Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Классификация хантавирусов 12
1.2 Биохимические и физиологические особенности хантавирусной инфекции 13
1.3 Эпидемиология хантавирусов 16
1.4 Молекулярная организация генома хантавирусов 18
1.5 Жизненный цикл хантавирусов 20
1.6 Репликация и транскрипция хантавирусов 21
1.7 Хантавирусные белки
1.7.1 Нуклеокапсидный белок 23
1.7.2 Гликопротеины 29
1.7.3 РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) 32
1.8 Rab белки 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1 Методы создания рекомбинантных генетических конструкций, кодирующих кДНК
генов нуклеокапсидных белков хантавирусов 37
2.1.1. Реакция BP-рекомбинации для клонирования кДНК нуклеокапсида хантавирусов в плазмидный вектор pDONR221 37
2.1.1.2 Реакция LR-рекомбинации 38
2.1.2 ПЦР-скрининг колоний 39
2.1.4 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК) 40
2.1.5 Определение первичной нуклеотидной последовательности ДНК 40
2.1.6 Методы работы с прокариотическими клетками 41
2.1.6.1 Трансформация бактериальных клеток 41
2.2 Методы работы с эукариотическими клетками 42
2.2.1 Создание рекомбинантных лентивирусов 43
2.2.2 Определение вирусного титра 44
2.3 Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки (трансфекция и вирусная трансдукция) 45
2.3.1 Перенос нуклеиновых кислот в культуру клеток с помощью реагента TurboFect (трансфекция) 45
2.3.2 Трансдукция клеток A549 рекомбинантными лентивирусами 46
2.4 Методы анализа синтеза рекомбинантных белков in vitro 47
2.4.1. Иммунoфлуоресцентный анализ 47
2.4.2. Анализ синтеза белков методом иммуноблотинга 48
2.4.3 Исследование биосинтеза цитокинов и хемокинов по технологии xMAP Luminex 50
2.5 Методы исследования экспрессии генов 50
2.5.1 Выделение тотальной РНК из культур клетoк 50
2.5.2 Pеакция oбpатнoй тpанскpипции 51
2.5.3 Количественная оценка транскрипции мРНК генов с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени 51
ГЛАВА 3. Результаты исследований 54
3.1 Создание плазмидных лентивирусных конструкций, кодирующих кДНК генов нуклеокапсидных белков хантавирусов 54
3.2 Получение рекомбинантных лентивирусов, экспрессирующих нуклеокапсидные белки хантавирусов 57
3.3 Исследование внутриклеточного транспорта нуклеокапсидных белков хантавирусов 60
3.4 Активация противовирусных механизмов при хантавирусных инфекциях 85
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 91
Выводы 99
Список использованной литературы 100
- Эпидемиология хантавирусов
- Реакция BP-рекомбинации для клонирования кДНК нуклеокапсида хантавирусов в плазмидный вектор pDONR221
- Перенос нуклеиновых кислот в культуру клеток с помощью реагента TurboFect (трансфекция)
- Получение рекомбинантных лентивирусов, экспрессирующих нуклеокапсидные белки хантавирусов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Расшифровка молекулярных механизмов
патогенеза вирусных заболеваний является ключевым шагом к разработке новых методов терапии инфекционных заболеваний, в том числе вирусных геморрагических лихорадок (ВГЛ), вызываемых хантавирусами. Несмотря на значительный прогресс в области исследования биологии ВГЛ, механизмы активации противовирусного ответа в ответ на вирусную инфекцию и особенности внутриклеточного транспорта белков хантавирусов остаются недостаточно исследованными.
Хантавирусы относятся к семейству буньявирусов (лат. Bunyaviridae), которые обнаруживаются, в основном, у мышевидных грызунов. Человек может заразиться хантавирусом при контакте с инфицированной мочой, слюной и фекальной массой грызунов (Jonsson et al., 2010), что может впоследствии привести к развитию различных геморрагических лихорадок, сопровождающихся значительными изменениями в биохимических процессах, протекающих в организме, и реологическими свойствами крови. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) является наиболее распространенной из хантавирусных инфекций в России. Республика Татарстан лидирует по заболеваемости ГЛПС, так как случаи заболеваемости повысились в 7 раз по сравнению с аналогичным периодом в 2014 году (Роспотребнадзор, 2015). Смертность при ГЛПС и хантавирусномм легочным синдроме (ХЛС) варьирует между 0,3–10% и 30–40%, соответственно (Jonsson et al., 2010; Macneil et al., 2011; Krautkramer et al., 2013).
Хантавирусы, в основном, поражают эндотелиальные клетки, и как многие другие вирусы, после проникновения в клетку используют внутриклеточные механизмы для собственной репликации. В число таких механизмов входит использование внутриклеточных органелл, например, эндосом. Эндосомы участвуют в проникновении, репликации и выходе вируса из клетки (Townsley et al., 2006; Manna et al., 2010;Engel et al., 2011). Использование вирусом механизмов внутриклеточного транспорта может привести к нарушению биохимических процессов, происходящих в инфицированной клетке. Несмотря на интенсивные исследования, внутриклеточные механизмы при хантавирусных инфекциях недостаточно изучены. Это является одной из причин, почему на сегодняшний день нет эффективных методов лечения хантавирусных инфекий, а терапия сводится, в основном, к устранению симптомов заболевания и не подавляет репликацию вируса. Симптоматическая терапия имеет ограниченную эффективность и не предотвращает патологическое действие цитокинов (Bi et al., 2008; Jonsson et al., 2008). Исследование внутриклеточных механизмов, используемых хантавирусами, позволит разработать новые подходы к терапии хантавирусных инфекций.
Таким образом, актуальность проблемы состоит в высокой встречаемости и отсутствии эффективных терапевтических подходов к лечению хантавирусных инфекций.
Цель работы — анализ механизмов внутриклеточного транспорта нуклеокапсидных белков хантавирусов и активации противовирусного ответа in vitro.
Для достижения цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Создать плазмидные лентивирусные конструкции, кодирующие кДНК генов
нуклеокапсидных белков хантавирусов Хантаан (HTV), Син Номбре (SNV) и
Проспект Хилл (PHV) и получить рекомбинантные лентивирусы, кодирующие
нуклеокапсидные белки хантавирусов.
2. Провести анализ синтеза и внутриклеточной локализации рекомбинантных нуклеокапсидных белков хантавирусов in vitro.
3. Исследовать влияние биосинтеза мутантных нефункциональных форм белков
эндосом на внутриклеточный транспорт нуклеокапсидных белков хантавирусов.
4. Провести анализ активации цитокинов и хемокинов в ответ на синтез
рекомбинантных нуклеокапсидных белков хантавирусов.
Научная новизна. В настоящей работе описан внутриклеточный механизм хантавирусных инфекций. Было впервые показано, что нуклеокапсидные белки хантавирусов Хантаан (HTV), Син Номбре (SNV) и Проспект Хилл (PHV) ко-локализуются с белками ранних, поздних и рециркулирующих эндосом. Впервые показано, что белки ранних и рециркулирующих эндосом играют большую роль в патогенезе хантавирусной инфекции. Это заключение основано на полученных нами данных, которые впервые показали, что биосинтез мутантных доминантно-негативных нефункциональных форм белков ранних (Rab5) и рециркулирующих (Rab11) эндосом, блокирующих эндосомальный транспорт, приводит к снижению внутриклеточного уровня нуклеокапсидных белков хантавирусов. Нуклеокапсидный белок хантавирусов синтезируется сразу в большом количестве после инфекции по сравнению с другими белками хантавирусов. В связи с этим, выявление нуклеокапсидного белка является ранним серологическим маркером при диагностике хантавирусной инфекции (Vapalahti et al., 1995). Несомненной новизной обладают данные о том, что блокирование эндосомального транспорта в результате биосинтеза мутантных форм белков ранних и рециркулирующих эндосом (Rab 5 и Rab 9 11) также приводит к снижению уровня транскрипции мРНК генов CCL5 (Rantes) и CXCL10 (IP10), а также к снижению биосинтеза соответствующих белков.
Научно-практическая значимость работы. На сегодняшний день отсутствуют эффективные препараты для лечения и профилактики хантавирусных заболеваний. Причина состоит в том, что патогенез хантавирусных инфекций недостаточно изучен. Наши исследования расширяют понятие о внутриклеточном транспорте нуклеокапсидных белков хантавирусов и механизмах активации противовирусного ответа при хантавирусной инфекции. Полученные нами данные могут быть использованы в разработке терапевтических препаратов для лечения и предупреждения заболеваний, вызванных хантавирусами, путем блокирования биосинтеза белков ранних и рециркулирующих эндосом в клетке. Описанные нами внутриклеточные механизмы при хантавирусных инфекциях представляют интерес для понимания взаимодействий и связей между основными белками ранних (Rab5) и рециркулируюших эндосом (Rab11), и нуклеокапсидным белком хантавирусов. Таким образом, полученные данные не только представляют интерес с практической
точки зрения, так как открывают новые стратегии и подходы для создания терапевтических препаратов, но и с фундаментальной точки зрения, обогащая наши знания о биохимических процессах, лежащих в основе внутриклеточных механизмов хантавирусных инфекций.
Положения, выносимые на защиту:
1. Нуклеокапсидные белки хантавирусов Хантаан (HTV), Син Номбре (SNV) и Проспект Хилл (PHV) при экспрессии с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов локализуются в ранних, поздних и рециркулирующих эндосомах.
-
Биосинтез мутантных доминантно-негативных нефункциональных форм белков ранних (Rab5) и рециркулирующих эндосом (Rab11), блокирующих эндосомальный транспорт, приводит к снижению накопления нуклеокапсидных белков хантавирусов в ранних и рециркулирующих эндосомах соотвественно.
-
Биосинтез нуклеокапсидных белков хантавирусов в клетках А549 приводит к повышению уровня провоспалительных цитокинов и уровня мРНК генов CCL5 и CXCL10. Снижение внутриклеточного содержания нуклеокапсидных белков в результате нарушения эндосомального транспорта мутантными доминантно-негативными нефункциональными формами белков ранних (Rab5) и рециркулирующих эндосом (Rab11) приводит к снижению уровня провоспалительных цитокинов и уровня мРНК генов CCL5 и CXCL10.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на международных научно-практических конференциях: «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2014), «Актуальные вопросы образования и науки» (Тамбов, 2014), Всероссийскоая школа-конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2014), XIX международная Пущинская школа-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2015), XX международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2016), международная конференция «Трансляционная медицина» (Казань, 2016).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, среди которых 3 публикации в рецензируемых журналах, включенных в перечень ВАК, для защиты кандидатских и докторских диссертаций, и 7 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях и конгрессах.
Структура и объем диссертации. Данная диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, включает 38 рисунков, 12 таблиц и 158 источников.
Эпидемиология хантавирусов
Основными симптомами ГЛПС и ХЛС является увеличенная проницаемость капилляров. Репликация хантавируса происходит в эндотелии сосудов (Kim et al., 1993; Zaki et al., 1995) и, по всей видимости, не вызывает прямые цитопатические эффекты. В почках пациентов, страдающих эпидемической нефропатией (Temonen et al., 1996) и в эндотелиальных клетках легких пациентов с диагнозом ХЛС (Zaki et al., 1995) была обнаружена субпопуляция CD8+ Т-лимфоцитов совместно с моноцитами/макрофагами. Во время острой фазы ХЛС, в ответ на нуклеокапсидный белок, происходит интенсивная активация цитотоксических CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов (Ennis et al., 1997). Цитотоксические Т-клетки могут способствовать повреждению капилляров с помощью иммунопатологии, предположительно из-за повышения концентраций оксида азота и ФНО (фактора некроза опухолей) у пациентов с эпидемической нефропатией (Groeneveld et al., 1995;Linderholm et al., 1996). В ходе биопсии почек от больных с эпидемической нефропатией было выявлено острое тубулоинтерстициальное воспаление почек (нефрит) со средней степенью повреждения тканей клубочков (Mustonen et al., 1994). Увеличение выработки нескольких цитокинов и молекул эндотелиальной адгезии, главным образом, свойственно для перитубулярного нефрона (Temonen et al., 1996). Поражение почек при эпидемической нефропатии характеризуется значительным уменьшением уровня клубочковой фильтрации и плазменного потока почек. Увеличение клубочковой проницаемости связано с неизбирательной обширной протеинурией и, как следствие, возникновением трубчатой дисфункции и увеличения количества трубчатой протеинурии (Ala-Houhala et al., 2002;Vapalahti et al., 2003). На сегодняшний день неизвестна причина передачи хантавирусной инфекции от одного вида грызунов другому и предпочтительность поражения легких, а не почек (Linderholm et al., 1992;Kanerva et al., 1996). Специфические интегрины играют важную роль в фиксации хантавирусов на определенных клетках. Проникновение патогенных хантавирусов (SNV, HTNV, SEOV, PUU) зависит от бета-3 интегрина (рецептор витронектина и адгезии тромбоцитов), но это не касается проникновения предположительно апатогенного PHV и TULV (Gavrilovskaya et al., 1998). Более того, хантавирусы способны инфицировать незрелые дендритные клетки in vitro и стимулировать их созревание и выработку ФНО-, сохраняя способность активировать Т-клетки, которое предполагает, что инфицирование дендритных клеток может обеспечить перемещение и распространение хантавирусов от легких в лимфатические узлы и повсеместно по организму (Raftery et al., 2002;Vapalahti et al., 2003).
Хантавирусы вызывают две основные инфекции – хантавирусный кардиолегочный синдром (ХЛС) и геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС). ХЛС распространен в странах Северной и Южной Америки; ГЛПС, широко распространен на евразийском континенте, в том числе и на территории России (Слонова и Ткаченко, 2007; Zhang et al., 2010). Ежегодно фиксируется около 100 тыс. случаев ГЛПС в странах Европы и Азии. ГЛПС в России занимает по заболеваемости ведущее место среди зоонозов и одно из первых мест среди природно-очаговых болезней человека (Ткаченко и др., 2011). Ежегодно в РФ официально регистрируется в среднем 7500 случаев ГЛПС. Наибольшее количество заболевших ГЛПС было отмечено в 1997 г. (Госкомсанэпиднадзора, 1997-2009). Приволжский и Уральский федеральный округ лидируют по числу пациентов с диагнозом ГЛПС (Лещинская и др., 1990). На севере Европейской части России ГЛПС в основном вызывают хантавирусы Пуумала и Сааремаа, на юге страны – Добрава (Ткаченко и др., 2011). Несмотря на то, что в Сибири обнаружено шесть серотипов хантавирусов, только Пуумала и Добрава вызывают ГЛПС (Yashina et al., 2000). Хантаан, Амур и Сеул вызывают ГЛПС в Дальневосточном округе (Якименко и др., 2008).
ХЛС в основном вызывают хантавирусы Нового света—Андес и Син номбре. Существует класс хантавирусов, которые не являются патогенными. К ним относятся вирусы Проспект хилл и Тула (Plyusnin et al., 1994;Schmaljohn and Hjelle, 1997).
Природным резервуаром хантавирусов являются мышевидные грызуны. Инфекция у них протекает в латентной форме. Каждый серотип/генотип хантавирусов имеет единственного естественного хозяина. Грызуны выделяют хантавирусы во внешнюю среду через мочу, фекальные массы или слюну животных (Schmaljohn and Hjelle, 1997;Vaheri, 2008). Человек может заразиться при контакте с этими эксрементами. До настоящего времени не зарегистрировано заражение хантавирусами путем контакта здоровых людей с больными ГЛПС (Schmaljohn and Hjelle, 1997;Ткаченко и др., 2011).
В последнее десятилетия во всем мире ведутся интенсивные исследования относительно иммунопатогенеза ГЛПС, однако эти исследования, по большей части охватывают вирусы Пуумала, Син Номбре, Добрава (Markotic et al., 1999;Zaki and Nolty, 1999;Klingstrom et al., 2002;Kraus et al., 2004). Хантавирусы непосредственно влияют на иммунитет хозяина благодаря внутриклеточному паразитизму, преимущественно в клетках эндотелия сосудов, макрофагах и дендритных клетках без явного цитопатического эффекта (Перевертень и др., 2005; Алексеев и др., 1998; (Zaki and Nolty, 1999;Klingstrom et al., 2002;Kraus et al., 2004). Целенаправленное исследование при хантавирусных инфекциях придаётся клеточному иммунному ответу и его последующим эффекторным механизмам (цитокины, хемокины, оксид азота), повышенный выброс которых сопровождается увеличением капиллярной проницаемости. Все это являются основополагающими факторами при патогенезе ГЛПС (Markotic et al., 1999;Klingstrom et al., 2002).
Во время острой фазы протекания вирусной инфекции повышается уровень воспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-), а при тяжелом течении заболевания происходит полное угнетение синтеза ИФН- (Перевертень и др., 2005; Иванис и др., 2002; Ющук и др., 1999; Markotic et al., 1999).
Реакция BP-рекомбинации для клонирования кДНК нуклеокапсида хантавирусов в плазмидный вектор pDONR221
Плазмидную ДНК выделяли с использованием наборов GeneJET Plasmid Miniprep kit (Life technologies) и GeneJET Plasmid Midiprep kit (Life technologies) согласно инструкции производителя. Выделенную плазмидную ДНК хранили при -20С после измерения концентрации на спектрофотометре NanoDrop 2000с (Thermo scientific).
Секвенирование клонированных генов в плазмидной ДНК осуществлялось компанией «Синтол» с использованием вектор-специфичных праймеров (Таблица 10). Таблица 10 – Нуклеотидные последовательности праймеров, использованные для секвенирования Название праймера Нуклеотидная последовательность M13F (pDONR221) CCCAGTCACGACGTTGTAA M13R (pDONR221) CATGGTCATAGTCGTTTC CMV Forward (pLX303) (Invitrogen) CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG WPRE-R(pLX303) CATAGCGTAAAAGGAGCAACA
В процессе создания рекомбинантных конструкций и с целью последующей их очистки в препаративных количествах был использован бактериальный штамм Escherichia coli One Shot TOP10 (Invitrogen, США) с генотипом F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 araD139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG. Такой генотип обеспечивает высокую эффективность трансформации (около 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мкг ДНК). Культивировали Escherichia coli One Shot TOP10 на жидкой среде Лурия-Бертани (LS-LB) с пониженным содержанием солей (на 1 л): дрожжевой экстракт — 5 г, триптон — 10 г, NaCl — 5 г, pH 7,0; и твердой среде LS-LB-агар (на 1 л): дрожжевой экстракт — 5 г, триптон — 10 г, NaCl — 5 г, агара — 15 г, pH 7,0. Питательные среды были стерилизованы в автоклаве при 121С в течение 15 мин 1,2 атм. (1,02 кг/см2) в жидкостном или агарном режиме (LabTech, Korea).
Для доставки векторов в бактериальные клетки использовали стандартную методику кальциевой трансформации (Sambrook and Russell, 2001). С чашки Петри отбирали одиночную колонию E. coli TOP 10 и переносили ее в 5 мл среды LS-LB без антибиотика. Клетки инкубировали в течение 16–20 часов при 37C. 500 мкл ночной культуры переносили в колбу с 50 мл среды LS-LB без антибиотика и культивировали при 37C до достижения плотности OD600=2–3. После этого, суспензию клеток переносили в охлажденные 50 мл пробирки и инкубировали на льду в течение 10–15 мин. Для осаждения клеток, суспензию клеток центрифугировали в течение 10 мин при +4C, 4100g. После этого надосадочную жидкость удаляли и к клеткам добавляли охлажденный раствор MgCl2 (10 мM) -CaCl2 (5 мM), с последующим ресуспендированием и повторением цикла центрифугирования. Затем удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали клеточную биомассу в 1 мл охлажденного раствора 0,1 М CaCl2. Для каждого образца отбирали 50 мкл раствора компетентных клеток в охлажденные 1,5 мл пробирки и добавляли 1мкл продукта BP- или LR-рекомбинации, после чего инкубировали в течение 30 мин на льду. Далее смесь подвергали тепловому шоку в течение 30 сек при 42C на водяной бане. Сразу после этого пробирки с клетками инкубировали на льду в течение 2 мин 30 сек. По истечению времени инкубации добавляли 250 мкл среды LS-LB. Суспензию клеток инкубировали в термостате в течение одного часа при 37C при активном перемешивании (200 обр/мин). 100 мкл бактериальной культуры высевали на агаризованную селективную среду с антибиотиком. В зависимости от вектора использовали различные антибиотики. Для вектора pDONR221 использовали канамицин 50 мг/мл (Sigma), а для pLX303 использовали ампициллин 100 мг/мл (Биосинтез). Чашки инкубировали в термостате в течение 12–16 часов при 37C.
Для исследования экспрессии генов (созданных нами рекомбинантных конструкций) и оценки их биологическиой активности in vitro использовали трансформированные культуры клеток человека. Трансфекцию эукариотических клеток проводили с использованием химических методов. Для оценки эффективности трансфекции использовали конфокальную микроскопию и проточную цитометрию (Pollard and Walke, 1997;Hawley et al., 2004).
В работе были использованы следующие культуры: клетки эмбриональной почечной линии 293Т человека НЕК293Т (от англ. Human Embryonic Kidney Cell-line 293) (ATCC CRL-11268) и клетки карциномы легкого человека А459 (ATCC CCL-185).
Клетки НЕК293Т и A549 поддерживали на среде DMEM (от англ. Dulbecco s Modified Eagle Medium, Invitrogen), с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы (от англ. Fetal Bovine Serum, FBS) (Sigma), смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (100 ЕД/мл; 100 мкг/мл) (ПанЭко, Россия) и 2 мМ L-глутамина (Sigma).
Перенос нуклеиновых кислот в культуру клеток с помощью реагента TurboFect (трансфекция)
Внутриклеточная ко-локализация нуклеокапсидных белков хантавирусов и белка Rab11 рециркулирующих эндосом. Флуоресцентная конфокальная микроскопия. Синяя флуоресценция — DAPI (окрашивание ядер клеток). Зеленая флуоресценция — окрашивание первичными антителами к нуклеокапсидному белку N вируса ANDV и вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой Alexa488. Красная флуоресценция — DsRed-Rab11 (позволяет локализовать рециркулирующие эндосомы). А — ко-локализация нуклеокапсидного белка рекомбинантного лентивируса LV-HTV-S с белком Rab11 рециркулирующих эндосом. Б — ко-локализация нуклеокапсидного белка рекомбинантного лентивируса LV-SNV-S с белком Rab11 рециркулирующих эндосом. В — ко-локализация нуклеокапсидного белка рекомбинантного лентивируса LV-PHV-S с белком Rab11 рециркулирующих эндосом. Увеличение 63x. Шкала 20 мкм 3.3.2 Исследование роли белков Rab 5 (ранние эндосомы) и Rab11 (рециркулируюшие эндосомы) во внутриклеточном транспорте хантавирусов
Цель данного этапа работы состояла в исследовании роли белков Rab 5 (ранние эндосомы) и Rab11 (рециркулируюшие эндосомы) во внутриклеточном транспорте хантавирусов. В работе использовали плазмиды DsRed-Rab5 и DsRed-Rab11, кодирующие белки Rab5 и Rab11 для исследования ко-локализации нуклеокапсидных белков хантавирусов на ранних стадиях инфекции (3, 6 и 12 часов после инфекции LV-HTV-S, LV SNV-S или LV-PHV-S). На этом этапе также использовали плазмиды DsRed Rab5-DN и DsRed-Rab11-DN, кодирующие доминантно-негативную мутантную форму белков Rab5 и Rab11, и плазмиды DsRed-Rab5-WT и DsRed-Rab11-WT, кодирующие белки Rab5 и Rab11 дикого типа. Мутантная доминантно-негативная форма белков Rab5 и Rab11 приводит к блокированию процесса эндоцитоза на стадии ранних и рециркулируюших эндосом путем инактивации белков Rab5 и Rab11. Обе формы белков использовали для сравнения количества нуклеокапсидных белков, синтезирующихся с лен (LV-HTV-S, LV-SNV-S и LV-PHV-S).
Исследование внутриклеточной ко-локализации нуклеокапсидных белков, и белков Rab 5 (ранние эндосомы) и Rab11 (рецикулируюшие эндосомы)
Иммуногистохимическое окрашивание культуры клеток A549 после трансфекции плазмидами и трансдукции лентивирусами подтвердило ко-локализацию нуклеокапсидных всех белков, использованных нами рекомбинантных лентивирусов (LV-HTV-S, LV-SNV-S и LV-PHV-S) с белком Rab5 на всех ранних стадиях инфекции (Рисунок 18, Рисунок 20, Рисунок 22). Ко-локализация с белком Rab11 была заметна только на стадиях 12 часов после инфекции (рисунки 19, 21, 23). Иммуногистохимическое исследование культуры клеток A549 после трансфекции плазмидами и трансдукции лентивирусами также подтвердило ко-локализацию нуклеокапсидных белков всех использованных нами рекомбинантных лентивирусов (LV-HTV-S, LV-SNV-S и LV-PHV-S) с доминантно-негативной мутантной формой белка Rab5 (Рисунок 24) и Rab11 (Рисунок 25), и также с дикой формой белка Rab5 (Рисунок 26) и Rab11 (Рисунок 27). Визуализацию проводили на конфокальном микроскопе LSM 780 (Carl Zeiss, Германия). Рисунок 18 – Внутриклеточная ко-локализация нуклеокапсидного белка HTV и белка Rab5. Флуоресцентная конфокальная микроскопия. Синяя флуоресценция — DAPI. Зеленая флуоресценция — окрашивание первичными антителами к нуклеокапсидному белку N вируса ANDV и вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой Alexa488. Красная флуоресценция — DsRed-Rab5 (позволяет детектировать ранние эндосомы). А — ко локализация нуклеокапсидного белка рекомбинантного лентивируса LV- HTV-S с белком Rab5 ранних эндосом, 3 часа после инфекции. Б — ко-локализация нуклеокапсидного белка рекомбинантного лентивируса LV- HTV-S с белком Rab5 ранних эндосом, 6 часов после инфекции. В — ко-локализация нуклеокапсидного белка рекомбинантного лентивируса LV- HTV-S с белком Rab5 ранних эндосом 12 часов после инфекции. Увеличение 63x. Шкала 20 мкм. Рисунок 19 – Внутриклеточная ко-локализация нуклеокапсидного белка HTV и белка Rab11 на ранней стадии инфекции. Флуоресцентная конфокальная микроскопия. Синяя флуоресценция—DAPI. Зеленая флуоресценция— окрашивание первичными антителами к нуклеокапсидному белку N вируса ANDV и вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой Alexa488.
Красная флуоресценция—DsRed-Rab11 (позволяет детектировать рециркулируюшие эндосомы). А—ко-локализация нуклеокапсидного белка рекомбинантного лентивируса LV-HTV-S с белком Rab11, 3 часа после инфекции. Б—ко-локализация нуклеокапсидного белка рекомбинантного лентивируса LV-HTV-S с белком Rab11, 6 часов после инфекции. В—ко-локализация нуклеокапсидного белка рекомбинантного лентивируса LV-HTV-S с белком Rab11, 12 часов после инфекции. Увеличение 63x. Шкала 20 мкм.
Получение рекомбинантных лентивирусов, экспрессирующих нуклеокапсидные белки хантавирусов
Белок Rab5 играет важную роль в регуляции доставки биомолекул в ранние эндосомы (Nielsen et al., 1999;Pal et al., 2006). Хотя белки Rab7 и Rab9 относятся к поздним эдосомам, они имеют разные функции. Rab7 участвует в транспортировке биомакромолекул от поздних эндосом в лизосомы (Vanlandingham and Ceresa, 2009). Rab9 принимает участие в транспорте от поздних эндосом к аппарату Гольджи (Lombardi et al., 1993). Белок Rab11 играет роль в транспорте от аппарата Гольджи в плазматическую мембрану (Chen et al., 1998). В ходе наших исследований было показано, что нуклеокапсидные белки хантавирусов HTV, SNV и PHV имели совместную ко-локализацию с белками Rab5 ранних эндосом, Rab 7 и 9 поздних эндосом и Rab11 рециркулирующих эндосом. На сегодняшний день недостаточно литературных данных о связи эндосом с жизненным циклом хантавирусов. Известно, что вирус Uukuniemi (семейтсво Буньявирусы) использует белки Rab5 и Rab7 для проникновения в клетку (Lozach et al., 2010). В других исследованиях было показано, что нуклеокапсидный белок ANDV ко локализуется с белками Rab8 и Rab11 (Rowe et al., 2008). Таким образом, полученные нами данные впервые показывают ко-локализацию нуклеокапсидных белков вирусов HTV, SNV и PHV с белками ранних эндосом (Rab5), поздних эндосом (Rab7 и Rab9) и рециркулирующих эндосом (Rab11).
Основываясь на полученных нами данных можно предположить схему внутриклеточного траспорта хантавирусов. После попадания в клетку, хантавирусы транспортируются от цитоплазматической мембраны ранними эндосомами. Поздние эндосомы доставляют хантавирусы к аппарату Гольджи, где и происходит трансляция и созревание хантавирусов Старого Света. От аппарата Гольджи к цитоплазматической мембране, хантавирусы транспортируются рециркулирующими эндосомами. На цитоплазматической мембране происходит созревание хантавирусов Нового Света и освобождение вирусных частиц.
Нами впервые показано, что ко-локализация нуклеокапсидных белков хантавирусов HTV, SNV и PHV с белком Rab5 присутствует на всех ранних стадиях инфекции, в то время как ко-локализация с белком Rab11 наблюдается только через 12 часов после инфекции. Причиной может быть то, что нуклеокапсидные белки хантавирусов сначала попадают в ранние эндосомы, а в последствии транспортируются в рециркулирующие эндосомы.
Далее мы хотели проанализировать каким образом белки Rab5 и Rab11 влияют на внутриклеточную локализацию и синтез нуклеокапсидных белков хантавирусов in vitro. Нами впервые показано, что нуклеокапсидные белки хантавирусов HTV, SNV и PHV имеют ко-локализацию с дикой и мутантной доминантно-негативной формами белков Rab5 и Rab11. Биосинтез мутантных доминантно-негативных нефункциональных форм белков Rab5 и Rab11 приводит к блокированию процессов эндоцитоза на стадии ранних эндосом и рециркулирующих эндосом, соответственно. Мы также впервые показали в данной работе, что биосинтез мутантных форм белков Rab5 и Rab11 in vitro приводит к значительному снижению уровня внутриклеточного содержания нуклеокапсидных белков хантавирусов, экспрессирующихся с рекомбинантных лентивирусов LV-HTV-S, LV-SNV-S и LV-PHV-S. В ранее опубликованные работы по исследованию эффекта подавления синтеза Rab белков на уровень внутриклеточного содержания нуклеокапсидных белков хантавирусов описано, что при подавлении синтеза белка Rab11 в клетках, инфицированных ANDV, значительно снижается уровень внутриклеточного содержания нуклеокапсидного белка вируса ANDV (Rowe et al., 2008).
Ранние эндосомы принимают участие в эндоцитозе. Они заключают биологическое содержимое и сортируют его, определяя, таким образом, его дальнейшую судьбу (Bucci et al., 1992;Nielsen et al., 1999). При разрушении, он отправляется к лизосомам, в то время как при переработке—отправляется к рециркулирующим эндосомам. Подавление синтеза белка Rab5, возможно, приводит к снижению внутриклеточного содержания нуклеокапсидных белков хантавирусов из-за нарушения функции ранних эндосом.
Рециркулирующие эндосомы перерабатывают белки, в том числе и клеточные рецепторы—трасферрин (Ren et al., 1998;Schlierf et al., 2000), рецепторы полииммуноглобулина (Apodaca et al., 1994) и хантавирусные клеточные рецепторы интегрина 3 (Jones et al., 2006). Таким образом, подавление синтеза белков рециркулирующих эндосом может влиять на количество хантавирусных клеточных рецепторов и, соответственно, на проникновение хантавируса в клетку. Рециркулирующие эндосомы также участвуют во внутриклеточном транспорте от аппарата Гольджи к плазматической мембране (Chen et al., 1998;Ren et al., 1998). Сборка вирионов хантавирусов Старого Света происходит в аппарате Гольджи (Schmaljohn and Nichol, 2007), в то время как для хантавирусов Нового Света — на плазматической мембране (Ravkov et al., 1997). Таким образом, хантавирусы нуждаются в рециркулирующих эндосомах для транспорта вирионов или хантавирусных белков к плазматической мембране. Снижение внутриклеточного содержания нуклеокапсидных белков хантавирусов при подавлении синтеза белка Rab11 может произойти из-за нарушения внутриклеточного транспорта от аппарата Гольджи к плазматической мембране. Нами было показано, что при снижении уровня внутриклеточного содержания нуклеокапсидных белков хантавирусов при подавлении функции белков Rab5 и Rab11 (за счет биосинтеза мутантных домининтно-негативных нефункциональных форм белков) in vitro, транскрипция нуклеокапсидных белков хантавирусов не меняется.