снижение продолжительности латентного периода в 5 раз) был выявлен как в первой, так и во второй сериях. Эти результаты свидетельствует о том, что ИИ улучшает показатели долговременной пространственной памяти у диабетических крыс, приближая их к таковым у здоровых животных
Таким образом, получены веские доказательства в пользу эффективности применения ИИ для коррекции и профилактики когнитивного дефицита, который развивается в условиях неонатального СД2.