Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 . Эпидемиология остеопороза 12
1.2..Классификация остеопороза 14
1.3 .Патогенез постменопаузального остеопороза 16
1 4 Рентгеновская денситометрия в диагностике остеопороза 19
1.5. Генетические факторы риска развития остеопороза 21
1.5.1. Ген аі-цепи коллагена I типа (COL1A1) 21
1.5.2. Ген рецептора витамина D (VDR) 24
1.5.3. Ген рецептора эстрогенов-а (ESRJ) 28
1.5.4. Ген кальцитонина (CALCA) 31
1.5.5. Гены цитокинов (IL6, IL1RN, TGFB1, IGF1) 31
1.5.6. Ген фактора некроза опухоли-а (TNF) и система RANKL/RANK/OPG 35
1.5.7. Ген белка LRP5 (LRP5) и Wnt-сигнальный путь 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1 .Материалы исследования 38
2.2.Методы исследования 41
2.2.1. Выделение геномной ДНК 41
2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 42
2.2.3. Рестрикционный анализ 43
2.2.4. Метод электрофореза 43
2.2.5. SSCP-анализ 44
2.2.6. Секвенирование 44
2.3. Статистическая обработка результатов 45
Глава 3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Исследование полиморфных вариантов гена альфа-1 цепи коллагена первого типа (COL1A1) у женщин из Волго- Уральского региона России 48
3.1.1. Изучение полиморфных локусов -1997G>Т, -1663indelT и +1546G>T гена COL1A1 в этнических группах Волго-Уральского региона 48
3.1.2. Анализ ассоциаций полиморфных локусов -1997G>T, -1663indelT и +1546G>T и гаплотипов гена СОЫА1 с риском развития переломов 53
3.1.3. Анализ ассоциаций полиморфных локусов -1997G>T, -1663indelT и +15460Т гена СОЫА1 с остеопорозом 61
3.1.4. Анализ ассоциаций полиморфных локусов -1997G>T,
-1663indelT и +1546G>T и гаплотипов гена СОЫА1 с уровнем МПКТ 64
3.2. Исследование полиморфных вариантов гена белка 5, связанного с рецептором липопротеина низкой плотности {LRP5) у женщин из Волго-Уральского региона России 68
3.2.1. Изучение полиморфных локусов 4037С>Т, 1980С>Т, 1695G>A гена LRP5 в этнических группах Волго-Уральского региона 69
3.2.2. Анализ ассоциаций полиморфных локусов 4037С>Т, 1980С>Т, 1695G>A гена LRP5 с риском развития переломов. 73
3.2.3. Анализ ассоциаций полиморфных локусов 4037 С>Т, 1980С>Т, 16950А гена LRP5 с риском развития остеопороза 77
3.2.4. Анализ ассоциаций полиморфных локусов 4037С>Т, 1980ОТ, 1695G>A генаLRP5 с уровнем МПКТ 80
3.3. Исследование полиморфных вариантов гена рецептора витамина D (VDR) у женщин из Волго-Уральского региона России 83
3.3.1. Изучение полиморфного локуса Fokl гена VDR в этнических группах Вол го-Уральского региона 84
3.3.2. Анализ ассоциаций полиморфных локусов Fokl, BsmI и TaqI и гаплотипов гена VDR с риском развития переломов... 86
3.3.3. Анализ ассоциаций полиморфных локусов Fokl, BsmI и TaqI гена VDR с остеопорозом 93
3.3.4. Анализ ассоциаций полиморфных локусов Fokl, BsmI и TaqI и гаплотипов гена VDR с уровнем МПКТ 96
3.4. Исследование полиморфного варианта (ТААА)п гена витамин D связывающего белка (DBP) у женщин из Волго-Уральского региона России 103
3.4.1. Изучение полиморфного локуса (ТААА)п гена DBP в этнических группах Волго-Уральского региона 103
3.4.2. Анализ ассоциаций полиморфного локуса (ТААА)п гена DBP с риском развития переломов 106
3.4.3. Анализ ассоциаций полиморфного локуса (ТААА)п гена DBP с риском развития остеопороза 108
3.4.4. Анализ ассоциаций полиморфного локуса (ТААА)п гена DBP с уровнем МПКТ ПО
3.5. Исследование полиморфного варианта (СА)п гена кальцитонина (CALCA) у женщин из Волго-Уральского региона России 111
3.5.1. Изучение полиморфного локуса (СА)„ гена CALCA в этнических группах Волго-Уральского региона России 112
3.5.2. Анализ ассоциаций полиморфного локуса (СА)п гена CALCA с риском развития переломов 114
3.5.3. Анализ ассоциаций полиморфного локуса (СА)п гена CALCA с риском развития остеопороза 117
3.5.4. Анализ ассоциаций полиморфного локуса (СА)п гена CALCA с уровнем МПКТ 119
3.6. Исследование полиморфных вариантов гена рецепторов эстрогена-а (ESR1) у женщин из Волго-Уральского региона России 121
3.6.1. Изучение полиморфных локусов с.454-397Т>С и с.454-351A>G гена ESR1 в этнических группах Волго-Уральского региона 122
3.6.2. Анализ ассоциаций полиморфных локусов с.454-397Т>С, c.454-351A>G и (ТА)п и гаплотипов гена ESR1 с риском развития переломов 126
3.6.3. Анализ ассоциаций полиморфных локусов с.454-397Т>С, с.454-351A>G и (ТА)п гена ESR1 с риском развития остеопороза 134
3.6.4. Анализ ассоциаций полиморфных локусов с.454-397Т>С, c.454-351A>G и (ТА)„ генаESR1 с показателями МПКТ 137
3.7. Исследование уровня эстрадиола и кальцитонина в сыворотке крови у женщин постменопаузального возраста 140
3.7.1. Исследование уровня эстрадиола и кальцитонина в группах женщин с переломами и без переломов 142
3.7.2. Анализ ассоциаций уровня эстрадиола и кальцитонина с показателями минеральной плотности костной ткани 144
3.7.3. Анализ ассоциаций уровня эстрадиола с полиморфными вариантами с.454-397Т>С, c.454-351A>G и (ТА)пгенаESRL. 147
3.7.4. Анализ ассоциаций уровня кальцитонина с полиморфным локусом (СА)„ гена CALCA 150
3.8. Анализ межгенных взаимодействий в детерминации риска развития переломов у женщин русской и татарской этнической принадлежности 152
Заключение 156
Список литературы 161
Приложение
- Эпидемиология остеопороза
- Генетические факторы риска развития остеопороза
- Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
- Исследование полиморфных вариантов гена альфа-1 цепи коллагена первого типа (COL1A1) у женщин из Волго- Уральского региона России
Введение к работе
Актуальность проблемы
Остеопороз (ОП) - это системное заболевания скелета, характеризующееся снижением костной массы, микроархитектурными нарушениями костной ткани, приводящими к повышению ломкости костей и увеличению риска переломов [Consensus development conference: Diagnosis, prophylaxis and treatment of osteoporosis, 1993]. Социальная значимость ОП определяется его последствиями и осложнениями - переломами позвоночника и трубчатых костей, обусловливающими значительный подъем заболеваемости, инвалидности и смертности. Частота ОП повышается с возрастом, поэтому наблюдаемое в последние десятилетия старение населения ведет к постоянно растущей частоте заболевания и увеличению числа переломов. Так, показано, что у 35% женщин после наступления менопаузы развивается ОП, а у лиц старше 75 лет заболевание определяется более чем в 70% случаев [Melton, 2003]. Оценка мировых тенденций показала, что только за счет старения населения земного шара частота переломов шейки бедра увеличится к 2050 году в два раза [WHO report, 2003]. Общепринятой является классификация, согласно которой ОП разграничивается на первичный, не обусловленный каким-либо заболеванием, влиянием медикаментов, вредных привычек и вторичный, включающий вышеперечисленные причины. Постменопаузальный ОП в структуре первичного ОП занимает 85%.
ОП является многофакторным заболеванием, на развитие которого влияют средовые и генетические факторы. Доказана роль таких факторов, как дефицит потребления белка, кальция, витамина D, курение, злоупотребление алкоголем, гиподинамия, низкая масса тела, ранняя менопауза в повышении риска развития ОП. Многочисленные исследования свидетельствуют о существенном вкладе генетических факторов в патогенез остеопороза. Показано, что вариабельность минеральной плотности костной ткани (МПКТ) на 70-80% обусловлена генетическими факторами, а риск возникновения
8 остеопоретических переломов - на 50-60% [Рососк, 1987; Flicker, 1995; Jouanny, 1995; Ralston, 1999; Andrew, 2005]. В настоящее время наиболее перспективным является поиск ассоциации заболевания с полиморфными вариантами генов-кандидатов, белковые продукты которых вовлечены в процессы метаболизма костной ткани [Uitterlinden, 2006; Zmuda, 2006; Williams, 2006]. Рядом исследователей показана роль полиморфных вариантов генов гормонов и их рецепторов (рецептора эстрогена-а - ESR1, рецептора витамина D - VDR, рецептора андрогенов - AR, рецептора кальцитонина -CTR, паратиреоидного гормона - РТН), генов цитокинов, факторов роста и их рецепторов (гены интерлейкина-4 - IL-4, интерлейкина-6 - IL-6, трансформирующего фактора роста-pl - TGFB1, фактора некроза опухоли-а -TNF, инсулиноподобного фактора роста 2 - IGF2, рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 и 2 - IGF1R, IGF2R), генов компонента костного матрикса (а 1-цепи коллагена I типа - СОЫА1, <х2-цепи коллагена I типа - СОЫА2, остеокальцина - BGLAP, остеонектина - SPOCK) в развитии остеопороза [Ralston, 2003; Garnero, 2004; Deng, 2004; Uitterlinden, 2006; Zmuda, 2006; Lei, 2006]. Однако, результаты многочисленных исследований противоречивы, молекулярно-генетические основы формирования ОП до конца не ясны. Понимание генетических механизмов развития заболевания имеет большое значения для разработки новых подходов к профилактике и лечению ОП.
В Волго-Уральском регионе России молекулярно-генетическое изучение ОП ранее не проводилось и выявление полиморфных вариантов генов-кандидатов, наиболее значимых в развитии ОП, представляет собой актуальную задачу, как для фундаментальной науки, так и практической медицины,
В связи с вышесказанным были определены цели и задачи исследования.
Цель работы: изучение молекулярно-генетических основ развития постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе
Задачи исследования:
Провести исследование уровня эстрадиола и кальцитонина в сыворотке крови у женщин постменопаузального возраста.
Провести анализ ассоциаций уровня эстрадиола с полиморфными вариантами с.454-397Т>С, c.454-351A>G и (ТА)п гена рецептора эстрогенов-а (ESR1) и уровня кальцитонина с полиморфным локусом (СА)„ гена кальцитонина CALCA.
Провести исследование полиморфных вариантов генов альфа-1 цепи коллагена первого типа (СОЫА1), рецептора эстрогенов-а (ESR1), рецептора витамина D (VDR), белка 5, связанного с рецептором липопротеина низкой плотности (LRP5), кальцитонина (CALCA), витамин D связывающего белка (DBP) в этнических группах Волго-Уральского региона (русские, татары, башкиры).
Провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов -1997G>T, -ІббЗШеІТ, +1546G>T гена COL1A1, с.454-397Т>С, c.454-351A>G, (ТА)п гена ESR1, Fokl, BsmI, TaqI гена VDR, 4037ОТ, 1980OT, 1695G>A гена LRP5, (CA)n гена CALCA, (ТААА)п гена DBP с риском развития ОП, переломов и показателями МПКТ.
Оценить роль межгенных взаимодействий в развитии переломов у женщин постменопаузального возраста из Волго-Уральского региона.
Научная новизна исследования
Впервые собрана коллекция ДІЖ женщин больных постменопаузальным ОП в Волго-Уральском регионе России. Определена частота аллелей и генотипов генов COL1A1, LRP5, DBP и CALCA у здоровых доноров русской, татарской и башкирской этнической принадлежности, проживающих на территории Волго-Уральского региона России. Впервые проведен анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов COL1A1, ESR1, VDR, LRP5, DBP и CALCA с риском развития переломов, остеопороза и уровнем МПКТ в разных
10 этнических группах и оценена роль взаимодействия рассматриваемых генов в формировании предрасположенности к переломам. Выявлена ассоциация уровня эстрадиола с полиморфными вариантами гена ESR1 и кальцитонина с (СА)„ полиморфизмом гена CALCA у женщин русской и татарской этнической принадлежности.
Научно-практическая значимость работы
Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических детерминантах развития постменопаузального остеопороза. Получены новые данные о влиянии исследуемых ДНК-локусов на риск развития переломов и уровень МІЖТ в различных точках измерения. Данные диссертационной работы могут служить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития ОП. В клинической практике тестирование полиморфизмов генов-кандидатов ОП может быть применено для проведения пресимптоматической диагностики, а также при консультировании больных ОП для разработки более адекватных лечебно-профилактических мероприятий. Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских высших образовательных учреждениях, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту:
Ассоциация уровня эстрадиола с генотипом ESR1*A*A и гаплотипом ESR1 *Т*А гена ESR1 у женщин татарской этнической принадлежности.
Ассоциация уровня кальцитонина с аллелем CALCA*17 гена CALCA у женщин русской этнической принадлежности.
Этнические различия между популяциями русских, татар и башкир Вол го-Уральского региона по полиморфным локусам c.454-351A>G гена ESR1, Fokl гена VDR и (ТААА)„ гена DBP .
Ассоциация риска развития переломов с полиморфными вариантами генов COL1A1, ESR1, DBP и VDR у женщин русской этнической принадлежности и с полиморфизмом гена CALCA у женщин татарской этнической принадлежности.
Генетические маркеры повышенного риска и устойчивости к развитию ОП по полиморфным локусам генов СОЫА1, ESR1, CALCA у женщин русской этнической принадлежности.
Ассоциация показателей МПКТ с полиморфными вариантами генов CALCA, LRP5 и СОЫА1 у женщин русской этнической принадлежности.
Ассоциация уровня МПКТ с полиморфными локусами гена VDR при потреблении кальция менее 800 мг в сутки у женщин русской этнической принадлежности.
Детерминация риска развития переломов взаимодействием полиморфных вариантов генов VDR и DBP, VDR и COL1A1 у женщин русской этнической принадлежности, полиморфных локусов генов VDR и СОЫА у женщин татарской этнической принадлежности.
Эпидемиология остеопороза
ОП во всем мире представляет одну из важнейших проблем здравоохранения, частота его в последние десятилетия постоянно увеличивается. По данным ВОЗ, более 75 млн. человек в Европе, Северной Америке и Японии страдают остеопорозом [WHO report, 2003]. В 1990 г. произошло примерно 1,7 миллионов переломов шейки бедра у мужчин и женщин в различных странах мира [Cooper, 1992]. Ожидается, что вследствие увеличения численности населения земного шара и продолжительности жизни к 2025 г. число таких переломов составит 3 миллиона [WHO report, 2003].
Риск переломов позвоночника, шейки бедра и дистального отдела лучевой кости составляет 40% для женщин и 15% для мужчин в возрасте 50 лет и старше [Melton, 1988]. Распространенность остеопороза увеличивается с возрастом. Так, по данным денситометрии позвоночника, бедра и запястья частота остеопороза составляет 8% у женщин в возрастной группе от 50 до 59 лет, 30% у женщин от 60 до 69 лет, и доходит до 82% у женщин 80 лет и старше [Melton, 2003]. В среднем, одна из трех женщин в климактерическом периоде и более половины лиц в возрасте 75-80 лет страдают остеопорозом. Частота развития остеопороза у женщин выше, чем у мужчин, а у женщин европеоидной расы выше, чем у остальных. Так, распространенность остеопороза шейки бедра у белых женщин постменопаузального возраста составила 17%, у женщин мексиканского происхождения — 12%, у афроамериканок - 8% [Looker, 1997]. Однако даже среди белого населения распространенность остеопороза широко варьирует, достигая 5-Ю кратных различий между географическими регионами, например, перелом шейки бедренной кости чаще встречается в Скандинавских странах, чем в Северной Америке и Океании, и реже - в странах Южной Европы [Maggi, 1991; Johnell, 1992; Elffors, 1994]. Причина такой вариабельности до конца не ясна. Расовые различия частично объясняются наследственным характером величины скелета. Наибольшая масса костей отмечается у африканцев, у них же встречается меньше всего переломов. Наименьшая масса костей - у белых женщин из Северной Европы [Baron, 1994]. Различия, возможно, также связаны с региональными особенностями рациона питания и физической активности.
Исследования эпидемиологии остеопороза в России насчитывают немногим более 10 лет. В отдельных городах России в выборках населения в возрасте 50 лет и старше, частота остеопороза составила у женщин 30,5-33,1%, у мужчин 22,8-24,1%, соответственно. Ежегодно частота переломов проксимального отдела бедренной кости среди населения России в возрасте 50 лет и старше составляет в среднем 105,9 на 100 тыс. населения, частота переломов дистального отдела предплечья - 426,2 на 100 тыс. населения. Частота переломов шейки бедра возрастает экспоненциально с возрастом, достигая 46,5% у женщин старше 65 лет [Михайлов, 2001].
Таким образом, согласно данным многочисленных исследований, остеопороз и связанные с ним переломы распространены во всем мире. Однако частота заболевания существенно варьирует в различных регионах земного шара, в разных странах и даже в отдельных регионах одной страны. Во всех исследованиях отмечаются такие общие закономерности, как экспоненциальное увеличение частоты переломов с возрастом и достоверное преобладание переломов у женщин.
В 1997 году Президиум Российской ассоциации по остеопорозу принял классификацию остеопороза по этиологическому и патогенетическому признаку (табл. 1). Выделяют два основных типа остеопороза - первичный и вторичный. К первичному относят постменопаузальный, сенильный, а также остеопатии неясной этиологии (ювенильный — остеопороз детей и подростков и идиопатическии - остеопороз, встречающийся у взрослых людей молодого и среднего возраста). Вторичный остеопороз возникает как осложнение других заболеваний, состояний или воздействий. Таблица 1 Классификация остеопороза А. Первичный остеопороз 1. Постменопаузальный остеопороз (I тип) 2. Сенильный остеопороз (II тип) 3. Ювенильный остеопороз 4. Идиопатическии остеопороз Б. Вторичный остеопороз I. Заболевания эндокринной системы 1. Эндогенный гиперкортицизм (болезнь и синдром Иценко-Кушинга) 2. Тиреотоксикоз 3. Гипогонадизм 4. Гиперпаратиреоз 5. Сахарный диабет (инсулинзависимый) 6. Гипопитуитаризм, полигландулярная эндокринная недостаточность II. Ревматические заболевания 1. Ревматоидный артрит 2. Системная красная волчанка 3. Анкилозирующий спондилоартрит III. Заболевания органов пищеварения
Генетические факторы риска развития остеопороза
Главным белком костного матрикса является коллаген I типа, который составляет около 90% органического матрикса кости. Коллаген первого типа относится к классу гетерополимеров и содержит две at и одну аг-полипептидные цепи, образующие полужесткие, стабильные трехспиральные молекулы. Структура и ориентация коллагеновых фибрилл, а также характер посттрансляционных модификаций молекул коллагена во многом определяют качественные характеристики костной ткани и прочность кости в целом [Viguet-Carrin, 2006]. Нарушение биосинтеза коллагена и структуры коллагеновых волокон характерно для многих врожденных и приобретенных болезней. Так, мутации в генах, кодирующих полипептидные последовательности цепей коллагена первого типа, проводят к развитию несовершенного остеогенеза - тяжелого наследственного заболевания, характеризующегося нарушением костеобразования и повышенной ломкостью костей.
Ген COL1A1 картирован на длинном плече 17 хромосомы (17q21.33). В 5 регионе гена локализованы три полиморфизма: в сайте инициации транскрипции Spl (+J546G/T, rs 1800012) и в промоторе (-1997G/T, rsl 107946 и -1663indelT, rs2412298). Показано, что полиморфные локусы -1997G/T и -1663indelT сцеплены между собой и находятся в тесном неравновесии по сцеплению с Spl полиморфизмом.
Впервые ассоциация Spl полиморфизма с МПКТ и переломами у женщин из Британии была обнаружена Grant и соавт. в 1996 году. Более низкие значения МПКТ наблюдались у носителей генотипов COLlAl S s и COLlAl s s по сравнению с носителями генотипа COLlAl S S. Среди пациентов с тяжелым ОП и переломами позвонков частота встречаемости генотипов COLlAl S s и COLlAl s s составила 54% и была значительно выше, чем в контрольной группе (27%). Авторы сделали вывод, что у носителей аллеля COLlAl s риск развития переломов позвонков повышается более чем в два раза [Grant, 1996]. Исследования, проведенные на выборках 1778 женщин в Голландии [Uitterlinden, 1998] и 715 женщин в Италии [Braga, 2000] подтвердили ассоциацию Spl полиморфизма с МПКТ позвоночника и шейки бедра. Значения МПКТ были самыми высокими у женщин с генотипом COLlAl S S, промежуточными - с COLlAl S s и самыми низкими у женщин с генотипом COLlAl s s. Ассоциация аллеля COLlAl s с повышенным риском переломов была показана у женщин из Испании [Bernad, 2002; Navarro, 2007], Голландии [Yazdanpanah, 2007], Великобритании [McGuigan, 2000] и Греции [Weichetova, 2005]. Согласно Bandres и соавт. генотип COLlAl s s ассоциирован с риском развития переломов у женщин постменопаузального возраста, независимо от МПКТ [Bandres, 2005]. Однако целый ряд работ не подтвердил связь Spl полиморфизма с МПКТ [Sowers, 1999; Aerssens 2000; Ashford, 2001; Hubacek, 2006], костным метаболизмом [Sowers 1999; Aerssens, 2000; Heegaard, 2000], потерей костной массы [Heegaard, 2000]. Метаанализ 26 опубликованных работ, включающий 7849 участников, показал, что более низкие значения МПКТ поясничных позвонков ассоциированы с генотипом
COLlAl S s. Оказалось, что показатели МПКТ шейки бедра достоверно ниже у носителей генотипов COLlAl S s и COLlAl s s. Относительный риск переломов позвонков у лиц с генотипом COLlAl S s составляет 1,37, с генотипом COLlAl s s - 2,48. Согласно данной работе, Spl полиморфизм ассоциирован с низкой МПКТ и значительным риском остеопоротических переломов, особенно позвонков [Mann, 2003].
Самое масштабное на сегодняшний день многоцентровое исследование, проведенное в ряде европейских стран и включающее более 20 тысяч участников, показало, что генотип COLlAl s s ассоциирован с низкими значениями МПКТ поясничных позвонков и шейки бедра, а риск развития переломов позвоночника у женщин с генотипом COLlAl S s или COLlAl s s в 1,4 раза выше по сравнению с носителями генотипа COLlAl S S [Ralston, 2006].
На сегодняшний день опубликовано небольшое количество работ, посвященных изучению возможной роли -1663indelT полиморфизма гена. СОЫА1 в патогенезе остеопороза. Так, Stewart и соавт. показали, что генотип -1663 D D ассоциирован с низкими значениями МПКТ позвоночника у женщин из Великобритании [Stewart, 2006]. Согласно исследованиям, проведенным в Испании, полиморфный локус -1663indelT ассоциирован с МПКТ шейки бедра в сочетании с Apal полиморфизмом гена рецептора витамина D (VDR) [Bustamante, 2007]. Полиморфный локус -1997G/T гена COL1A1 ассоциирован с МПКТ в большинстве популяций мира. В частности, согласно исследованиям Liu и соавт, проведенным среди европейцев, носители аллеля -1997 G имеют более высокие значения МПКТ [Liu, 2004]. У женщин из Великобритании и Японии аллель -1997 G, наоборот, ассоциирован с низкими показателями МПКТ [Yamada, 2005; Stewart, 2006].
Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
Разделение фрагментов ДНК размером менее 500 п.о. после амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле (ПААГ) (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида - 29:1). Электрофорез проводили в 1ХТБЕ буфере (0,089 М трис-НС1; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0) при напряжении 300В. Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 15% фикола. Разделение фрагментов размером более 500 п.о. проводили в 2% агарозном геле. Продукты амплификации локусов гена CALCA, содержащих (СА)п-повторы, разделяли в 8% полиакриламидном геле (соотношение акриламида и метиленбисакриламида - 29:1.3) при напряжении 270-300V и длине разгона до 25-30 см. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Документирование результатов электрофореза проводили с использованием видеосистемы «Geldokulant» (Франция)
Результаты электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов исследованных полиморфных ДНК-локусов показаны на рис. 1-13 прил. . SSCP-анализ
Исследование -1663indelT полиморфизма гена СОЫА1 проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP — single strand conformation polymorphism), основанным на различной электрофоретической подвижности однонитевых фрагментов ДНК, различающихся вследствие нуклеотидных замен по конформации молекул, в неденатурирующем полиакриламидном геле [Orita, 1989].
После проведения ПНР 10 мкл амплификата смешивали с 3,3 мкл 0,5 М NaOH и 0,3 мкл 0,5М ЭДТА и нагревали в течение 15 минут при 42С. После этого к пробам добавляли 3 мкл формамида, смешанного с 0,5% бромфенолового синего и 0,5% ксиленцианола, и наносили на 10% полиакриламидный гель (исходное соотношение акриламида/метиленбисакриламида 29:1) с 5% глицерином. В качестве электрофорезного буфера использовали 0,5 ТВЕ. Электрофорез геля длиной 20 см проходил при комнатной температуре при напряжении 100В в течение 30 часов. Окраску геля проводили в течение 15 минут азотно-кислым серебром. Далее гель промывали дистиллированной водой и опускали в раствор, содержащий 40% формалин и NaOH. После проявления гель промывали дистиллированной водой
Результаты SSCP анализа -1663indelT полиморфизма гена COL1A1 приведены в рис. 14 прил.
Подготовка матриц для секвенирования включала очистку ПНР продуктов от избытка праймеров, димеров праймеров и дезоксирибонуклеотидов (dNTP). Очистку осуществляли путем элюции ДНК из агарозных гелей с последующим использованием набора реагентов DIAtomtmDNA Elution по методике описанной в инструкции.
Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 310 (Applied Biosystems) с использованием набора для флюоресцентного мечения DYEnamicET согласно протоколу фирмы производителя [Amersham Pharmacia Biotech DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit]. Результаты секвенационного анализа -1663indelT полиморфизма гена СОЫА1 показаны на рис. 15 прил.
Оценку частоты аллелей рассчитывали по формуле: p=(2Ni+N2)/2N, q=(2N3+N2)/2N, где р - частота аллеля A, q - частота аллеля а, N - общий объем выборки N=Ni+N2+N3, где N], N2, N3 - численности особей с генотипами АА, Аа и аа, соответственно. Статистическую ошибку оценки частот генотипов рассчитывали по формуле [Л.А. Животовский, 1991]: sp=Vp(l-p)/N, где р - частота генотипа, N - объем выборки Для вычисления статистической ошибки частот аллелей использовали формулу: sp=Vp(l-p)/2N.
Поскольку в наших выборках встречались значения частот р 0,2 и р 0,8, то в таких случаях статистическое распределение ошибки будет асимметричным, поэтому доверительный интервал генерального значения частоты вычисляли по формуле [Л.А. Животовский, 1991]: p =n/[n+(N-n+l)F], p"=(n+l) "/[N-n+(n+l)F"], где F — критическое табличное значение -распределения с числом степеней свободы v CN-n+l) v 2=2n для уровня значимости а/2, F" -критическое значение F-распределения с v"i=2(n+l) v"2=2(N-n) для того же уровня значимости а/2.
Для проверки соответствия наблюдаемого распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению по закону Харди-Вайнберга использовался критерий
Исследование полиморфных вариантов гена альфа-1 цепи коллагена первого типа (COL1A1) у женщин из Волго- Уральского региона России
Нами проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов -1997G T, -ІббЗіпсіеІТи +1546G Tгена СОЫА1 в трех этнических группах Волго-Уральского региона. Частоты аллелей и генотипов -1997G Т полиморфизма гена СОЫА1 в этнических группах татар, русских и башкир, а также в ряде популяций мира представлены в табл. 5. В изученных нами популяциях преобладал аллель -1997 G, частота которого варьировала от 75% у татар до 83% у русских, различия в распределении частот аллелей -1997G T полиморфизма в этнических группах татар, башкир и русских не были статистически значимыми (% =2,49; р=0,29). Анализ распределения частот аллелей -1997G T полиморфизма в разных популяциях выявил тенденцию к увеличению частоты встречаемости аллеля -1997 Т с Запада на Восток. Так, если для населения Западной Европы характерна частота аллеля -1997 Т 13%, то в популяции Китая она повышается до 36%о.
Исследованные нами популяции татар и башкир по распределению частот аллелей -1997G Т полиморфизма гена СОЫА1 статистически значимо отличались от испанцев (х2=7,48; р=0,006 и х2=6,06; р=0,014, соответственно), голландцев (%2=Ю,41; р=0,0012 и х2=8,71; р=0,0031, соответственно) и китайцев 9 9 (Х =4,26; р=0,038 и % =6,95; р=0,0084, соответственно). Русские оказались схожи с европейскими популяциями и отличались от популяции Китая (р 0,001).
Преобладающим в изученных нами популяциях был генотип -1997 G G, частота которого варьировала от 52,2% у татар до 68,5%) у русских. Генотип -1997 Т Т встречался с частотой 3,7% у башкир, 2,7% у русских и 2,2%о у татар, различия в распределении частот генотипов статистически незначимы (х=3,93; р=0,41). В европейских популяциях частота генотипа -1997 G G составила 76% у испанцев и 75,9% у голландцев, тогда как у китайцев отмечается снижение частоты генотипа -7997 G G до 38,9%. Частота генотипа -1997 Т Т составила 2% у испанцев, 1,6% у голландцев и 11,2% у китайцев. По распределению частот генотипов -1997G T полиморфизма татары и башкиры отличались от испанцев (х =10,59; р=0,005 и Х2=7,1; р=0,028, соответственно), голландцев (х2=П,97; р=0,002 и х2=8,63; 9 9 р=0,01, соответственно), китайцев (х =6,8; р=0,033 и % =8,7; р=0,013, соответственно), тогда как русские отличались только от китайцев (р 0,001).
Распределение частот генотипов и аллелей -1997G Тполиморфного локуса гена COL1A1 в трех этнических группах Волго-Уральского региона и некоторых популяциях мира
Распределение частот аллелей и генотипов -1663indelT гена СОЫА1 в трех этнических группах Волго-Уральского региона и некоторых популяциях мира приведены в табл. 6. Частота аллеля -1663 D в популяциях Волго-Уральского региона варьировала от 7,6% у татар до 10,2% у башкир, различия в распределении частот аллелей -1663indelT полиморфизма в исследуемых выборках не были статистически значимыми (х =0,48; р=0,78). Согласно литературным данным, в европейских популяциях аллель -1663 D встречается с более высокой частотой (19,6% у англичан и 23% у испанцев). По распределению частот аллелей -1663indelT полиморфизма испанцы отличались от русских (х2==14,8; р 0,001), татар (х2=Ю,4; р=0,0012) и башкир (х2=8,19; р=0,0042), голландцы также отличались от русских (х=11,1; р 0,001), татар (Х2=7,58; р=0,006) и башкир (х2=5,42; р=0,02).
Преобладающим в изученных нами этнических группах был генотип -1663 1 1, частота которого составила 68,3% у русских, 84,8% у татар и 79,6% у башкир. Генотип -1663 D D встретился с частотой 2,7% у русских и не был обнаружен у татар и башкир, различия в распределении частот генотипов -1663indelT полиморфизма не были статистически значимыми (х =4,74; р=0,314). В европейских популяциях отмечается снижение частоты генотипа -1663 1 1 и повышение частот генотипов -1663 I D и -1663 D D по сравнению с этническими группами Волго-Уральского региона. На сегодняшний день не опубликованы данные о распределении частот аллелей и генотипов -1663indelT полиморфизма в азиатских популяциях. По распределению частот генотипов популяции русских, татар и башкир статистически значимо отличались от популяций Западной Европы (р 0,05).