Введение к работе
Актуальность темы исследования. Большое место в медицинской биохимии занимают фундаментальные исследования механизмов инициации жизненно важных процессов на молекулярном уровне, в которых важную роль играют протеолитические ферменты. Било показано их участие в таких биологических процессах как деление и рост клеток, злокачественная и вирусная трансформация клетки, реакции иммунного ответа, развитие ряда патологических состояний, в частности воспалительного характера. Знания о механизмах действия протеиназ и их ингибиторов используются при изучении патологических состояний, при исследовании механизмов и разработке новых методов их лечения.
Большую информативную ценность, как показали исследования последних лет, имеет определение концентрации и антипротеолити-ческой активности кислотостабильного ингибитора трипсина из мочи человека (мочевой трипсиновый ингибитор [МТИ]) - белка, по-видимому обладающего противовоспалительной функцией, а также являющегося маркером диссиминированных форм рака, септических состояний, болезней почек. В крови человека найдена молекула с идентичной первичной структурой, так называемый "сывороточный ингибитор трипсина" (СТИ). Концентрация СТИ и МТИ многократно возрастает в крови и моче при острых воспалительных состояниях, сепсисе, при нарушении функции почек (нефритах) и диссиминированных формах рака, что может быть результатом острофазного биосинтеза СТИ или ограниченного протеолиза молекул интер-альфа-ингибитора трипсина плазмы крови, в структуру которого входит МТИ. Высокие концентрации МТИ в моче при этих патологических состояниях, по-
видимому, являются следствием фильтрации СТИ почками. Высокие концентрации МТИ обнаружены также в моче беременных женщин.
В связи с вышесказанным достаточно актуальным является создание диагностикума для детектирования МТИ в биологических жидкостях, а также разработка методов получения МТИ с перспективой создания на их основе лекарственных средств.
Цель и задачи исследования. Получить моноклональные антитела (монАТ) против трипсинсвязывающего домена кислотостабильного ингибитора трипсина из мочи человека (МТИ), разработать на основе этих монАТ лабораторный (макетный) вариант конкурентного иммуно-ферментного анализа содержания МТИ в моче доноров и больных нефритами о условиях стационара, а также разработать на основе этих монАТ иммуносорбент для количественного выделения из мочи человека МТИ, используемого в разработке новых лекарственных средств.
Задачи исследования. 1 ) Получениз гибридом, производящих антитела к МТИ.
2) Характеристика монАТ. Отбор антител к трипсинсвязываюиему
домену МТИ.
3) Разработка лабораторного варианта конкурентного ИФА с исполь
зованием монАТ к трипсинсвязывающему домену МТИ для его
определения в моче здоровых доноров и больных нефритами.
4) Разработка высокоэффективного иммуносорбента на основе монАТ
М2 для препаративного выделения МТИ из мочи человека.
Научная новизна работы. Впервые получены моиAT к трипсин-связывающему домену МТИ. Впервые создан лабораторный вариант ИФА МТИ на базе монАТ против трипсинсвязывающего домена МТИ, позволяющий получить достоверные данные о содержании МТИ как в моче здоровых доноров, так и у больных без и с нарушениями функций по-
чек. Показано, что при помощи созданного лабораторного варианта ИФА МТИ возможно выявлять доклиническую стадию нарушения фунции почек, при которой традиционные биохимические методы еще не позволяют определить каких-либо сдвигов в фунционировании почек.
Разработан новый высокоэффективный иммуноаффиный сорбент для количественного выделения из мочи человека МТИ, используемого в разработке новых лекарственных форм на ЭПМБП при ВКНЦ АМН СССР. Новый сорбент позволяет сохранить нативную форму молекулы МТИ при выделении ее из мочи.
Практическая ценность работы. Разработан простой . иммунофер-ментный метод определения МТИ в моче здоровых доноров и больных, позволяющий проводить широкий скрининг населения с целью раннего выявления нарушения функции почек. Использование разработанного лабораторного варианта ИФА позволяет достоверно различать концентрации МТИ у здоровых доноров, у больных нефритами как на доклинической, так и клинической стадиях заболевания.
Предложен новый более эффективный, чем существующие, способ выделения МТИ из мочи человека, способствующий сохранению в ходе выделения нативной структуры белка.
Апробация работы. Диссертация "апробирована на межлабораторном семинаре института экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР (Москва, 1991). Материалы работы доложены на II Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диаг-ностикумов" (Москва, 1990 ) .
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результа-
ты", "Обсуждение результатов", "Выводы", "Приложение" и "Список литературы". Обьем работы 142 страницы машинописного текста, она содержит 23 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает 159 ссылок на советских и зарубежных авторов.