Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 15–39
1.1 Иммуноглобулины и феномен злокачественного роста 15–20
1.2 Липофорин как модельная молекула 20–23
1.3 Гибридомная технология и моноклональные антитела 23–26
1.4 Мноклональные антитела и другие молекулярные технологии в биосистематике 26– 1.4.1 Моноклональные антитела к антигенам насекомых 27–30
1.4.2 Половые феромоны и аттрактанты 30–35
1.4.3 Сравнительный анализ структуры нуклеиновых кислот и ген цитохромоксидазы 35–39
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 40–51
2.1 Выделение белков из биологического материала и их очистка 40–42
2.2 Получение моноклональных антител к липофорину 42
2.2.1 Создание гибридом (гибридомная технология) 42–44
2.2.2 Тестирование гибридомных клонов и определение специфичности моноклональных антител 44– 2.3 Исследование взаимодействия иммуноглобулинов человека и липофорина с помощью моноклональных антител 46–47
2.4 Изучение биологической активности половых феромонов и синтетических хемоаттрактантов 47–48
2.5 Определение первичной структуры гена цитохромоксидазы (COI) 48–49
2.6 Дополнительные методы: биологические, морфологические, кариологические 49–50
2.7 Статистические методы и алгоритмы филогенетического анализа 50–51
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований и обсуждение 52–79
3.1 Характеристика и чистота выделенных IgG и липофорина 52–54
3.2 Особенности клонирования гибридом, характеристика полученных штаммов и моноклональных антител 55–58
3.3 Изучение взаимодействия иммуноглобулинов человека и липофорина 59–65
3.4 Моноклональные антитела к липофорину и биосистематика Procridinae 65–69
3.5 Активность половых феромонов и синтетических хемоаттрактантов 70–74
3.6 Филогенетический сигнал в гене цитохромоксидазы (COI) 74–76
3.7 Сравнение данных биохимических методов с результатами морфологических и цитогенетических исследований 76–79
Заключение 80–83
Список сокращений и условных обозначений 84
Список литературы
- Липофорин как модельная молекула
- Получение моноклональных антител к липофорину
- Изучение биологической активности половых феромонов и синтетических хемоаттрактантов
- Особенности клонирования гибридом, характеристика полученных штаммов и моноклональных антител
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение нарушений иммунитета человека, возникающих при злокачественных новообразованиях, является одной из приоритетных задач современной биохимии, иммунологии и медицины. Работы последних лет, в основном, сфокусированы на генетических аспектах неоплазий, а также на роли хронического воспаления и клеточного иммунитета в процессах злокачественной трансформации (Абелев, Эрайзер, 2008; Давыдов, Ганцев, 2010; 2005; Kim et al., 2005, 2006; Liao et al., 2009; Marigo et al., 2010; Filipazzi et al., 2012; Sevko & Umansky, 2013; Kamiska et al., 2015; Zi et al., 2015). Изменениям гуморального иммунитета при злокачественных новообразованиях уделяется недостаточно внимания. Исследования в этой области касаются лишь диагностической ценности обнаружения специфических антител к опухоль-ассоциированным антигенам (Reuschenbach et al., 2009; Zhu et al., 2013; Zhang et al., 2014; Xu et al., 2015). В то же время, имеются факты, свидетельствующие о важной роли гуморального иммунитета в развитии феномена «избегания» иммунологического надзора и метастазировании опухолей (Zitvogel et al., 2006; Ma et al., 2013; et al., 2014). Отдельными авторами обсуждаются механизмы иммуноглобулин-зависимой стимуляции злокачественного роста и вторичных нарушений гуморального иммунитета при химиотерапии (Бобровник и др., 1998; Глушков, 1999; Зайчик, Чурилов, 2005; Шумилина и др., 2011; Kim et al., 2006; Bruzzo et al., 2011; Hannani et al., 2014).
Иммуноглобулины (антитела) – адаптерные молекулы, запускающие иммунные реакции организма после распознавания чужеродных агентов и опухолевых антигенов, – центральное звено гуморального иммунного ответа. При злокачественных новообразованиях могут происходить изменения уровня продукции антител (например, при парапротеинемических гемобластозах), нарушаться соотношение их классов и подклассов (Воробьев, 1985; Андреева, Чернохвостова, 1985; Белевцев и др., 2003; Чиисов, Давыдов, 2013; Sadat et al., 2008). При некоторых неоплазиях в крови обнаруживаются «необычные» иммуноглобулины: холодовые агглютинины, абзимы, аутоантитела против внутриклеточных антигенов (Пiнчук, 1998; Генералов, 2000; Кіт, 2008; Kozyr et al., 1998; Kim et al., 2006; & Gabibov, 2009; Zhang et al., 2014). Обнаружены также отличия в функционировании антител (например, при связывании комплемента) при некоторых опухолях (Ефетов, 1993; Ефетов, Князева, 1994; Князева, Камилов, 2007; Князева, 2009).
Для улучшения диагностики, контроля эффективности лечения
и разработки методов профилактики нарушений гуморального иммунитета при злокачественных новообразованиях актуальным представляется поиск новых методических подходов к анализу изменчивости иммуноглобулинов.
Одной из причин нарушений функционирования иммуноглобулинов при патологии является появление у этих молекул «конформационной жесткости» в результате их взаимодействия с низкомолекулярными амфифильными продуктами деструкции тканей (опухолевых клеток) (Ефетов, 1985, 1991, 1993,
2000; Ефетов, Троицкий, 1991; Ефетов и др., 1988). Оказалось возможным моделировать и изучать такую патологическую модификацию антител, используя амфифильные молекулы, полученные у филогенетически далеких от человека биологических видов, и моноклональные антитела, специфичные к таким модельным молекулам-зондам (Ефетов, 1993, 1999; Ефетов, Ширяев, 2001).
Моноклональные антитела (МКА) к иммуноглобулинам и модельным молекулам, а также сами эти молекулы, в комплексе создают панель инструментов для изучения патологической модификации иммуноглобулинов человека. Перспективным в этом отношении представляется амфифильный липогликохромо-протеин липофорин - главный белковый компонент гемолимфы чешуекрылых (Van der Horst & Rodenburg, 2010; Van der Horst & Ryan, 2012). Антигенные детерминанты белковой части липофорина позволяют получать специфичные к нему МКА, а филогенетическая удаленность чешуекрылых от человека исключает перекрестные реакции таких антител с иммуноглобулинами.
Получение МКА к липофорину актуально и для решения задач эволюционной биологии, филогенетики и биосистематики (Ефетов, Ширяев, 1996, 1998; Efetov, 2001, 2004). На модели изучения отдельной группы живых организмов можно оценить возможности применения в систематике МКА и других молекулярных технологий, например, анализа хемоаттрактантов, структуры митохондриального гена цитохромоксидазы I (COI) в комплексе с традиционными подходами. В качестве модельной группы выбрано семейство Zygaenidae (Insecta, Lepidoptera).
Цель работы: получение и использование моноклональных антител к липофорину (как к модельной молекуле) для исследования иммуноглобулинов человека при злокачественных новообразованиях и другой патологии, а также для изучения филогенетических взаимоотношений видов семейства Zygaenidae (Insecta, Lepidoptera) и решения проблем биосистематики.
Для осуществления цели поставлены следующие задачи:
получить гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к липофорину из гемолимфы имаго Adscita geryon (Hbner, 1813) (Lepidoptera, Zygaenidae, Procridinae);
с помощью липофорина, а также моноклональных антител к липофорину и иммуноглобулинам разработать варианты иммуноферментного анализа для исследования иммуноглобулинов человека при патологии (в том числе при злокачественных новообразованиях различной локализации); изучить филогенетические взаимоотношения видов подсемейства Procridinae (Lepidoptera, Zygaenidae) с помощью моноклональных антител к липофорину и других молекулярных технологий (анализа первичной структуры митохондриального гена COI, строения и биологической активности половых феромонов и синтетических хемоаттрактантов);
сопоставить и проанализировать биохимические данные и результаты, полученные с помощью традиционных подходов (морфологических, цитогенетических), оценить значимость иммунологических и других молекулярных методов для решения проблем биосистематики Zygaenidae.
Объект исследования. Иммуноглобулины выделяли из сыворотки крови жителей Крыма – здоровых людей и больных, проходивших лечение в крымских медицинских учреждениях в 2000–2014 годах. Биологический материал от представителей различных видов семейства Zygaenidae, обитающих в Крыму, получен в результате собственных сборов. Материал от видов, обитающих в других регионах, собран во время научных экспедиций в 1996–2012 годах научным руководителем или предоставлен зарубежными учеными.
Комплекс использованных методов включал в себя биохимические (высаливание, диализ, электрофорез, ионообменная хроматография, синтез хемоаттрактантов), иммунологические и молекулярно-генетичские (гибридомная технология, иммуноферментный анализ, амплификация и секвенирование митохондриальной ДНК), биологические, а также методы вариационной статистики и программный филогенетический анализ с применением двухпараметрической модели Кимуры и метода «ближайшего соседа»).
В работе использованы официальные материалы Всемирной Организации Здравоохранения () и Международного Агентства Исследований Рака (). Эволюционно-биологические проблемы обсуждаются на основе анализа результатов собственных молекулярных исследований и данных из международных открытых баз: BOLD: The Barcode of Life Data System (), GenBank (), ).
Связь работы с научными программами и темами. Диссертационная
работа выполнялась в рамках научных исследований, проводимых на кафедре
биохимии ФГАОУ ВО
«Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» по теме
«Использование молекулярных методов для решения эволюционно-
биологических проблем и изучения иммуноглобулинов человека» (№ гос. регистрации МОЗ Украины 0113U002992). Часть исследований проведена в рамках международных научных проектов «Synthesis and study of pheromone molecules» и «Study of DNA molecules of different biological species with the purpose to reconstruct phylogeny and create a proper biological system» совместно с Tiroler Landesmuseen, Ferdinandeum (Австрия), а также совместного с Biodiversity Institute of Ontario, University of Guelph (Канада) проекта «ZYGMO» по амплификации ДНК и секвенированию гена СОI Zygaenidae.
Научная новизна исследования. С помощью гибридомной технологии впервые созданы четыре штамма гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к липофорину из гемолимфы имаго A. geryon (Zygaenidae, Procridinae), предложен новый способ клонирования гибридом. Разработаны схемы использования липофорина и полученных к нему моноклональных антител для изучения иммуноглобулинов человека. В результате применения комплекса моноклональных антител к липофорину и иммуноглобулинам впервые установлено наличие различной степени неантигенного взаимодействия липофорина с иммуноглобулинами из сыворотки крови здоровых людей и больных со злокачественными новообразованиями.
Моноклональные антитела впервые применены для сравнительного
анализа антигенной структуры липофорина у представителей подсемейства
Procridinae семейства Zygaenidae. В комплексе с традиционными подходами для
изучения взаимоотношений видов семейства Zygaenidae и решения вопросов
биосистематики использованы молекулярные методы – иммуноферментный
анализ с использованием моноклональных антител, секвенирование
митохондриального гена СОI, анализ строения и активности половых феромонов и синтетических аттрактантов. Получены ранее не известные данные о хемокоммуникации, морфологии и цитогенетике видов Zygaenidae. Описан один новый для науки биологический вид. Синтезирован новый половой аттрактант вредителя винограда – Theresimima ampellophaga (Bayle-Barelle, 1808) (Zygaenidae, Procridinae).
Теоретическая и практическая значимость исследования. Расширены
представления об изменчивости иммуноглобулинов при патологии и возможностях
неантигенного (неспецифического) взаимодействия иммуноглобулинов
с природными липопротеинами. Полученные моноклональные антитела к липофорину могут быть применены для дальнейшего изучения взаимодействия этой амфифильной молекулы с иммуноглобулинами человека при злокачественных новообразованиях различной локализации. Материалы диссертации могут послужить основой для разработки новых тест-систем для обнаружения модифицированных при патологии иммуноглобулинов.
Получены новые фундаментальные знания в области морфологии, цитогенетики, хемокоммуникации, филогенетики и эволюционной биологии видов семейства Zygaenidae, усовершенствованы методы видовой идентификации, а также предложены пути решения проблем филогенетики и биосистематики данной группы. Синтезированный в ходе работы хемоаттрактант может быть использован для мониторинга Th. ampellophaga и разработки биологических методов борьбы с данным вредителем винограда.
Основные положения (научные выводы), выносимые на защиту.
-
Получены четыре штамма гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к липофорину из гемолимфы имаго Adscita geryon (Hbner, 1813) (Lepidoptera, Zygaenidae, Procridinae).
-
Разработаны схемы использования липофорина (как модельной молекулы) и полученных к нему моноклональных антител для изучения иммуноглобулинов человека. Установлено, что иммуноглобулины человека (IgG) в норме и при патологии способны связываться с липофорином из гемолимфы имаго представителей семейства Zygaenidae (Insecta, Lepidoptera). Способность взаимодействовать с липофорином отличается у IgG из сыворотки крови здоровых людей и больных со злокачественными новообразованиями.
-
Исследованы филогенетические взаимоотношения между представителями семейства Zygaenidae с помощью полученных моноклональных антител к липофорину. В комплексе с другими молекулярными методами и традиционными подходами подтверждена существующая на сегодняшний момент филогенетическая гипотеза о тесных взаимоотношениях между родами Zygaenoprocris,
Adscita и Jordanita и их филогенетической удаленности от группы родов Theresimima и Rhagades (Zygaenidae, Procridinae).
Выводы диссертационного исследования базируются на фактических результатах многочисленных наблюдений, а также статистическом анализе собственных экспериментальных данных и являются достоверными.
Апробация результатов исследования. Основные материалы работы были представлены на 2-м съезде онкологов стран СНГ (Киев, 2000), 10-м съезде онкологов Украины (Крым, 2001), IX и Х Украинских биохимических съездах (Харьков, 2006; Одесса, 2010); XIII, XIV, XVII и XVIII European Congress of Lepidopterology (Korsor, 2002; Rome, 2005; Luxembourg, 2011; Blagoevgrad, 2013), а также на VIII, IX XII, XIII International Symposium on Zygaenidae (Dresden, 2003; Simferopol, 2004; Hatay, 2010; Innsbruck, 2012).
Отдельные результаты диссертации внедрены и используются в работе филиала «Алушта» ФГУП ПАО «Массандра» Управления делами Президента Российской Федерации (Республика Крым). Получен патент РФ на полезную модель «Способ клонирования гибридом» (№ 151761).
Диссертация обсуждена на заседании кафедры биохимии Медицинской академии имени С. И. Георгиевского и рекомендована к защите 30.06.2015 г.
Публикации. По теме исследования автором опубликованы 9 статей в рецензируемых журналах (в т. ч. 4 статьи в журналах, цитируемых в SCOPUS, и 1 – в Web of Science), а также 14 тезисов в материалах съездов, конгрессов и симпозиумов (8 – международных и 4 – стран СНГ), получен 1 патент.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, трех глав (18 разделов), Заключения, Списка условных обозначений и сокращений, Списка использованной литературы и двух приложений. Общий объем диссертации составляет 132 страницы. Список литературы включает 352 источника, из них 226 – зарубежных авторов. Иллюстрационный материал представлен 17 рисунками и семью таблицами.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю, профессору К. А. Ефетову за помощь на всех этапах исследования и многолетнее сотрудничество, а также считает своим долгом поблагодарить доцента М. Ю. Баевского и И. А. Поддубова (Россия), профессора М. А. Субчева и доктора Т. Б. Тошову (Болгария) за помощь при работе с хемоаттрактантами, профессора Г. М. Тармана (Австрия) за всестороннюю поддержку исследований, доктора В. Дж. Тремевана (Великобритания) за содействие при публикации результатов работы, доктора Ч. Кошио (Япония), Б. Молле и Э. Друэ (Франция) и всех зарубежных коллег – участников проекта «ZYGMO» (BOLD) – за помощь в сборе биологического материала.
Липофорин как модельная молекула
Иммуноглобулины (антитела) – адаптерные молекулы, запускающие иммунные реакции организма после распознавания чужеродных агентов и опухолевых антигенов, – являются центральным звеном гуморального иммунного ответа. В норме функционирование иммуноглобулинов сопряжено с разнообразными конформационными переходами [7, 83, 96, 117, 142, 238] и взаимодействием с другими участниками иммунного ответа (белками системы комплемента и клеточными рецепторами) [9, 83, 94]. Важно отметить, что антитела способны взаимодействовать и с различными веществами неантигенной природы [9, 41, 103, 104, 115, 117, 164, 165], что, по всей видимости, расширяет спектр их биологических функций.
При злокачественных новообразованиях могут происходить различные нарушения гуморального иммунитета (продукции и функционирования антител) – как количественные, так и качественные. Так, при парапротеинемических гемобластозах синтезируемые и секретируемые опухолевыми клетками моноклональные иммуноглобулины (парапротеины) в большом количестве могут появляться в биологических жидкостях и тканях больных [4, 31, 82, 98, 111]. При некоторых опухолях отмечаются нарушения соотношения различных классов и подклассов иммуноглобулинов [60, 123, 300]. Установлены факты появления в крови больных с неоплазиями «необычных» антител: холодовых агглютининов [116], каталитически активных абзимов [15, 114, 243], аутоантител против внутриклеточных антигенов [142, 240, 272]. Обнаружены также отличия в функционировании антител, например, связывании комплемента при некоторых злокачественных новообразованиях [39, 40, 64, 65].
Большим количеством работ показано, что клетки некоторых злокачественных нелимфоидных опухолей могут экспрессировать гены иммуноглобулинов и синтезировать молекулы антител или их фрагменты («атипичные» иммуноглобулины) [151, 228–231]. Как правило, такие антитела способствуют прогрессии опухоли и метастазированию [229–232]. Механизмы запуска и первичная биологическая роль подобной экспрессии, к сожалению, остаются невыясненными, однако, стоит отметить, что для изучения данного феномена (наряду с иными методами) весьма полезными являются поликлональные и моноклональные антитела [245, 340].
Одной из причин нарушений функционирования иммуноглобулинов при патологии является появление у этих молекул «конформационной жесткости» в результате их взаимодействия с низкомолекулярными амфифильными продуктами деструкции тканей (опухолевых клеток) [35, 37, 40, 42, 52–55]. Оказалось возможным моделировать и изучать такую патологическую модификацию антител, используя амфифильные молекулы, полученные от филогенетически далеких от человека биологических видов (например, насекомых), а также моноклональные антитела, специфичные к таким молекулам [36, 40, 42].
В работах К. А. Ефетова с помощью метода температурно-пертурбационной дифференциальной спектрофотометрии (ТПДС) показано, что мочевина в концентрации 12 % вызывает в IgG здоровых людей обратимый (неденатурационный) конформационный переход [35, 37, 40, 41, 52–55]. Переход локализован преимущественно в Fab-фрагментах, проявляется изменениями в температурно-пертурбационных дифференциальных спектрах (значительным уменьшением максимумов при длинах волн 288 нм и 295 нм) и может быть связан с частичной дегидратацией отдельных областей молекулы IgG (переходом хромофорных аминокислот в более гидрофобное микроокружение) [35, 40, 41]. Методом ТПДС были изучены IgG, выделенные из сыворотки крови больных с хроническим лимфолейкозом, злокачественными опухолями желудка, новообразованиями других локализаций, а также с иной патологией, сопровождающейся деструкцией клеток и тканей в организме. Иммуноглобулины при изученной патологии показали высокую устойчивость к действию мочевины: во всех случаях в модифицированных IgG конформационный переход под действием 12 % мочевины был значительно менее выражен [40, 54]. «Жесткость» конформации IgG удалось смоделировать при взаимодействии IgG здоровых людей с амфифильными лигандами лецитином и мелиттином, при этом антигенсвязывающая активность антител снижалась [40]. Кроме того, в IgG-фракции при злокачественных опухолях желудка обнаружено повышенное содержание липидов [40].
Многие заболевания, в т. ч. злокачественные новообразования, сопровождаются разрушением тканей. Исследования К. А. Ефетова позволили предположить, что причиной модификации IgG при патологии является взаимодействие IgG с метаболитами, возникающими при деструктивных процессах в организме, что, в свою очередь, приводит к нарушению функции иммуноглобулинов и может быть причиной ослабления гуморального иммунитета при изучаемой патологии [35, 37, 40, 41, 52–55].
При моделировании патологической модификации антител эффективным оказалось использование амфифильных молекул, полученных от филогенетически далеких от человека биологических видов, а также моноклональных антител, специфичных к таким молекулам-зондам [36, 40, 42]. Моноклональные антитела (МКА) к подобным лигандам, с одной стороны, позволяют анализировать топографию и количественные аспекты их взаимодействия с иммуноглобулинами, а с другой – исключают возможность перекрестных реакций с антигенами человека [36, 40, 42]. Используемые в подобных исследованиях модельные молекулы должны обладать ярко выраженными амфифильными свойствами, быть иммуногенами, что позволит получить к ним специфические МКА, и принадлежать эволюционно далекому биологическому виду. Практически всеми этими качествами обладают белки и пептиды насекомых. Так, применение для исследований иммуноглобулинов человека амфифильного пептида мелиттина (из яда пчелы), а также полученных к нему МКА, позволило смоделировать конформационную устойчивость IgG, характерную для модификации этих белков при патологии, изучить топографию взаимодействия IgG и мелиттина и оценить изменения антиген- и комплементсвязывающих функций модифицированных антител [36, 39, 40, 43].
Суммируя вышеизложенное, можно утверждать, что изучение механизмов злокачественной иммуносупрессии важно с точки зрения разработки методов ее коррекции (блокирования иммунитет-ингибирующих путей и повышения мощности и специфичности противоопухолевого иммунитета), а также улучшения иммунодиагностики и профилактики онкопатологии. Актуальным направлением этих исследований, безусловно, является поиск новых подходов к анализу патологической модификации иммуноглобулинов, в том числе с использованием модельных молекул и моноклональных антител к ним.
Получение моноклональных антител к липофорину
Взаимодействие IgG с липофорином оценивали методом ИФА, который проводили в двух вариантах.
ИФА (вариант А). На первом этапе 96-луночные планшеты сенсибилизировали очищенным липофорином имаго A. geryon (использовали концентрации от 10 до 100 мкг/мл в БКБ. В контрольные лунки вносили БКБ. После инкубации осуществляли блокировку свободных валентностей с помощью 1 % БСА в ЗФР. На следующей стадии в лунки планшета вносили исследуемые очищенные IgG человека (использовали концентрации от 10 до 200 мкг/мл) в ЗФР. После инкубации и отмывки в планшет вносили МКА к IgG человека, условно обозначенные как 2F11 и 2H11, которые были получены ранее К. А. Ефетовым [40, 89, 91], в разведении 1:200 в ЗФР. На последнем этапе вносили ShAM в разведении 1:500 в ЗФP. Инкубацию на всех стадиях производили в течение часа при + 37 С. После каждого этапа содержимое планшетов удаляли, а после инкубации с БСА, IgG человека, мышиными МКА и ShAM планшеты отмывали с помощью ЗФРТ. В качестве субстрата использовали смесь 50 мкл ABTS, 2 мкл 30 % раствора перекиси водорода и 10 мл 0,05 М цитрат-NaOH буферного раствора, pH=4,0. Измерение оптической плотности содержимого лунок планшета производили через 30 и 60 минут при помощи вертикального спектрофотометра Multiscan при длине волны 405 нм.
ИФА (вариант Б). На первом этапе в лунки планшета вносили очищенные IgG человека в концентрации от 10 до 200 мкг/мл. В контрольные лунки вносили БКБ. После инкубации осуществляли блокировку свободных валентностей с помощью 1 % БСА в ЗФР. Затем вносили липофорин имаго A. geryon (или других представителей Zygaenidae) в концентрации от 10 до 400 мкг/мл в ЗФР. На следующем этапе в лунки планшета вносили культуральные или асцитические жидкости, содержащие полученные нами МКА к липофорину [87], условно обозначенные как P1A8-3, P1F2, P1D4 и P2E6 в рабочих разведениях (1:500–1:2000) в ЗФР. После инкубации и отмывки добавляли ShAM в разведении 1:500 в ЗФP. Инкубацию на всех стадиях производили в течение часа при + 37 С. После каждого этапа содержимое планшетов удаляли, а после инкубации с БСА, липофорином, МКА и ShAM планшеты отмывали с помощью ЗФРТ. В качестве субстрата использовали смесь 50 мкл ABTS, 2 мкл 30 % раствора перекиси водорода и 10 мл 0,05 М цитрат-NaOH буферного раствора, pH=4,0. Измерение оптической плотности содержимого лунок планшета производили через 30 и 60 минут при помощи вертикального спектрофотометра Multiscan при длине волны 405 нм.
В качестве дополнительного контроля параллельно с основными экспериментами с помощью ИФА проводили тестирование активности используемых МКА против соответствующих антигенов: 2F11 и 2H11 против IgG человека и полученных нами МКА P1A8-3, P1F2, P1D4 и P2E6 против липофорина A. geryon.
Биологическую активность синтетических половых феромонов и аттрактантов, синтезированных нами и предоставленных профессором M. А. Субчевым (Болгария), оценивали в полевых условиях с помощью пластиковых адгезивных дельта-ловушек со сменными липкими пластинами площадью 200 см2, покрытыми слоем Tanglefoot (США), не имеющим запаха и не содержащим инсектициды и пестициды. Диспенсерами служили резиновые диски диаметром 12 мм, на которые наносили аттрактанты (рацематы или изомеры в различных соотношениях) в чистом виде или в смеси с гексаном (1:1). Нами использовался гексан (Panreac, Испания).
Ловушки устанавливали в биотопах на высоте 1,0–1,5 м и расстоянии не менее 10 м друг от друга до начала времени лёта и регулярно проверялись. Во всех биотопах устанавливались контрольные ловушки (без аттрактантов). Определение привлеченных Procridinae осуществлялось К. А. Ефетовым по строению гениталий и другим морфологическим признакам. Синтез собственного аттрактанта (втор-бутилдодецен-2-оата) производили по следующей схеме [101, 102]: 1) бромирование додекановой (лауриновой) кислоты (получение 2-бромдодекановой кислоты в присутствии порошковой серы; 2) получение втор-бутил-2-бромдодеканоата из 2-бромдодекановой кислоты и бутанола-2 (Sigma-Aldrich, Германия) в присутствии фосфорной кислоты и бензола; 3) образование двойной связи во втор-бутил-2-бромдодеканоате в присутствии хинолина. Содержание целевых продуктов определяли методом газо-жидкостной хроматографии, химическую природу полученного вещества подтверждали методом 1Н ядерной магнитно-резонансной спектроскопии [101, 102].
Для экспериментов по естественной межвидовой аттракции в лабораторных условиях выводили девственных самок. Самки не питались и 1–2 дня содержались при + 4 С. Перед проведением эксперимента самку выдерживали при комнатной температуре, пока она не принимала «зовущую» позицию. Затем на расстоянии 2–3 м выпускали самцов. Результат считали положительным при проявлении самцом полового поведения – частых движениях антенн, дрожании крыльев, направленном перемещении и кружении около самки, открытии вальв и попытках спариться.
Материал для изучения ДНК от представителей различных видов Zygaenidae, обитающих на территории Крыма, получен в результате собственных сборов. Материал от видов, обитающих в других регионах, собран во время научных экспедиций в 1996–2012 годах профессором К. А. Ефетовым или предоставлен зарубежными учеными (см. Введение, Раздел Благодарности). Стерильными инструментами отделяли часть тела (как правило, одну из ног или голову с усиками) исследуемого насекомого (сухого или хранившегося в 96 % этаноле), и помещали в отдельную микропробирку. Выделение ДНК из образцов, ПЦР-амплификацию и секвенирования ДНК проводили в соответствии со стандартными протоколами [128, 149] в канадском Центре ДНК-штрихкодирования (The Canadian Centre for DNA Barcoding, Biodiversity Institute of Ontario, University of Guelph, Гуэлф, Канада), где все полученные экстракты ДНК хранятся в настоящее время. Сведения об использованных для амплификации ДНК-праймерах представлены в Таблице 2.
Изучение биологической активности половых феромонов и синтетических хемоаттрактантов
При получении гибридом важное значение имеет этап клонирования. Суть его заключается в получении клеточной культуры, происходящей из одной предковой клетки, т.е. одного клона идентичных друг другу клеток, продуцирующих один тип МКА.
После слияния гибридомы и элиминирования исходных лимфоцитов и плазмоцитов в лунках планшета возможно обнаружение клеток разных клонов, как продуцирующих, так и непродуцирующих МКА. Если их не разделить, то последние, размножаясь быстрее (т. к. не тратят энергию на синтез антител), дадут намного больше клеток-потомков по сравнению с нужными продуцирующими клетками, которые могут погибнуть от недостаточного поступления питательных веществ. Смеси продуцирующих клеток нескольких клонов также необходимо разделять, чтобы получать препарат одного МКА, а не смесь разных МКА.
Два основных широко применяемых на данном этапе подхода обладают рядом недостатков.
При клонировании в полужидком агаре [63] создают равномерную суспензию клеток гибридомы в ростовой среде с легкоплавким агаром при температуре + 41 С (когда агар еще жидкий, а клетки гибридомы сохраняют жизнеспособность). Через две недели появившиеся колонии отбирают пастеровской пипеткой и переносят в питательную среду для дальнейшего культивирования. Трудности при осуществлении данного способа представляют подбор подходящего легкоплавкого агара, очень узкий (в пределах 1–2 С) интервал допустимых колебаний температуры и необходимость ее поддерживать весь период смешивания [63]. При более низкой температуре агар застывает неравномерно, а при более высокой – гибнут клетки, что делает весьма вероятным потерю культуры. При использовании метода лимитирующего разведения в жидкой фазе [74] готовят суспензию определенного количества клеток гибридомы в таком расчетном объеме питательной среды, чтобы при последующем рассеивании число ячеек планшета превышало общее количество гибридомных клеток в несколько раз (обычно соотношение числа клеток к числу ячеек составляет 1:3). Теоретически, при таких условиях каждая клетка может изолированно от других попасть в одну из ячеек планшета. При осуществлении данного способа производится подсчет клеток, что сопряжено с потерей некоторого их количества, а также ошибками при приготовлении суспензии. От теоретического распределения клеток возможны отклонения, т. е. существует вероятность попадания в одну ячейку нескольких гибридных клеток из разных клонов. Все это приводит к повторному клонированию (реклонированию) и неоднократному тестированию полученных клонов, что увеличивает затраты времени и средств. Кроме того, возникают тактические трудности при отборе позитивных субклонов, связанные с получением большого их количества, – субклоны рекомендуется культивировать еще около двух недель с целью выявления и отбраковки наименее стабильных [74].
С целью уменьшить материальные затраты и сократить сроки получения стабильных штаммов гибридомных клеток, продуцирующих МКА к липофорину, мы клонировали гибридомы в ранние сроки после слияния (через девять дней) предложенным нами способом [91]. После иммунологического тестирования клонов и выбора объектов клонирования производили под визуальным контролем (используя инвертированный микроскоп) прицельный забор гибридомных клеток четко отграниченного клона устройством, имеющим тонкую длинную носовую часть (с предварительно простерилизованной насадкой) и работающим как пипетка. Клетки переносили в свежую питательную среду для дальнейшего культивирования. При наличии в одной лунке нескольких отдельно расположенных клонов, отбор и перенос клеток каждого из них производили с использованием новой стерильной насадки в разные лунки. Наличие необходимого в нашем случае иммунного ответа было подтверждено ИФА через семь дней после клонирования. Ни в одном случае не возникла необходимость в реклонировании, не наблюдалась гибель клона, снижение или потеря продуктивности.
В результате нами было получено четыре штамма гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к липофорину гемолимфы A. geryon. Штаммы были обозначены нами как P1A8-3, P1F2, P1D4 и P2E6.
Тип роста штаммов – суспензионный; клетки округлой формы, сгруппированы в кластеры. Посевная доза при культивировании гибридом в пластиковых флаконах (50–250 мл) составила 105 клеток в миллилитре. Пассировали клетки один раз в 2–3 дня, кратность рассева 1:5.
При прививке в перитонеальную полость мышей линии BALB/c гибридомы в 100 % случаев вызывали образование смешанных асцитных и солидных опухолей, которые развивались через 10–14 дней.
Секреция моноклональных антител через 2–3 дня культивирования in vitro составила 5–10 мкг/мл, в асцитической жидкости – 5 мг/мл. Титр антител, определенный методом ИФА, составил не менее 1:2000–1:8000 в культуральной и 1:10000 – 1:12000 в асцитической жидкости. Продукция антител сохранялась в течение 20 пассажей в культуре и 4 пассажей на животных.
Моноклональные антитела, продуцируемые штаммами P1A8-3, P1F2, P1D4 и P2E6 взаимодействовали с цельной гемолимфой имаго A. geryon, а также с одной из электрофоретических фракций гемолимфы (очищенной методом диск-электрофореза в ПААГ с последующей элюцией). Расположение на электрофореграмме (Рисунок 4) и желтая окраска данной белковой фракции позволили нам идентифицировать ее как липофорин. Все полученные после клонирования субклоны также продуцировали антитела к липофорину A. geryon.
Была протестирована способность полученных моноклональных антител реагировать с гемолимфой других Lepidoptera. Оказалось, что штамм Р1А8-3 продуцирует моноклональные антитела, взаимодействующие только с гемолимфой представителей подсемейства Procridinae. Установлено, что моноклональные антитела, продуцируемые штаммом P1F2, взаимодействуют с гемолимфой всех изученных представителей семейства Zygaenidae, а также с гемолимфой представителя семейства Erebidae (Amata nigricornis). Штаммы P1D4 и P2E6 продуцируют моноклональные антитела, взаимодействующие с гемолимфой всех исследованных представителей Lepidoptera.
Особенности клонирования гибридом, характеристика полученных штаммов и моноклональных антител
В рамках международного проекта «ZYGMO» [140] мы изучали нуклеотидные последовательности фрагмента митохондриального гена цитохромоксидазы I (COI) у различных представителей семейства Zygaenidae, а также оценивали возможности использования этих данных для идентификации биологических видов и выяснения их филогенетических взаимоотношений. К настоящему моменту определены нуклеотидные последовательности более 1000 особей, относящихся к 245 видам семейства Zygaenidae. Мы постарались включить в наш анализ по 2–3 последовательности представителей изучаемых родов, определенных у особей одного вида из разных мест обитания. В качестве группы сравнения – вид, относящийся к подсемейству Chalcosiinae – Aglaope infausta. С помощью аналитических инструментов BOLD 3.0 [139] с использованием двухпараметрической модели Кимуры (Kimura 2-Parameter distance model) и NJ-алгоритма [241, 295] на основании различий в последовательностях COI сконструирована дендрограмма, представленная в Приложении Б.
Исследованные виды образуют, в основном, изолированные генетические кластеры с низкой степенью внутривидовых вариаций и высоким уровнем межвидовой дивергенции. Это свидетельствует о наличии филогенетического сигнала в гене COI для данной группы видов [106].
В подавляющем большинстве случаев (94,2 %) обнаружена высокая видовая специфичность изученных нуклеотидных последовательностей. Например, в роде Zygaenoprocris подтверждается обособленность видов Z. chalcochlora, Z. khorassana, Z. efetovi и Z. hofmanni.
В то же время оказалось, что хорошо отличающиеся морфологически виды подрода Jordanita (род Jordanita), например, J. tenuicornis, J. graeca, J. chloros и J. globulariae нельзя идентифицировать по гену COI, т. к. внутривидовые вариации COI-последовательностей очень широки (дистанции между отдельными экземплярами намного выше общепринятых 2 %). Биохимическая общность некоторых представителей этого подрода подтверждается и экспериментами с использованием МКА к липофорину (см. Раздел 3.4). По всей видимости, исследования филогенетических взаимоотношений данной группы видов требуют применения иных молекулярных подходов (например, изучения особенностей хемоаттракции).
Исследования ДНК не противоречат монофилии рода Rhagades, а также подродов Molletia (род Zygaenoprocris), Procriterna, Tarmannita (род Adscita), Tremewania, Roccia (род Jordanita). Этот результат соответствует ранее выдвинутой гипотезе [178, 179], основанной на изучении белков гемолимфы, морфологических (см. ниже) и биологических признаков. Согласно первичной структуре гена СОI, виды родов Jordanita, Adscita и Zygaenoprocris образуют общую ветвь, тогда как роды Rhagades и Theresimima являются сестринскими по отношению к ним.
Суммируя вышесказанное, можно заключить, что нуклеотидная последовательность гена митохондриальной СОI видоспецифична для многих представителей семейства Procridinae. В гене СОI обнаружен филогенетический сигнал, характеризующий взаимоотношения таксонов подродового и родового ранга. Полученные молекулярные данные также служат дополнительным доказательством идеи о филогенетической близости родов Illiberis, Rhagades и Theresimima [189]. Комплекс видов Jordanita + Adscita + Zygaenoprocris относительно обособлен согласно анализу первичной структуры гена СOI.
Одной из задач нашего исследования была оценка значимости биохимических исследований (иммунологических и других молекулярных технологий) для решения проблем биосистематики Zygaenidae. Для этого необходимо было сопоставить биохимические данные и результаты, полученные с помощью таких традиционных подходов, как морфологические и цитогенетические.
При изучении экземпляров имаго, относящихся к восточно-азиатскому роду Chrysartona Swinhoe, 1892, на основании обнаруженных морфологических отличий нами был описан новый вид – Chrysartona efetovi [275]. Исследования гена COI подтвердили обособленное положение Chrysartona среди других исследованных родов Procridinae (Приложение В), и поддержали родовой ранг таксона [174, 177]: дистанция между Chrysartona sinevi и представителем рода Clelea Walker, 1854 – Clelea esakii составляет 18,67 %, что значительно выше средней дистанции между родами Procridinae [139].
Однако если морфология имаго Zygaenidae достаточно хорошо изучена, то исследования преимагинальных стадий ограничены. В отличие от взрослых особей, в коллекциях имеется мало сохранного личиночного материала (его трудно получить и сложно хранить). Тем не менее, ценность признаков ранних стадий для биосистематики и филогенетики была недавно убедительно продемонстрирована [179, 180, 186, 208].
В модельной группе систематически изучался такой признак, как хетотакстия гусениц первого возраста – расположение, количество и тип дорсальных, субдорсальных и латеральных щетинок на первом брюшном сегменте (и некоторых других брюшных и грудных сегментах). Комбинации щетинок на уровне родов и отдельных подродов Procridinae значительно отличаются [179, 189] и этот признак может быть использован для улучшения биосистематики этой группы.