Введение к работе
Актуальность проблемы. Фотофосфорилирование аденозиндифос-фата является одним из центральных звеньев процесса преобразования солнечной энергии фотосинтетическими мембранами и составляет основу энергетического баланса растительного организма. Основные этапы процесса преобразования энергии в хлоропластах исследовались рядом научных коллективов у нас в стране и за рубежом. В результате этих исследований достигнуты значительные успехи в понимании структурной и функциональной организации фотосинтетического аппарата и, в частности, в изучении молекулярной организации светособирающих и электронтранспоргных комплексов, закономерностей разделения зарядов, транспорта электронов и его сопряжения с переносом протонов, в выяснении природы темновых стадий фотосинтеза, связанных с ассимиляцией углекислоты. Существенный вклад в создание современных представлений о мембранном энергетическом сопряжении в энергопреобразующих системах различного происхождения внесли работы П.Митчелла, Р.Дж.П.Вильямса, В.П. Скулачева.
В хлоропластах, митохондриях и бактериях конечный этап трансформации энергии реализуется посредством сопряжения переноса протонов с синтезом АТФ, которое осуществляется специализированным полипептидным комплексом - Н"*"-АТФазой (АГФ-синтетазой) /Скулачев, 1974/. Непосредственно участвуя в образовании АТФ и контролируя (через рН внутритилакоидного пространства и электронный транспорт) образование другого богатого энергией соединения - восстановленного НАДФ,-АТФаэный комплекс хлоропластов занимает ключевое положение в системе энергообеспечения растительного организма. Способность комплекса к модуляции каталитической активности и к изменению сродства к субстратам и продуктам фотофосфорилирования определяет возможности адаптации энергетического аппарата растений к изменяющимся условиям внешней среды. Комплекс состоит из двух основных частей: водорастворимого сопрягающего фактора фотофосфорилирования СФт, осуществляющего ферментативный катализ и регуляцию реакции, и гидрофобного фактора СФ0, обеспечивающего перенос протонов к СФт. Несмотря на решающую роль СФг в проявлениях функциональной активности АТФаз-ного комплекса, молекулярные механизмы, определяющие его каталитическую активность и регуляторные свойства, изучены весьма слабо.
Характерной особенностью Н^АТФазных комплексов является их способность обратимо трансформировать разность электрохимических
потенциалов протонов через мембрану в энергию макроэргической фосфоангидридной связи АТФ /Митчелл, 1966; Скулачев, 1974/. Физико-химическая природа процессов трансформации энергии полипептидными комплексами неясна, и ее изучение составляет одну из фундаментальных задач биоэнергетики. Выяснение механизма основных стадий трансформации энергии Н^АТФазным комплексом хлоропластів может внести в решение этой задачи существенный вклад.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение молекулярного механизма функционирования Н+-АТФазного комплекса хлоропластов как биологической структуры, сочетающей ферментативные свойства со способностью к преобразованию разности электрохимических потенциалов протонов в энергию фосфоангидридной связи АТФ. Достижение указанной цели потребовало решения следующих основных задач:
изучения субъединичного состава и свойств изолированного и встроенного в липосомы Н+-АТФазного комплекса хлоропластов как наиболее простой структуры, способной осуществлять процессы гидролиза и синтеза АТФ сопряженно с трансмембранні*! переносом протонов;
выяснения аминокислотного состава, структуры и локализации каталитического центра сопрягающего фактора СФт;
исследования закономерностей регуляции АТФазной активности 0$j: выяснения роли нуклеогидов и других эффекторов, определения функций и характера взаимодействий нуклеотидсвязывагацих центров фермента;
анализа взаимосвязи АТФазной и АТФ-синтетазной активностей АТФазного комплекса;
выяснения роли OSj в переносе протонов и сопряжении этого процесса с отдельными стадиями синтеза и гидролиза АТФ.
Научная новизна. В диссертационной работе выдвинуты и экспериментально обоснованы новые представления о механизмах катализа, регуляции и трансформации энергии Н+-АТФазным комплексом хлоропластов, совокупность которых можно квалифицировать как новое направление в области биоэнергетики фотосинтеза.
Уточнен субъединичный состав и молекулярные массы субъеди-
ниц АТФазного комплекса хлоропластов, способного к [3 -АТФ
обмену и гидролизу АТФ, сопряженному с трансмембранным переносом протонов. Определены кинетические параметры [р^ІФу-АТФ обмена. Определены аминокислотные остатки, участвующие в каталитическом акте и входящие в состав нуклеотидсвязывающих центров фермента. Показано, что каталитические центры фермента локализованы на его f -субъединицах. Установлено, что нуклеотидсвязывающие центры 2
оС -субъединиц не принимают непосредственного участия в гидролизе АТФ. Предложен механизм катализа, согласно которому ускорение обратимой реакции гидролиза АТФ происходит в результате связывания отрицательных зарядов атомов кислорода фосфатных групп аминогруппами лизина и аргинина, а также ионами Mg +, что приводит к появлению парциального положительного заряда на атоме t- -фосфата, облегчающего нуклеофильную атаку гидроксилом воды.
Раскрыт механизм нуклеотидзависимой регуляции АТФазной активности сопрягающего фактора хлоропластов. Обнаружена специфичность регуляции к иону магния. Показано, что регуляция осуществляется путем медленного обратимого подавления Mg +-зависимой АТФазной активности СФ^ в результате связывания АДФ с одним из центров, диссоциации АТФ с другого центра при сохранении связи АТФ с третьим центром фермента. Обратный процесс - связывание АТФ и сопряженная диссоциация АДФ - приводит к реактивации СФт-АТФазы. Найдено, что роль активирующего лиганда, помимо АТФ, могут играть оксианионы. Предложенный механизм активации позволяет объяснить регуляторные эффекты бикарбоната, фосфата, флавонолов и других соединений анионной природы, локализованных в хлоропластах. Установлено, что нуклеотидзависимая регуляция осуществляется на уровне <-f> -субъединичных пар СФт. Выявлена роль кооперативных перестроек структуры в изменении каталитических свойств фермента.
Впервые применительно к сопрягающему фактору хлоропластов установлено, что он может находиться в двух альтернативных состояниях: АТФазном (гидролазном) и АТФ-синтетазном. Прочное связывание АДФ подавляет гидролазное и поддерживает синтетазное состояние СФр связывание АТФ подавляет синтетазное и стабилизирует гидролазное состояние фермента. На основании сопоставления полученных закономерностей с закономерностями регуляции митохон-дриальной АТФазы, раскрытыми Виноградовым с соавт. /1980, 1984/, сделан вывод об общности механизмов взаимопревращения АТФазного и АТФ-синтетазного состояний сопрягающих факторов различного происхождения.
Выявлена зависимость соотношения АТФ и АДФ, прочно связанных с OJj, от рН среды. Характер зависимости свидетельствует о существовании специфических кислотно-основных групп фермента, протонирование которых сдвигает равновесие реакции в сторону АТФ. Сделан вывод, что энергозависимоЯ стадией фотофосфорилирования наряду с диссоциацией АТФ является синтез АТФ на каталитическом центре из АДФ и фосфата. Предложен молекулярный механизм сопряжения переноса протонов через СФт с образованием фосфоангидрид-
ной связи АТФ, включающий циклические изменения относительного сродства ОШу к субстратам и продуктам реакции в результате про-тонирования и диссоциации специфических кислотно-основных групп, попеременно контактирующих с протонным каналом АТФазного комплекса и реакционной средой.
Научное и практическое значение работы. Сформулированные в работе представления о механизме функционирования Н^-АТФазы хло-ропластов важны для понимания основных принципов работы энерго-трансформирующих ферментов. Концепция взаимосвязи процессов про-тонирования-депротонирования с энергетическими уровнями интерме-диатов каталитического процесса может быть использована для выяснения механизмов функционирования ІГ^-АТФаз различного биологического происхождения.
Описание аминокислотной структуры активного участка СФт-АТФазы представляет интерес для изучения каталитических свойств других аденозинтрифосфатаэ, а также для конструирования ферментов методами генной инженерии. Раскрытые в работе закономерности регуляции активности C$j-AT$a3bi являются теоретической основой для понимания механизмов влияния эндогенных регуляторов на процессы запасания энергии в хлоропластах. Они могут быть применены для целенаправленного поиска средств регулирования активности фотосинтетического аппарата растений. Выявленные в результате проведенного исследования свойства АТФазного комплекса хлоропла-стов и кинетические закономерности его функционирования в настоящее время используются в работе по созданию искусственных фото-синтезирующих систем регенерации АТФ. Они могут быть также положены в основу математических моделей энергообеспечения растительного организма.
Разработанные в ходе проведенного исследования новые методические приемы могут найти применение в энзиматических исследованиях. В частности, метод расчета концентрации АДФ в нестационарном режиме может быть использован при определении кинетических параметров АТФаз, спектрометрический метод титрования тиро-зиновых остатков - для изучения конформационных изменений белков, метод неспецифичного ковалентного связывания радиоактивной метки - для локализации модифицированных аминокислотных остатков.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на Ш и У Всесоюзных биохимических съездах /Рига, 1974; Киев, 1986/, I Всесоюзном биохимическом съезде /Москва, 1982/, ІУ, У и IX Всесоюзных семинарах по фотосинтезу /Пущино, І97Е, 1973 и 1976/, Всесоюзной школе по биомембранам /Звенигород, 1981/, IX Всесоюзном симпозиуме "Митохондрии. Механизмы сопряже-4
ния и регуляции" /Пущино, 1981/, Всесоюзной конференции "Проблемы фотоэнергетики" /Львов, 1984/, Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" /Пущино, 1986/, на заседании Всесоюзного биохимического общества /Москва, 1985/, семинарах Межфакультетской проблемной НИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н.Белозерского, а также на У и УІ Объединенных симпозиумах биохимических обществ СССР-ГДР /Веймар, 1979; Таллин, 1981/, ХУЛ симпозиуме "Структура и функции фотосинтетического аппарата" /Рейнхардсбрунн, 1979/, Ш Советско-шведском симпозиуме "Физико-химическая биология" /Тбилиси, 1981, Ш Международной школе по структуре и функциям биомембран /Варна, 1984/, 16-й и 18-й Конференциях ФЕБО /Москва, 1985; Любляна, 1987/, УП Международном конгрессе по фотосинтезу /Провиденс, 1986/.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 41 работа в отечественных и международных изданиях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 316 страницах машинописного текста и содержит 81 рисунок, 21 таблицу. Список литературы включает более 500 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.