Молекулярные механизмы участия в гемостазе протромбина и продуктов его активации Тимербаев, Владимир Нуреевич

Введение к работе

Актуальность проблемы

В настоящее время проблема свертывания крови имеет такое же юльшое значение для теории и клинической практики как и в начале !е изучения. Нарушения свертывания крови являются составным эле-іентом патогенеза многих сердечно-сосудистых, инфекционных, иммунных заболеваний, хирургической и акушерской патологии. Необходи-гость предупреждения и лечения тромбозов и геморрагических состоя-ий, создание атромбогенных материалов требуют более глубокого юзнания механизма свертывания крови и его регуляции. В последние оды благодаря усилиям отечественных и зарубежных ученых удалось іриблизиться к пониманию некоторых молекулярных механизмов сосу-исто-тромбоцитарного гемостаза и уточнить последовательность [ревращений факторов свертывания в плазменном гемостазе (Д.М.Зу-іаиров, 1982; СМ. Струкова 1983; З.С.Баркаган, 1988; Б.И.Кузник и (р., 1989; А. Ш. Бышевский и др., 1993; Y.Nemerson. 1988; К. G.Mann и [р., 1990; R.F.A.Zwaal и др.. 1993; M.D.Rand и др., 1996). Вместе ; тем, несмотря на прогресс в понимании отдельных стадий, как и в [ачале изучения проблемы, остается неясным как и почему начинается :вертывание крови, какова физико-химическая природа исходного им-іульса, включающего этот процесс в целом. Нерешенность этого воп-)оса тормозит дальнейшее развитие всей проблемы свертывания крови, юобенно в ее клиническом аспекте.

Анализ современных данных о свертывании крови показывает, что зыяснить как инициируется этот процесс можно лишь при изучении мо-юкулярных механизмов сопряжения сосудисто-тромбоцитарного и плаз-іенного гемостаза. Клинические наблюдения показывают, что контактуй механизм инциирования свертывания не является абсолютно обязательным. Он не может служить для сопряжения различных стадий ге-гастаза. В каскаде генерации тромбина абсолютно необходимы только :е реакции, в которых участвуют витамин К-зависимые факторы VII, X X и протромбин. Они последовательно активируются при участии юнов Са²⁺ в нескольких ферментных комплексах. Комплексы имеют од-ютшную организацию, включающую наряду с ферментом и субстратом іелок-кофактор и каталитическую фосфолипидную поверхность. Необхо-дамые для свертывания фосфолипиды поступают из мембран клеток.

- 2 -соприкасающихся с кровью. В норме, при отсутствии стимуляции повреждения мембраны клеток атромбогенны. Ясно, что превращені' атромбогенной фосфолипопротеиновой поверхности клеточных мембран каталитически активную, способную связывать витамин К-зависимь факторы, является неотъемлемым элементом сопряжения разных стада гемостаза и его инициирования.

До начала настоящих исследований было установлено, что щ. образовании ферментных комплексов витамин К-зависимых факторе происходит связывание их с кислыми фосфолипидами мембран, главнь образом, фосфатидилсерином. Связывание обеспечивается Са^г+-опосре дованным взаимодействием отрицательно заряженных групп фосфолипи дов и остатков "у-карбоксиглутаминовой кислоты (Гла) в белке. Одна ко, ничего не известно о том как образуется каталитически активна фосфолипидная поверхность и как происходит формирование ферментнь комплексов витамин К-зависимых факторов. В коагулологии не усвоен новые данные о фазовых переходах в биологических мембранах и изме нениях их структуры для обеспечения различных клеточных функций секреции, фагоцитоза, движения и др. Это является, на наш взгляд причиной отсутствия каких бы то ни было представлений о значени структуры фосфолипопротеиновой поверхности для формирования и ра боты ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов и в цело в инициировании свертывания крови. Кроме того, инициирование этот процесса не может быть сведено только к образованию подходяще фосфолипидной поверхности для связывания витамин К-зависимых фак торов. В последовательной цепи их превращений есть реакции положи тельной обратной связи. Фактор Ха и тромбин активируют фактор vn а фактор Vila активирует фактор IX. Таким образом, каскад обяза тельных реакций генерации тромбина должен запускаться при появле нии первой активной молекулы любого из этих факторов. Каков основ ной механизм появления первой активной молекулы витамин К-зависи мых факторов остается неизвестным. Ясно, что образование каталити ческой фосфолипидной поверхности при инициировании свертывани связано и с первичной активацией одного из этих факторов. Таки образом, выяснение принципов организации и работы ферментных комп лексов витамин К-зависимых факторов является фундаментальной зада чей всей проблемы свертываемости крови.

Превращение протромбина в тромбин является ключевым звеном на котором замыкаются внутренний и внешний биохимические механизм

свертывания. Представлялось возможным выяснить основные черты работы ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов при изучении молекулярной структуры, активации и взаимодействия протромбина и его производных с фосфолипидной поверхностью и клетками. Это должно прояснить структурную основу каталитической активности фосфолипидной поверхности при свертывании и тем самым выяснить в основных чертах механизм приобретения клеточными мембранами тромбо-генных свойств и инициирования свертывания крови. В свете изложенного такое исследование представляется неизбежным этапом естественного развития проблемы свертываемости крови и является актуальным как в теоретическом так и в практическом отношении.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в выяснении молекулярных механизмов формирования протромбиназного комплекса и превращения протромбина в тромбин.

Достижение цели работы требовало последовательного выполнения трех групп исследований - установления основных черт молекулярной структуры протромбина, характера взаимодействия его с фосфолипидной поверхностью и возможных вариантов его естественной активации. 3 соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и совершенствование методов очищения протромбина, продуктов его активации - фрагмента I, претромбина I и сс-тром-зина, а также фактора X.

2. Установление основных физико-химических параметров молеку-ты протромбина (молекулярной массы, аминокислотного и углеводного состава, числа полипептидных и олигосахаридных цепей).

3. Выяснение характера связывания протромбина, продуктов его іктивации и фактора X с тканевым тромбопластином.

4. Изучение спектра продуктов расщепления протромбина при со-ієвой активации и взаимодействии с фактором ХПа, с клетками Купфе-а и гепатоцитами.

5. Выявление в плазме крови продуктов активации протромбина -рагмента I и претромбина I.

6. Разработка представлений о механизме формирования фермент-ых комплексов витамин К-зависимых факторов и приобретения клеточ-ыми мембранами тромбогенных свойств.

_ 4 -Научная новизна

Разработаны новые методы очищения протромбина, отличающие< от существующих меньшей трудоемкостью при сравнимых выходе, ЧИСТ( те и биологической активности препаратов. Автором одним из перві установлены основные физико-химические параметры молекулы протрої бина - молекулярная масса, N- и С-концевые аминокислоты, аминокж лотный состав, число и состав углеводных цепей, соотношение фар пространственной структуры полипептидной цепи. Впервые для факте ров свертывания у протромбина выявлена микрогетерогенность по уі леводным цепям, что позволило разработать представление об участі-их в стабилизации положения белка на фосфолипидной поверхности щ. формировании протромбиназного комплекса. Впервые вывлены различнь типы фосфолишдных центров связывания витамин К-зависимых факторе на фосфолипопротеиновых частицах мезоморфной структуры (тканевс тромбопластине). Получены доказательства, что Са²⁺-опосредованнс связывание фвкторов с центрами обеспечивается в определенной мер непосредственно Са²⁺-независимым взаимодействием белка с фосфоли пидами. Установлено, что взаимодействие протромбина с центрам связывания обеспечивается N-концевым участком его молекулы. Обна ружено подавляющее действие ионов Са²⁺ на связывание ос-тромбина фосфолипопротеиновыми частицами, что должно обеспечивать быстро формирование фибринового сгустка при свертывании крови. Установле но отсутствие прямого активирующего действия фактора XI1а на прот ромбин, что свидетельствует о самостоятельном значении в механизм свертывания каскада активации витамин К-зависимых факторов как не делимого целого. Получены доказательства однотипности расщеплени протромбина при аутоактивации в растворах солей, спонтанном распа де и естественной активации фактором Ха и тромбином. Установлено что катаболизм протромбина протекает с расщеплением его в циркули рующей крови на фрагмент I и претромбин I, которые затем поглоща ются клетками фагоцитарно-макрофагальной системы.

Теоретическая ценность работы

На основе полученных экспериментальных данных автором разработан ряд теоретических положений и моделей, раскрывающих в общи: чертах механизмы формирования ферментных комплексов витамин К-за-

їсимьіх факторов и инициирования свертывания крови. Впервые с уче-т гидрофобного взаимодействия конкретизирован физический меха--!зм Са²⁺-опосредованного связывания витамин Н-зависимых факторов неоднородной поверхностью фосфолипопротеиновых частиц. Разрабо-іна модель "поверхностной массопередачи субстрата", объясняющая эханизм каталитического действия фосфолипидной поверхности при эрментативной активации факторов. Впервые разработано представлене о структурной основе развертывания каскада реакций образования эомбина в виде ансамбля ферментных комплексов витамин К-зависимых ікторов на фосфолишдной поверхности с низкой высокоаффинныш энтрами связывания. На основе достижения биоимитирующего катализа зкрыт механизм аутоактивации и распада протромбина и разработаны эедставления о неферментативном аргинилспецифичном протеолизе вишин К-зависимых факторов на поверхности фосфолипопротеиновых їстиц в циркулирующей крови, который ведет к запуску каскада их эрментативных превращений. Разработана функциональная концепция тациирования свертывания крови, в соответствии с которой тромбо-знность клеточных мембран обеспечивается индуцируемой через ре-эпторный аппарат перестройкой их бислойной структуры в мезоморф-/ю с формированием фосфолипидных центров связывания витамин К-за-4СИМЫХ факторов. Обосновано положение о значении ионов Са²⁺ как эссенджера при свертывания крови.

Практическая значимость работы

Результаты работы позволяют непосредственно использовать их в эдико-биологических исследованиях. При изучении свертываемости зови оправдано использование разработанных методов очищения прот-змбина, отличающихся малой продолжительностью выделения белка, го существенно для достижения его высокой чистоты и активности. ж изучении действия тромбина, особенно на уровне организма, наи-злее предпочтительно применение изобретенного автором способа ме-эния его ¹²⁵1, позволяющего полностью сохранить свертывающую ак~ івность радиоактивного фермента. Результаты исследования позволя-г предложить для изучения механизмов регуляции свертывания крови азработанный способ определения фрагмента I и претромбина І в іазме крови. Практическое значение работы состоит также в значи-эльном расширении возможностей перспективных исследований по соз-

данию новых средств предупреждения тромбозов и новых атромбогеннь материалов.

Положения, выносимые на защиту

7. Протромбин является плазменным гликопротеином с одной ПС липептидной цепью преимущественно неупорядоченной структуры и 2-олигосахаридными цепями, которым присуща микрогетерогенность.

8. Протромбин и другие витамин К-зависимые факторы свертывг ния взаимодействуют на поверхности тканевого тромбопластина с дв;» мя типами фосфолипидных центров связывания, наличие которых обус ловлено мезоморфной структурой тромбопластина. Центры связывания различным сродством необходимы для формирования и поддержания кг талитической активности ферментных комплексов витамин К-зависимь факторов и их компактных ансамблей, обеспечивающих согласованное! реакций каскада генерации тромбина.Приобретение клеточными мембрг нами тромбогенных свойств связано с Са²⁺-опосредованной перестрой кой их бислойной структуры в мезоморфную.

9. Протромбин ввиду особенностей структуры (наличия остатке Т(-карбоксиглутаминовой кислоты) при контакте с отрицательно зар женными поверхностями и хелатообразователями подвергаете Са²⁺-опосредованному аргинил-специфичному неферментативному проте олизу, имитирующему естественную активацию профермента. Биоимитк рующий протеолиз витамин К-зависимых факторов на трансформировав ной поверхности клеточных мембран является, по-видимому, неотъе^ лемым элементом инициирующего действия перестройки структуры плаз матических мембран на свертывание крови.

10. Катаболизм протромбина протекает с расщеплением свя; Арг155-Сер156 и появлением в кровотоке фрагмента I и претромбш I, которые могут участвовать в регуляции свертывания крови.

Связь исследований с научной программой

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом ш учных исследований КГМУ по теме: "Инициальные механизмы диссемиш-рованного внутрисосудистого свертывания крови", шифр 0.69.05, Гос. per. 01.84.0 039981, инв. N213.009-08.

Апробация работы

Материалы исследования доложены на II Всесоюзном биохимичес-ом съезде (Ташкент, 1969), Всесоюзном симпозиуме по химии протео-итических ферментов (Вильнюс, 1973), IV Всесоюзной конференции Система свертывания крови и фибринолиз" (Саратов, 1975), IV Все-оюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Ростов-на-Дону, 977), III Всесоюзной конференции "Противотромботическая терапия в линической практике. Новое в теории, диагностике, лечении" (Моск-а, 1985), Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы гемостаза в линической практике (Москва, 1987), Совещании Центрального совета сесоюзного биохимического общества АН СССР (Казань, 1988), Всесо-зной конференции "Физиология и патология гемостаза" (Полтава, Э91), Первом международном патофизиологическом конгрессе (Москва, 391), Российской конференции "Актуальные вопросы службы крови и эансфизиологии" (С.-Петербург, 1995).

Внедрение результатов исследования

Представления об инициировании свертывания крови фазовой пе-эстройкой клеточных мембран и биоимитирующим протеолизом витамин -зависимых факторов включены в новые переводные и отечественные тебники для высшей школы ("Гистология", "Терапия", "Педиатрия"), также в лекционные курсы на кафедрах биоорганической и биофизи-эской химии КГМУ и биологической химии Казанского университета, этод получения меченного ¹²⁵1 а-тромбина с полностью сохраненной зертывающей активностью принят к реализации в исследованиях свер-жаемости крови на кафедре физиологии человека и животных биоло-іческого факультета Московского университета.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том числе злучено авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания

методов исследований, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографии. Работа изложена на 241 странице машинописного текста, содержит 7 таблиц и 23 рисунка. Список литературы включает 298 источников, из них 252 на иностранных языках.