Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Нейрональные стволовые клетки ЦНС взрослых млекопитающих 14
1.1.1. Стволовые клетки 15
1.1.2. Локализация и пути миграции НСК в головном мозге взрослых млекопитающих 16
1.1.3. НСК спинного мозга взрослых животных 18
1.2. Факторы и механизмы, регулирующие самообновление и дифференцировку НСК 18
1.2.1. Регуляция самообновления НСК 18
1.2.2. Участие MAPK сигнальных каскадов в регуляции пролиферации и дифференцировки НСК 21
1.2.3. Роль цитокинов в регуляции нейрогенеза 25
1.2.3.1.Семейство IL-6-подобных цитокинов 27
1.2.3.2. Нейротрофины 29
1.2.4. Роль р53 в нейрогенезе 31
1.2.4.1. Факты, определившие роль р53 в нейрональной дифференцировке 32
1.2.4.2. Роль р53 как транскрипционного фактора в регуляции дифференцировки 34
1.2.4.3. р53-зависимая регуляция клеточного цикла 36
1.2.4.4. Прямые белок-белковые взаимодействия р53 39
1.2.4.5. Влияние белка р53 на активность MAPK сигнального каскада 43
1.2.4.6. Посттрансляционные изменения белка р53 45
1.2.5. Протеинкиназы семейства Pim 48
1.2.5.1. Регуляция экспрессии, стабильности и активности Pim-1 49
1.2.5.2. Функциональная роль Pim киназ 51
1.2.5.3. Участие Pim-1 в регуляции апоптоза 52
1.2.5.4. Роль Pim-1 в регуляции клеточного цикла, пролиферации и дифференцировки 54
1.2.5.5. Роль Pim киназ в ЦНС 58
1.2.6. Белки семейства Bcl-2 60
1.2.6.1. Регуляция экспрессии Bcl-2 60
1.2.6.2. Регуляция активности Bcl-2 63
1.2.6.3. Роль Bcl-2 в регуляции клеточного цикла 64
1.2.6.4. Участие Bcl-2 в нейрональной дифференцировке 68
1.2.7. Функциональные взаимодействия между белками апоптоза р53, Bcl-2 и Pim-1 в соматических клетках 70
1.3. Трансплантация стволовых клеток 72
Глава 2. Результаты и обсуждение 77
2.1. Pim-1-зависимые механизмы нейрональной дифференцировки 77
2.1.1. Материалы и методы 78
2.1.1.1. Животные 78
2.1.1.2. Клеточные культуры 79
2.1.1.3. Использованные плазмиды для трансфекции клеток РС12 79
2.1.1.4. Эксперименты 80
2.1.1.5. Анализ люциферазной активности 81
2.1.1.6. In situ гибридизация 82
2.1.1.7. RT-PCR анализ экспрессии мРНК Pim-1 82
2.1.1.8. Анализ уровня катехоламинов 83
2.1.1.9. Вестерн блот анализ 83
2.1.1.10. Морфологический и иммуногистохимический анализ 83
2.1.1.10. Использованные антитела 84
2.1.1.11. Статистический анализ 84
2.1.2. Результаты 84
2.1.2.1. Анализ экспрессии Pim-1 в ЦНС крыс и мышей 84
2.1.2.2. Регуляция активности и экспрессии NFATc в дифференцированных клетках РС12 86
2.1.2.3. Pim-1 повышает активность NFATc в клетках РС12 88
2.1.2.4. Pim-1 повышает индуцированный форсколином синтез катехоламинов 90
2.1.2.5. Анализ NFATc2/c3 нокаутных мышей 92
2.1.2.6. Ингибирование Pim-1 изменяет направленность нейрональной дифференцировки 94
2.1.3. Обсуждение 98
2.2. Bcl-2-зависимые механизмы нейрональной дифференцировки 103
2.2.1 Материалы и методы 105
2.2.1.1. Животные 105
2.2.1.2. Органотипические культуры гиппокампа 105
2.2.1.3. Переживающие срезы гипоталамуса 105
2.2.1.4. Культуры нейрональных стволовых клеток 106
2.2.1.5. Эксперименты: 106
2.2.1.5. Иммуногистохимический анализ 108
2.2.1.6. Вестерн блот 108
2.2.1.7. Использованные антитела 108
2.2.1.8. Морфофункциональный анализ материала 109
2.2.1.9. Статистический анализ результатов. 109
2.2.2. Результаты 110
2.2.2.1. Анализ Bcl-2 нокаутных мышей 110
2.2.2.2. Эффекты ингибирования активности Bcl-2 на пролиферацию и дифференцировку НСК 111
2.2.2.3. Механизмы действия Bcl-2 115
2.2.3. Обсуждение 121
2.3. р53-зависимые механизмы нейрональной дифференцировки 124
2.3.1. Материалы и методы 127
2.3.1.1. Животные 127
2.3.1.2. Органотипические культуры гиппокампа 127
2.3.1.3. Переживающие срезы гипоталамуса 128
2.3.1.4. Клеточные культуры 128
2.3.1.5. Эксперименты: 129
2.3.1.6. Определение уровня дофамина 131
2.3.1.7. Морфологический, иммуногисто- и цитохимический анализ 132
2.3.1.8. Вестерн блот 132
2.3.1.9. Использованные антитела 132
2.3.1.9. Морфофункциональный анализ материала 133
2.3.1.10. Статистический анализ результатов. 133
2.3.2. Результаты 134
2.3.2.1. Влияние р53 на дифференцировку НСК 134
2.3.2.2. Анализ влияния р53 на функционирование катехоламинергических нейронов 139
2.3.2.3. Анализ ERK зависимого сигнального каскада 144
2.3.2.4. Анализ влияния р53 на механизмы самообновления НСК 151
2.3.3. Обсуждение 153
2.3.3.1. Влияние р53 на пролиферацию НСК и нейрональную дифференцировку 153
2.3.3.2. Анализ механизмов р53-зависимой нейрональной дифференцировки 158
2.4. Нейрогенный потенциал спинного мозга 163
2.4.1. Методы 164
2.4.1.1. Животные 164
2.4.1.2. Культуры спинного мозга 164
2.4.1.3. Культура клеток линии D3 165
2.4.1.4. Выявление алкалин-фосфатазы 165
2.4.1.5. ПЦР реакция с обратной транскрипцией 165
2.4.1.6. Дифференцировка клеток нейросфер 166
2.4.1.7. Использованные антитела для иммунофлуоресцентного анализа: 166
2.4.2. Результаты 166
2.4.2.1. Формирование нейросфер в органотипической культуре 166
2.4.2.2. Анализ нейросфер в органотипической культуре 168
2.4.2.3. Дифференцировка клеток нейросфер 169
2.4.3. Обсуждение 171
2.5. Трансплантация стволовых клеток в спинной мозг 174
2.5.1. Методы 178
2.5.1.1. Культивирование эмбриональных стволовых клеток 178
2.5.1.2. Животные 179
2.5.1.3. Модель повреждения спинного мозга 179
2.5.1.4. Анализ поведения 181
2.5.1.5. Иммуноферментные анализы (ELISA) 182
2.5.1.6. Оценка фосфорилирования протеинкиназ 183
2.5.1.7. ПЦР в режиме реального времени 183
2.5.1.8. Вестерн блот анализ 185
2.5.1.9. Использованные антитела для Вестерн блот анализа, иммуноцитохимического- и гистохимического анализов 185
2.5.1.10. Статистический анализ 186
2.5.2. Результаты 186
2.5.2.1. Анализ нейрональной дифференцировки ЭСК 186
2.5.2.2. Анализ результатов поведенческих тестов 188
2.5.2.3. Морфологический анализ спинного мозга 193
2.5.2.4. Анализ экспрессии IL-6 и его рецепторов в спинном мозге и ЭСК 197
2.5.2.5. Анализ экспрессии BDNF и его рецепторов в спинном мозге и ЭСК 200
2.5.2.6. Трансплантированные клетки восстанавливают уровень цАМФ в ткани реципиента 202
2.5.2.7. Оценка белков, регулирующих рост аксонов 203
2.5.2.8. Оценка уровня глутамата в спинном мозге 204
2.5.2.9. Анализ экспрессии эритропоэтина в спинном мозге и ЭСК 206
2.5.2.10. Уровень фосфорилирования протеинкиназ 208
2.5.3. Обсуждение 209
Заключение 217
Выводы 220
Список литературы 221
- Участие MAPK сигнальных каскадов в регуляции пролиферации и дифференцировки НСК
- Эффекты ингибирования активности Bcl-2 на пролиферацию и дифференцировку НСК
- Анализ ERK зависимого сигнального каскада
- Анализ результатов поведенческих тестов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Процессы нейрогенеза в мозгу взрослых животных являются
предметом активного изучения на протяжении последнего десятилетия (Jin and Galvan, 2007; Kazanis, 2012; Knoth et al., 2010; Riquelme et al., 2008). На сегодняшний день нейрональные стволовые клетки (НСК) выделены и частично охарактеризованы. Их локализация была определена во многих отделах ЦНС, из которых в мозге основными нейрогенными нишами являются субгранулярная зона зубчатой извилины и субвентрикулярная зона латеральных желудочков (Jin and Galvan, 2007). Также показано наличие НСК в спинном мозге (Foret et al., 2010; Hamilton et al., 2009; Sabelstrom et al., 2014). Таким образом, существует потенциал для полноценной регенерации нервной ткани. Однако для управляемого регулирования пролиферации и дифференцировки нейрональных стволовых клеток непосредственно в ЦНС необходимо получить доскональные знания о молекулярных механизмах регуляции нейрогенеза. На сегодняшний день эти процессы активно изучаются, но данные далеко не полны.
К настоящему моменту наиболее детально изучены процессы пролиферации и дифференцировки соматических клеток и эмбриональных стволовых клеток. Так, было показано, что экстраклеточно сигнал-регулируемая киназа1-го и 2-го типов (ERK1/2), и, соответственно, ERK1/2-зависимый каскад являются одним из основных внутриклеточных путей регуляции клеточного цикла (Schramek, 2002) и клеточной дифференцировки (Aouadi et al., 2006), а в нейронах ERK1/2 киназы также участвуют в регуляции аксонального роста (Feng et al., 2004; Li et al., 2006b; Stavridis et al., 2007). Активация ERK-зависимого каскада может осуществляться различными путями, одними из которых являются митогенные стимулы. Показано, что помимо митогенных стимулов, в регуляции активности ERK1/2 могут принимать участие сигнальные белки апоптоза р53 и Bcl-2 (Lee et al., 2000; Singh et al., 2007). На сегодняшний день известно, что эти белки обладают также и неапоптозными функциями (Gross and Katz, 2017; Tedeschi and Di Giovanni, 2009). Установлено, что р53 и Bcl-2 находятся в тесном взаимодействии в процессе регуляции апоптоза, а также вовлекают в этот процесс Pim-1 киназу (Hemann and Lowe, 2006; Hogan et al., 2008; Lilly et al., 1999; Shinto et al., 1995). Эти данные свидетельствуют о том, что функциональные взаимодействия между этими белками могут быть важны для нормального функционирования клетки, и что ERK1/2 киназы могут являться их универсальной мишенью.
Известно, что такие белки апоптоза как р53, Bcl-2 и Pim-1 активно экспрессируются в процессе эмбрионального развития ЦНС (Eichmann et al., 2000; Komarova et al., 1997; Merry et al., 1994). Высокий уровень экспрессии Bcl-2 и р53 наблюдается и в нейрогенных зонах взрослых животных (Bernier
and Parent, 1998; Meletis et al., 2006). Эти данные явились основной предпосылкой для выдвижения нашей гипотезы об их непосредственном участии в нейрогенезе.
Несмотря на наличие эндогенных НСК, при травмах регенерация
центральной нервной системы у половозрелых животных сильно
лимитирована. С другой стороны, показано, что трансплантация
эмбриональных стволовых клеток в места повреждения, а также при
нейродегенеративных заболеваниях значительно повышает
регенерационные процессы, как в головном, так и в спинном мозге (Becerra et al., 2007; Cao et al., 2001; Han et al., 2002; Hoane et al., 2004; Kerr et al., 2003; Myckatyn et al., 2004). Однако механизмы, опосредующие позитивные эффекты трансплантации стволовых клеток, до сих пор остаются не изученными. В связи с этим возникает вопрос, возможно ли, что трансплантированные клетки, секретируя в ткань хозяина некие активные факторы, стимулируют эндогенную регенерацию нервной ткани?
Таким образом, назрела необходимость комплексного изучения НСК
- от молекулярных механизмов контроля их пролиферации и
дифференцировки до анализа их роли в процессах регенерации. Решению этой важной проблемы посвящена настоящая работа.
Цель работы: изучить Bcl-2, p53 и Pim-1 зависимые механизмы нейрональной дифференцировки, а также механизмы регуляции регенерации нервной ткани после трансплантации стволовых клеток в зону повреждения. Задачи:
-
Изучить влияние белков Bcl-2, p53 и Pim-1 на развитие и функционирование катехоламинергических нейронов.
-
Определить роль и механизмы действия сигнальных белков апоптоза р53, Bcl-2 и Pim-1 в регуляции пролиферации и направленности дифференцировки НСК.
-
Исследовать возможность стимуляции пролиферации и дифференцировки эндогенных НСК спинного мозга.
-
Определить эффект трансплантации пре-дифференцированных по нейрональному типу ЭСК на восстановление сенсомоторной чувствительности при повреждениях спинного мозга.
-
Изучить молекулярные механизмы регуляции нейрорегенерации, опосредующие позитивный эффект пре-дифференцированных по нейрональному типу ЭСК.
Научная новизна
Впервые были исследованы молекулярные механизмы регуляции нейрогенеза сигнальными белками апоптоза р53, Bcl-2 и Pim-1. Полученные данные свидетельствую о том, что р53 тормозит пролиферацию и активирует дифференцировку по нейрональному типу. Анализ механизмов действия р53
показал, что ингибирующее влияние р53 на пролиферацию НСК
опосредовано, с одной стороны, активирующим влиянием р53 на экспрессию
белка Phb1 (prohibitin 1), который, негативно регулирует клеточный цикл, а с
другой стороны, р53 ингибирует активность транскрипционного фактора
Sox2, который является основным регулятором мультипотентности и
самообновления НСК. Также впервые получены доказательства,
свидетельствующие о том, что р53-зависимая стимуляция нейрональной
дифференцировки основана на его активирующем влиянии на MAPK
сигнальный каскад на уровне cRaf киназы. Таким образом, впервые показано,
что стимуляция нейрональной дифференцировки опосредована
ингибирующем влиянием р53 на пролиферацию и активирующем действием на cRaf/ERK/CREB сигнальный каскад. При этом впервые показано, что р53 играет важную роль в процессе формирования и функционирования катехоламинергических центров гипоталамуса.
Впервые было показано, что ингибирование Bcl-2 повышает
пролиферацию НСК, о чем свидетельствует повышение экспрессии
фосфорилированной формы гистона Н3 и количества фосфо-Н3 позитивных
клеток в культуре, а также снижение активности ERK1/2 и экспрессии
CRMP-2, белка, участвующего в росте аксонов. Также впервые был выявлен
феномен образования нейросфер при ингибировании Bcl-2 в
органотипической культуре гиппокампа как результат активной
пролиферации. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об антипролиферативной роли Bcl-2. Впервые были показано, что Bcl-2 играет важную роль в регуляции дифференцировки катехоламинергических нейронов гиппокампа в процессе онтогенеза.
Впервые было показано, что Pim-1 играет модулирующую роль в
регуляции направленности нейрональной дифференцировки и активирует
синтез катехоламинов. При этом в зависимости от приходящих стимулов
Pim-зависимая модуляция может быть опосредована различными
находящимися в тесном взаимодействии белками, такими как NFATc, PKA, CRMP-2, ERK1/2 и р53.
Таким образом, впервые показано, что сигнальные белки апоптоза
р53, Bcl-2 и Pim-1 не только регулируют нейрогенез, но и осуществляют
модулирующий контроль функционирования и дифференцировки
катехоламинергических нейронов. Также получены свидетельства того, что эти белки координируют пролиферацию и дифференцировку, находясь в тесном взаимодействии и вовлекая ERK-зависимый сигнальный каскад.
Были получены данные о том, что эмбриональные стволовые клетки, дифференцированные по нейрональному типу, активно экспрессируют и секретируют BDNF и IL-6. Впервые было доказано, что эти клетки, трансплантированные в зону повреждения спинного мозга, активно секретируют BDNF и IL-6 в ткань реципиента, в результате чего в клетках реципиента происходит активация цАМФ/PKA пути и, таким образом,
секреция нейротрофинов и цитокинов из клеток-доноров приводит к
стимуляции регенерации нервной ткани и быстрому восстановлению
сенсомоторных функций. Также впервые показана возможность
стимулированного нейрогенеза в спинном мозге.
Теоретическая и практическая значимость
Исследование имеет фундаментальное значение для понимания механизмов нейрогенеза на всех уровнях: от пролиферации НСК до их финальной нейрональной дифференцировки. Полученные результаты о роли сигнальных белков апоптоза р53, Bcl-2 и Pim-1 свидетельствуют об их непосредственном участии в регуляции внутриклеточной сигнализации, опосредующей развитие нейрогенеза. Результаты исследования также напрямую указывают на то, что нейрональные стволовые клетки секретируют различные факторы роста и, таким образом, активируют механизмы регенерации нервной ткани. Полученные результаты важны для понимания молекулярных механизмов регуляции нейрогенеза, что имеет большое значение для разработки протоколов, направленных на стимуляцию дифференцировки эндогенных НСК в определенный тип нейронов in vivo. Поскольку ЦНС (головной и спинной мозг) содержит эндогенные пулы НСК, управление нейрогенезом может иметь важное значение для разработки новых подходов в лечении нейродегенеративных заболеваний и травм ЦНС. Также полученные данные могут быть использованы для стимуляции направленной дифференцировки эмбриональных или нейрональных стволовых клеток в условиях in vitro, что может значительно повысить эффективность лечения стволовыми клетками.
Полученные данные могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов и медицинских институтов.
Положения, выносимые на защиту
-
Пролиферация и дифференцировка НСК зависит от активности сигнальных белков апоптоза р53, Bcl-2 и Pim-1. р53 и Bcl-2 оказывают ингибирующее влияние на процессы пролиферации и активируют нейрональную дифференцировку. Pim-1 модулирует направленность нейрональной дифференцировки. р53, Bcl-2 и Pim-1 играют важную роль в контроле развития, дифференцировки и функционирования катехоламинергических нейронов.
-
Основной механизм нейрональной дифференцировки в результате влияния р53, Bcl-2 и Pim-1 основан на их влиянии на активность ERK1/2-зависимый MAPK сигнальный каскад.
-
Длительное культивирование срезов спинного мозга в обогащенной среде стимулирует пролиферацию и
дифференцировку НСК в мото- и интернейроны, характерные для
спинного мозга
4. Трансплантированные пре-дифференцированные ЭСК
секретируют нейротрофины и цитокины в ткань реципиента,
активируют процесс регенерации поврежденных участков
спинного мозга и опосредуют быстрое восстановление
сенсомоторных функций.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на: Neuroscience-2005, 35th SfN Annual
Meeting, Washington, DC, USA; Neuroscience-2006, 36th SfN Annual Meeting,
Atlanta, GA, USA; Institute of Experimental medicine ASCR, Prague, Czech
Republic (2006, приглашенная лекция); Biocenter Oulu, Oulu University,
Finland (2009, приглашенная лекция); 1st International Conference on Cell
Science and Stem Cell Research, 2011, Philadelphia, USA; IX Всероссийской
конференции «Нейроэндокринология-2010», 2010, Санкт-Петербург; 2nd
World Congress on Cell Science and Stem Cell Research, 2012, San Antonio,
USA; BIT’s Majior Diseases Clinical Summit, 2013, Warsaw, Poland; 38th
Congress of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS), 2013, Saint
Petersburg, Russia; 10th World Congress on Neurohypophyseal Hormones 2013,
Bristol, UK; 2nd International Annual Conference of the German Stem Cell
Network 2014, Heidelberg, Germany; Всероссийской конференции
«Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» 2014, Санкт-Петербург; 5th World Congress on Cell Science and Stem Cell Research, 2015, Chicago, USA; IX Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2015», 2015, Санкт-Петербург; XV Всероссийском совещании с международным участием и VIII школе по эволюционной физиологии 2016, Санкт-Петербург; Всероссийской конференции с международным участием "StemCellBio-2016: фундаментальная наука как основа клеточных технологий", 2016, Санкт-Петербург.
Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 34 печатных работах, в числе которых 15 статей в журналах, включенных в системы цитирования Web of Science и Scopus.
Личный вклад соискателя состоит в ведущей роли в выборе направления
исследований, объектов исследования, планировании экспериментальных
работ, выборе адекватных методов исследования. Глазова М.В. лично
принимала участие в работе на всех ее этапах - от разработки
экспериментальных моделей и протоколов, до проведения
экспериментальных работ и анализа полученных данных. Обобщение и интерпретация результатов, изложенных в диссертации, а также подготовка публикаций сделаны автором лично.
Структура и объем диссертации
Участие MAPK сигнальных каскадов в регуляции пролиферации и дифференцировки НСК
Одним из основных внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих пролиферацию и дифференцировку НСК, является MAPK сигнальный каскад (mitogen-activated protein kinase cascade). MAP киназы объединяют в себе три основные группы: ERK1/2, JNK1/2 и p38MAPK (рис. 3). Эти серин-треониновые киназы регулируются специфичными для каждой киназы каскадами фосфорилирования и различаются финальными мишенями, определяющими их функциональное значение для клетки (Aouadi et al., 2006).
Основную роль в регуляции нейрональной дифференцировки из представленных MAP киназ играет ERK1/2-зависимый каскад (Li et al., 2006b; Stavridis et al., 2007). В этом каскаде ключевую роль активатора ERK1/2 играют MEK1/2 киназы, поскольку ERK1/2 является единственным известным субстратом MEK1/2. Со свой стороны регуляция активности MEK1/2 осуществляется вышележащими киназами c-Raf, a-Raf или b-Raf в зависимости от приходящего стимула и типа клеток. При этом для нейронов и нейрональных стволовых клеток наиболее важную роль в активации ERK1/2 пути играют c-Raf и b-Raf (Zhong et al., 2007). MEK1/2-индуцированное фосфорилирование треонина и тирозина (Thr-Gluyr motif) ERK1/2 является необходимым для транслокации ERK1/2 в ядро, которое может осуществляться как пассивным, так и активным транспортом (Turjanski et al., 2007). Связывание ERK1/2 с ядерными субстратами заякоревает его в ядре и регулирует активность ядерных белков, таких как транскрипционные факторы, в частности, транскрипционный фактор CREB (Adams et al., 2000). Активация CREB в свою очередь индуцирует транскрипцию генов, необходимых для дифференцировки (Reichardt, 2006). Однако половина активного ERK1/2 остается в цитоплазме, где, связываясь с белками цитоскелета, участвует в его реорганизации (Schramek, 2002) (рис. 4).
Исследования роли ERK1/2 в регуляции нейрональной дифференцировки в основном проводятся на клетках линии РС12, а также на эмбриональных стволовых клетках. Основные данные, полученные при использовании различных вариантов нокаутирования ERK1 или 2 (полного или частичного), показали, что ERK1/2 является необходимым фактором регуляции нейрональной дифференцировки (Hamilton et al., 2013). Также было показано, что ERK1/2 не только значительно активируется при стимуляции нейрональной дифференцировки введением различных факторов, таких как нейротрофины или ретиноидная кислота (Li et al., 2006b; Rueda et al., 2002), но также при этом ингибирует экспрессию генов Nanog и Tbx3, поддерживающих плюрипотентное состояние ЭСК (Hamilton et al., 2013). Помимо этих данных также показано, что ERK1/2 является необходимым фактором клеточной пролиферации (Vithayathil et al., 2015). Эти результаты не противоречат данным об определяющей роли ERK в нейрональной дифференцировке, поскольку в клетке ERK1/2 имеют постоянный уровень активности. То есть эти протеинкиназы обладают постоянным уровнем фосфорилирования, который может быть значительно повышен при активации, к примеру, рецепторов факторов роста. При этом понижение уровня фосфорилирования ниже пороговых значений может быть достигнуто только введением специфических блокаторов, а нокаутирование ERK2 киназы летально (Kuida and Boucher, 2004). По-видимому, для регуляции пролиферации необходимо и достаточно стабильно фосфорилированной формы ERK1/2, тогда как для дифференцировки и активации его ядерных функций необходимо значительное повышение фосфорилирования ERK1/2.
Роль ERK1/2 в нейрональной дифференцировке определяется, в основном, непосредственным регулированием активности транскрипционных факторов и белков цитоскелета. С другой стороны, также показано, что ERK1/2 может влиять на активность других сигнальных каскадов, в частности GSK3b (Ding et al., 2005), а также получать сигналы активации или ингибирования от других молекул, таких как р53, Bcl-2, etc (Feng et al., 2004; Wu, 2004). Поскольку ERK-каскад во много является определяющим в процессах пролиферации и дифференцировки, он был рассмотрен наиболее подробно. Однако эти процессы также регулируются и другими внутриклеточными посредниками, такими как GSK3, STATs, IP3 и многими другими. Конкретная роль различных киназ и белков будет представлена в процессах регуляции функционального состояния клеток при стимуляции пролиферации митогенными факторами и/или дифференцировки.
Эффекты ингибирования активности Bcl-2 на пролиферацию и дифференцировку НСК
Оценка пролиферации
Органотипические культуры представляют собой отдельную и интересную модель для исследований. Сохраняя целостность части органа или ткани, эта модель позволяет получать наиболее близкие к целому организму эффекты воздействий. Поскольку субгранулярная зона зубчатой извилины гиппокампальной формации является одним из основных нейрогенных зон мозга, в наших экспериментах мы использовали органотипические культуры гиппокампа мышей (эксперимент №2).
При добавлении инибитора активности Bcl-2 HA-14-1 мы не наблюдали значительной гибели клеток, более того, через три недели инкубации в культуре достоверно повышался уровень фосфо-гистона Н3 (рис. 27А, Б), что свидетельствует об активации клеточной пролиферации. Помимо хорошо известного маркера НСК нестина (Wiese et al., 2004) в этих клетках также экспрессируется Oct3/4 (Okuda et al., 2004), который первоначально был охарактеризован как маркер эмбриональных стволовых клеток (Pesce and Scholer, 2000). В наших экспериментах мы показали, что длительное ингибирование Bcl-2 стимулирует экспрессию Oct3/4 в органотипической культуре гиппокампа мышей (рис. 27В), что подтверждает увеличение количества самообновляющихся НСК или, другими словами, вызывает активацию пролиферативных процессов. Подтверждение активации пролиферации мы также наблюдали через 3 недели инкубации, когда при добавлении НА14-1 было отмечено образование нейросфер, клетки которых позитивно окрашивались на нестин (рис. 27Г). Образование нейросфер также свидетельствует о том, что делящиеся НСК не выходят в дифференцировку.
С другой стороны, культура изолированных НСК позволяет более точно определить механизмы влияния различных веществ, что при сравнении с органотипическими культурами и условиями in vivo, позволяет оценить комплексные эффекты взаимодействия сигнальных путей. Следует отметить, что при помещении НСК в дифференцировочную среду, не содержащую факторов роста, клетки некоторое время продолжают пролиферировать и образовывать нейросферы. Мы провели оценку количества формирующихся нейросфер при ингибировании Bcl-2. В культуре НСК (эксперимент №3) через неделю инкубации с НА14-1 значительно повысилось число прикрепленных и свободно плавающих нейросфер по сравнению с контрольной группой (рис. 28А-Д).
При этом уровень экспрессии Oct3/4 в культурах НСК при ингибировании Bcl-2 также был повышен (рис. 28Е). Таким образом, и в случае органотипической культуры и в изолированных НСК мы наблюдали стимуляцию пролиферации в условиях ингибирования активности Bcl-2, что свидетельствует об анти-пролиферативной роли Bcl-2.
Оценка дифференцировки Также мы оценили направленность и уровень дифференцировки НСК при ингибировании активности Bcl-2. В органотипической культуре (эксперимент №2) мы оценили уровни экспрессии белков, участвующих в дифференцировке НСК (CRMP-2 и GFAP) после недельной и трехнедельной инкубации. Полученные данные показали, что после первой недели инкубации в группе с добавлением HA14-1 уровень белка CRMP-2, участвующего в росте аксонов в процессе нейрональной дифференцировки (Gu and Ihara, 2000a), в экспериментальной группе был ниже, чем в контрольной (рис. 29А). С другой стороны, при введении HA14-1 через 3 недели ингибирования Bcl-2 наблюдалось повышение экспрессии GFAP (рис. 29Б).
GFAP является белком-маркером астроцитов, а с другой стороны активно экспрессируется в НСК, и повышение его экспрессии может свидетельствовать как о повышении глиогенеза, так и об активной пролиферации.
В культуре изолированных НСК (эксперимент №3) мы также наблюдали снижение экспрессии CRMP-2 (рис. 30А) и количества дифференцированных MAP2-позитивных нейронов при добавлении НА14-1 (рис. 30Б, В).
Анализ ERK зависимого сигнального каскада
Поскольку одним из основных сигнальных каскадов, регулирующих нейрональную дифференцировку, является ERK1/2-зависимый сигнальный каскад, мы проанализировали активность членов этого каскада на фоне различной активности р53. При этом для проверки специфичности влияния р53 на ERK-зависимый каскад эксперименты были проведены на различных моделях, включающих не только НСК зубчатой извилины, но и другие отделы мозга, в частности, гипоталамус, а также клетки РС12.
Мы показали, что при ингибировании р53 in vivo введением Pifithrin-alfa непосредственно в гипоталамус (эксперимент №6) в клетках СОЯ гипоталамуса наблюдалось достоверное снижение фосфо-MEK1/2 иммуннореактивности (рис. 46А-В), что свидетельствует об ингибировании ERK1/2 киназ, являющихся единственной мишенью активации для MEK1/2.
При внутрибрюшинном введении Pifithrin-alfa (эксперимент №7) результаты показали повышение уровня неактивной формы Raf1, о чем свидетельствует увеличение фосфорилирования Raf1 по Ser259 (рис.46Г) и значительное снижение экспрессии фосфо-ERK1/2 (рис. 46Д), что в результате подтверждает ингибирующее влияние Pifithrin-alfa на активность ERK каскада. При этом в обоих экспериментах активность транскрипционного фактора CREB не изменялась (данные не представлены).
В экспериментах in vitro (эксперимент №8) при кратковременной инактивации р53 в клетках СОЯ переживающих срезов гипоталамуса мы также наблюдали снижение как ERK1/2 иммунореактивности (рис. 47А-В), так и количества ERK1/2 позитивных клеток (рис. 47Г), что в этом случае привело к инактивации транскрипционного фактора CREB (рис. 47Е). Полученные данные указывают на то, что р53 оказывает активирующее влияние на ERK-зависимый сигнальный каскад.
В экспериментах на органотипической культуре гиппокампа мы оценивали влияние как ингибирования р53 (введение Pifithrin-alfa), так и его активации (введение Tenovin). Методом Вестерн блот анализа была проведена оценка уровня фосфорилирования Raf1 по Ser259, что характеризует уровень ингибирования активности этой киназы, а также был определен уровень фосфорилирования ERK1/2, для оценки активности этих киназ. Результаты показали, что после одной и трех недель инкубации с добавлением Pifithrin alfa уровень фосфо-Raf1 не изменялся (рис. 48А). При этом уровень активности ERK1/2 снизился через три недели ингибирования р53 (рис. 48Б).
Активация р53 введением Tenovin, напротив, привела к снижению активности Raf1, что выражалось в повышении его фосфорилирования по Ser259 (рис. 48А). Как результат, это привело к снижению фосфорилирования ERK1/2 (рис. 48Б).
На первый взгляд эти данные не согласуются с результатами наших экспериментов, описанных выше. Однако это противоречие может быть связано с выбранной нами моделью исследования. В данном случае мы рассматривали длительное (три недели) влияния ингибирования р53 и отставленное воздействие кратковременной активации р53.
Также мы провели оценку активности ERK1/2 в экспериментах на культуре НСК гиппокампа мышей (эксперимент № 1). Данные этого исследования свидетельствуют не только об активации нейрональной дифференцировки НСК при активации белка р53 введением Nutlin-3 (рис. 37), но также анализ показал повышение активности ERK1/2 киназы (рис. 49А) и уровня фосфорилирования CREB (рис. 49Б). Интересно отметить, что неактивная форма GSK3B, как результат введения блокатора TCS2002, не оказывала влияние на активность ERK1/2, но активировала транскрипционный фактор CREB (рис. 49Б), что подтверждают данные литературы.
Для исследования прямого эффекта р53 на ERK-зависимый сигнальный каскад в экспериментах на клетках линии РС12 мы оценили влияние активации р53 введением Nutlin-3. Эксперименты были проведены на недифференцированых клетках (эксперимент №3). Под влиянием Nutlin-3 и сочетанного введения Nutlin-3 и U0126 мы наблюдали повышение уровня экспрессии р53 (рис. 50А), а также при введении только Nutlin-3 значительное увеличение уровня фосфорилирования р53 по Ser315 (рис.50Б), что свидетельствует о повышении активности р53, связанной с регуляцией нейрональной дифференцировки (рис. 40).
При повышении активности p53 при введении Nutlin-3 происходило значительное увеличение уровня активности cRaf1, о чем свидетельствует достоверное повышение уровня его фосфорилирования по Ser338 (рис. 51А). При этом активность ERK1/2 и CREB также значительно повышалась (рис. 51Б, В), что сопровождалось активацией дифференцировки (рис. 40). Основной целью этого эксперимента было определение потенциальной мишени влияния р53 на ERK-зависимый каскад, т.е. на каком уровне, выше или ниже MEK1/2 киназ, р53 оказывает свое воздействие. В связи с этим мы ингибировали активность ERK1/2 киназ на фоне активации р53. Результаты показали, что в группе с сочетанным введением U0126 и Nutlin-3, так же как и при введении одного Nutlin-3, наблюдалось повышенная экспрессия фосфо-cRaf1 (рис. 51А).
При этом активация p53 при одновременном ингибировании ERK1/2 не оказывала влияния на активность ERK1/2 (рис. 51Б). Полученные данные напрямую свидетельствуют о том, что р53 регулирует активность ERК-зависимого каскада на уровне или выше Raf1. Мы также проанализировали активность одной из мишеней ERK-сигнального каскада транскрипционного фактора CREB (Cammarota et al., 2000). Наши данные показали, что экспрессия фосфо-CREB и, соответственно его активность, значительно повышается в ответ на активирование p53 Nutlin-3 (рис. 51В). При этом ингибирование активности ERK1/2 блокировало активацию CREB (рис. 51В).
Полученные нами данные показали, что активация р53 приводит к повышению активности CREB, которое, по всей видимости, является результатом активирования cRaf и ERK1/2, и что р53 регулирует активность Raf/ERK/CREB сигнального каскада на уровне или выше Raf1.
Анализ результатов поведенческих тестов
Животных проверяли каждый день на наличие патологического груминга после инъекций QUIS. Результаты показали, что у животных, получавших инъекции стволовых клеток (n=28), патологический груминг не развивался, в то время как 18 из 30 контрольных мышей (инъекции среды) демонстрировали патологический груминг начиная с 8 дня после введения QUIS (табл. 6).
Патологический груминг характеризовался полным вычесыванием шерсти до образования повреждений и локализовался на ипсилатеральной стороне (рис. 60).
Повреждения соответствовали или были каудальнее зоны введения QUIS (T13-L2). Все эпизоды груминга соответствовали классу 2-3 повреждения (табл. 6). У контрольных животных патологический груминг сохранялся до 7 недель. Отсутствие патологического груминга у животных, получавших стволовые клетки, свидетельствует о позитивном и нейропротекторном эффекте введения стволовых клеток.
Ацетоновый тест
Результаты показали, что интактные животные не отвечали на предъявление стимула. После введения QUIS все мыши продемонстрировали высокий уровень ответов (р 0.001) по сравнению с интактными мышами (рис. 61). После трансплантации стволовых клеток количество ответов значительно понизилось уже на первый день после введения (рис. 61) и продолжало снижаться до возвращения к контрольным значениям к 12 дню (рис. 61). В группе мышей, получавших только инкубационную среду, количество ответов сохранялось высоким вплоть до окончания эксперимента (56 дней) (рис. 61).
Фон Фрай тест
После инъекций QUIS и последующем введении инкубационной среды или ЭСК в первые дни животные отвечали повышенной чувствительностью на предъявление механического раздражения (рис. 62А, Б). При этом сила воздействия (размер филамента) была гораздо ниже для этих животных, по сравнению с интактными. Через 12 дней после введения стволовых клеток чувствительность ипсилатеральной передней лапы возвращалась к контрольным значениям (рис. 62А). Чувствительность конралатеральной лапы у животных с трансплантацией ЭСК возвращалась к контрольным значения уже на 6-й день (рис. 62Б). У контрольных мышей, получавших инъекции инкубационной среды, чувствительность не восстанавливалась до 56-го дня наблюдений (рис. 62).
Формалиновый тест
Инъекции формалина привели к двухфазному ответу на раздражение. Первая фаза начиналась непосредственно после введения с пиком через 5 минут. Вторая фаза характеризовалась пиком через 20-40 мин и продолжалась до 50 мин. Через 7 дней после введений среды (контроль) или стволовых клеток процент ответов у животных был выше, чем у интактных мышей (рис. 63А).
Через 14 дней после инъекций инкубационной среды число ответов сохранялась высоким (рис. 63Б) и оставалось таким до 60 дня (рис. 63В). У животных, получавших стволовые клетки, через 14 дней количество ответов было уже схожим с интактными мышами (рис. 63В), а на 60-й день животные с трансплантацией ЭСК не отличались по показателям от интактных (рис. 63В).