Введение к работе
Актуальность проблемы
Молликугы (микоплазмы) - наименьшие из известных микроорганизмов, способных к самостоятельному делению. Геном одного из представителей класса - Mycoplasma genitaJium -всего в несколько раз больше генома крупных вирусов и составляет 580070 п.о. Характерной и очень важной особенностью молликуг является их распространенность как паразитов многоклеточных организмов и видоспецифичность по отношению к макроорганизму-хозяииу, в котором, в основном, и происходит персистирование большинства видов микоплазм [Razin, S., 1985; Razin, S.,Yogev, D.F., Noat, Y., 1998; Dibvig, 1С, 1990; Dibvig, K., Voelker, L.L.,1996; Прозоровский СВ. с соавт., 1995].
Являясь «идеальными» паразитами, микоплазмы при некоторых состоятеях макрооргапизма способны вызывать значительные патологические изменения воспалительного характера с формированием длительно персистируюгдей инфекции, нередко осложненной выраженными аутоиммунными расстройствами [Furr, P.M.,Taylor-Robinson, D.,1987, 1997]. Известны эпидемические вспышки воспалительных инфекционных заболеваний, обусловленных микоплазмами, у сельскохозяйственных животных, птиц, растений, а также у человека [Bove J.M., 1993]. Примером такого рода заболеваний у человека является так называемый «синдром Персидской войны», поразивший контингент американских войск во время недавней войны в Заливе и побудивший дискуссию об использовании микоплазм в качестве бактериологического оружия [Чернова О.А.,1999]. Следует подчеркнуть, что в клинике заболеваний человека наибольшую опасность представляют микоплазмозы с преимущественной локализацией в урогенитальном и респираторном трактах, характеризующиеся хроническим течением и аутоиммунными осложнениями. M.hominis и U.urealyticum, колонизируя слизистые поверхности
урогенитального тракта, ассоциированы с развитием сальпингитов, простатитов, уретритов, кольпитов, циститов и др. [Goulet, М. et al., 1995; Horowitz, S. et al, 1995; Marschall, A.J. et al., 1995, Lo,S.C.etaL, 1993].
Применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия для лечения микоплазмозов приводит к возрастанию уровіш резистентности сопутствующей микрофлоры и длительному перснстированию микоплазм с развитием всевозможных осложнений [Cummngs, J. etal., 1990].
К настоящему времени в медицинской и научной литературе накоплен противоречивый материал об индивидуальной устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам. С одной стороны, группы препаратов тетрациклинового, фторхинолонового ряда и макролиды в опытах in vitro оказывают выраженное ингибирующее действие на клетки молликут, культивируемые на искусственных питательных средах, с другой — применение этих антибактериальных агентов в условиях персистенции микоплазм в организме-хозяине часто оказывается малоэффективным [Kenny, G.E. et al., 1994; Beber, С, 1997]. Кроме того, показано, что микоплазмы в ходе культивирования на искусственных питательных средах быстро приобретают резистентность к различным антибактериальным агентам. Этот факт связывают с наличием высокой нестабильности генома вследствие частых событий реорганизации хромосомы по типу «вышепление-встраивание». Такие противоречивые экспериментальные и медицинские данные четко обозначают одно из приоритетных направлений исследований микоплазм - изучение фундаментальных, эпидемиологических и медицинских аспектов резистентности молликут к применяемым антибактериальным агентам.
Современный методический арсенал позволяет вынести на первый план исследования этой проблемы вопросы, связанные с механизмами формирования резистентности. Решение этих
задач приведет к покимапию интегральных биохимических особенностей молликут, предопределяющих их повышенную метаболическую пластичность, приспособляемость и толерантность к факторам защиты организма-хозяина. Следует отметить, что выявление возможных изменений в геноме микоплазм под действием антибактериальных препаратов имеет не только фундаментальное значение. Речь идет и о более важных с точки зрения современной теоретической медицины фактах, которые могут быть положены в основу новых подходов по применению антибиотиков при лечении инфекций, обусловленных микроорганизмами с мембранной и внутриклеточной локализацией, к числу которых, безусловно, относятся и микоплазмы.
В настоящее время для лечения микоплазм енной инфекции используются синтетические препараты, действующие яа широкий спектр микроорганизмов. Дозы препаратов и их длительное применение для воздействия на молликуты приводят к развитию побочны> эффектов, к числу которых необходимо прежде всего отнести системный и местный дисбиоз.
Одним из эффективных направлений борьбы с внутриклеточными бактериальным! агентами и вирусами является создание генно-инженерных конструкций с так называемым? «суицидными» генами, селективно экспрессируемыми либо в инфицированных клетка? организма-хозяина, либо в самом инфекционном бактериальном агенте с последующим егс разрушением и эффективным представлением антигенов иммунной системе. В последнее времі изучается возможность применения ДНК-вакцин, позволяющих экспрессировать антигены і клетках макрорганизма. Уже появились первые сообщения о создании ДНК-вакцин протиі микоплазм-паразитов сельскохозяйственных животных. Однако, вследствие высоко! гетерогенности и изменчивости антигенных структур молликут необходимой и актуальної является разработка методов генной шгженерии и генотерапии, способных проводит!
селективную элиминацию микоплазм из организма-хозяина с одновременным увеличением иммунного ответа на существующие в данный момент варианты антигенных структур. Для решения этих проблем целесообразно использование генов амфифильных пептидов, обладающих выраженной гемолитической и бактерицидной активностью. Применение высокоочищенных препаратов этого ряда в практике ограничено вследствие их высокой гемолитической и токсической активности для человека и животных и низкой селективности. Контролируемая направленная экспрессия таких пептидов в клетках-мишенях, напротив, может оказаться эффективным инструментом для лечения и защиты макроорганизма от микоплазм и хламидин. Первые работы в этой области уже появились.
Подвода итог вышесказанному, можно сделать вывод, что изучение основных механизмов формирования резистентности микоплазм к антибактериальным агентам, применяемым для их эрадинации из организма, и поиск принципиально новых подходов к лечению микоплаз/иозов и других инфекционных заболеваний, вызванных внутриклеточным персистированисм микроорганизма в клетках хозяина, являются актуальными задачами, подразумевающими фундаментальные и медицинские аспекты исследования.
Целью данной работы являлось комплексное изучение основных закономерностей формирования резистентности к тетрациклинам и фторхинолонам у урогенитальных микоплазм (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum) я Acholeplasma laidlawii и разработка теоретических основ применения рекомбинантных генов амфипатических пептидов для возможной генотералии микоплазмозов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Провести клонирование и структурный анализ геяов AJaidlawii РО-8В (gyrA, gyrB, parC, рагЕ), продукты которых являются потенциальными мишенями для действия антибактериальных препаратов.
-
Получить в лабораторных условиях серию лабораторных мутантов M.hominis, A.laildawii, U.urealyticum, устойчивых к действию препаратов фторхиноло нового и тетрациклинового ряда.
-
Определить мутации в QRDR генов gyrA, gyrB, parC и рагЕ в клетках микоплазм.
-
Выявить закономерности формирования резистентности к фторхинолонам и тетрацик-линам у микоплазм, происходящего на уровне транспортных мембранных систем, и определить основные биохимические характеристики, обуславливающие образование устойчивых клеток в ходе применения антибактериальных агентов в условиях лабораторного культивирования.
-
Выявить закономерности переноса детерминанты устойчивости к тетрациклину tetM из микроорганизмов биоценоза влагалища в клетки урогениталышх микоплазм.
-
Охарактеризовать генетические вариации структуры гена tetM (мозаичность) у микоплазм.
-
Продемонстрировать принципиальную возможность использования рекомбинантных плазмид, содержащих экспрессирующую ген меллитина конструкцию, для подавления развития молликут в культуре клеток линии 293, HeLa, а также при культивировании микоплазм в лабораторных условиях.
Научная новизна работы
На момент начала выполнения работы наши представления о механизмах формирования устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам ограничивались микробиологической характеристикой отдельных резистентных клинических изолятов и скринингом
антибактериальных препаратов нового поколения in vitro. Исследуя молекулярные события, происходящие на уровне генов-мишеней для действия фторхинолонов и тетрациклинов, впервые удалось установить, что микоплазмы, несмотря на ограниченную информационную емкость генома, обладают выраженным адаптационным потенциалом, обеспечивающим развитие устойчивости к антибактериальным агентам на популяционнсж уровне. Так было установлено, что первым этапом адаптации микоплазм к использованным в работе антибактериальным агентам является ограничение накопления препарата вследствии увеличения микровязкости плазматической мембраны и встраивания экзогенных стеролов. При дальнейшем культивировании с повышающимися концентрациями антибиотиков происходит формирование мутаций в генах-мишенях, кодирующих топоизомеразу IV и ДНК-гиразу, либо захват конъюгативного транспозона Тп91б, содержащего tetiA детерминанту, который, вероятно, осуществляется при помощи эукариотической клетки. На основании обширных клинических пролонгированных наблюдений за пациентами, инфицированными микоплазмами и уреаплазмами, и изучения феноменологии формирования устойчивости к Тс и ФХ в условиях лабораторного культивирования сделан вывод о низкой эффективности используемых препаратов и принципиальной необходимости поиска путей альтернативного лечепия микоплазмозов. В заключительной части работы при использовании рекомбинантных плазмид, содержащих ген амфипатического линейного пептида - меллитина, обладающего выраженной бактерицидной активностью, под контролем регулируемых промоторов, впервые продемонстрирована возможность удаления микоплазм как из инфицированных клеточных линий, так и из молликут, выращенных на жидкой питательной среде.
Практическая ценность полученных результатов
С целью эффективного мониторинга за микоплазмешюй инфекцией и сопутствующими инфекционными агентами в клинике разработаны, утверждены и внедрены в практику отечественного здравоохранения наборы реагентов для выявления микоплазм, уреаплазм, хламидии, вирусов герпес-группы, трихомонад, гарднерелл с использованием метода полнмеразной цепной реакции ТУ-9398-405-17253567-96, ТУ-9398-410-17253567-97, ТУ-9398-408-17253567-97, ТУ-9398-409-17253567-97. Предложены методы быстрой идентификации устойчивости микоплазм к фторхннолонам и тетрациклинам. Разработаны методы идентификации биоваров и сероваров уреаплазм в клинических образцах, а также эффективные методы определения генетической вариабельности клинических изолятов микоплазм с использованием амплификации со случайными праймерами. Предложен новый метод трансформации клеток M.hominis электропорацией плазмидой рЛМ120, содержащей ген tetM. Основные положения, выносимые на защиту
-
Лабораторные штаммы A.laidlawi, M.hominis, U.urealyticwn обладают закономерной способностью к формированию устойчивых к фторхинолонам и тетрациклинам мутантов при постепенном повышении концентрации антибактериальных агентов в среде культивирования.
-
Формирование устойчивости к фторхинолонам у микоплазм и ахолеплазм сопровождается появлением мутаций в генах топоизомераз II типа, причем первичной мишенью для мутагенеза является топоизомераза IV, а уже затем мутации обнаруживаются в QRDR ДНК-гиразы.
-
Изменениям в QRDR генов топоизомераз предшествуют метаболические перестройки плазматической мембраны, заключающиеся в накоплении стеролов, увеличении
микровязкости, а у ахолеплазм и в ингибировании синтеза каротшюидных пигментов. Эти изменения приводят к ограничению накопления антибактериальных агентов. При этом скорости активного выхода антибактериальных препаратов (эффлюкса) из клеток лабораторных штаммов ахолеплазм, микоплазм и мутантов не отличаются.
-
Обнаруженные в ходе клинической части исследования гены устойчивости к тетрациклинам ШЪЛ у микоплазм и уреаплазм обладают уникальной аллельной микрогетерогенностью (мозаичностью) по сравнению с описанными ранее другими генами этого семейства. Лабораторные эксперименты с переносом гена устойчивости к тетрациклину tetM в клетки микоплазм в присутствии эукариотических клеток указывают на возможность горизонтального переноса с участием клетки-хозяина.
-
Высокий уровень устойчивости к тетрациклинам у клинических изолятов микоплазм и уреаплазм связан с переносом tetM детерминанты и реализацией метаболических неспецифических механизмов устойчивости к тетрациклинам и фторхинолонам, обусловленных взаимодействием клетки-хозяина и микоплазмы.
-
Использование рекомбинантных плазмид, содержащих ген меллитина, для селективной экспрессии в микоплазмах и для регулируемой экспрессии в эукариотических клетках, инфицированных микоплазмами, приводит к эффективному удалению молликутов.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на итоговых конференциях НИИ ФХМ (1996, 1997, 1998, 1999 гг.), на 1-й, 2-й, 3-й Всероссийских научно-практических конференциях "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" (1996,1998, 2000 гг.) в г.Сочи и Москве, на IV Международной конференции
IT+ME'98 (май-июнь 1998г.) в г. Гурзуфе, на международном конгрессе по резистентности к антимикробным препаратам в Монте-Карло (октябрь 1999т.), на межлабораторном семинаре НИИ ФХМ, на международном симпозиуме «гены-кандидаты здоровья животных» в Ростоке (август 1999г.)
Публикации По материалам диссертации опубликовано 40 работ.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 300 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы исследования, результаты, их обсуждение и выводы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 50 рисунками; библиографический указатель включает 525 публикаций.