Введение к работе
Актуальность проблемы
Одной из актуальных проблем молекулярной генетики человека является создание национального банка данных о характере мутационных повреждений определенных генетических детерминант при наиболее распространенных наследственных патологиях.
Фенилкетонурия (ФКУ) - распространенное аутосомно-рецессив-ное заболевание, обусловленное дефицитом фермента печени фенила-ланингидроксилазы (ФАГ). Из-за высокой частоты встречаемости (1:7500 новорожденных) в Европейской популяции ФКУ представляет важную медико-социльную проблему.
Классическая ФКУ характеризуется прогрессирующей умственной отсталостью у больных, не получающих адекватного лечения с самого их рождения. Предпринятые еще в начале 50-х годов попытки диетической коррекции биохимических нарушений при ФКУ оказались успешными и послужили стимулом для создания в ряде стран программ массового скрининга новорожденных. Однако на сегодняшний день накапливаются даннче о недостатках диетотерапии. Ставшее массовым и считавшееся безопасным раннее прекращение диеты (до 7 лет), как выяснилось , приводит к снижению у большинства больных показателей Щ, особенно связанных с абстрактным мышлением. Одной из проблем общественного здравоохранения стала проблема "материнской ФКУ" - рождение у женщин с ФКУ. прошедших диетотерапию, детей с умственной неполноценностью, тяжелой неврологической симптоматикой и пороками сердца, (даже если эти дети являются лишь гетерозиготными носителями дефектного гена). В связи с нерешенностью проблем ранней диагностики и лечения ФКУ больное медицинское и социальное значение имеет профилактика заболевания, ставшая возможной только с появлением молекулярно-генетических методов. Необходимость знания молекулярной природы мутационных повреждений гена ФАГ при данном заболевании связана с тем. что вследствие его органо-специфической экспрессии (гепатоциты) биохимический метод пренатальной диагностики невозможеі..
Благодаря интенсивным исследованиям в 1982 году в лаборатории Savlo Woo (Baylor College, Houston, USA) был клонирован ген крысиной, а в 1985 году человеческой ФАГ. Определена локализация гена на 12 хромосоме (12q22-q24.1) и изучена структура и выраженный полиморфизм локуса ФАГ. Проводившиеся последние десять лет во всем мире исследования локуса ФАГ выявили гетерогенность
- 4 ФКУ ' на молекулярном уровне и определили целый спектр ФКУ-обус-лавливающих мутаиий.
В настоящее время известно около 200 ФКУ-мутаций гена ФАГ (РАН "utatlon Analysis Consortium, newsletter October 1994). Для каждой отдельной популяции существует свой специфический спектр мутаций, знание которого является необходимым для проведения мероприятий по медико-генетическому консультированию пациентов и планированию семьи, а также для проведения скрининговых программ с целью выявления гетерозиготных носителей ФКУ. Кроме того, изучение распространения мутаций, сходства и различий в строении мутантных генов различных этнических групп открывают новые возможности исследования миграции населения, родственных связей территориально отдаленных народов.
Данная работа является необходимым этапом поиска оптимальных подходов молекулярной диагностики ФКУ в Российской популяции, а также важна для выяснения популяционных особенностей структуры самого гена ФАГ. фланкирующих его ДНК последовательностей и молекулярной природы его мутаций, т.е. имеет непосредственное отношение к пониманию структурно-функциональной организации генома челоЕэка. Таким образом, актуальность избранной темы не вызывает сомнений.
Цели и задачи исследования
Целью данного исследования являлся молекулярнс-генетический анализ локуса фенилаланиніидроксилазы в Санкт-Петербургской популяции и определение спектра мутационных повреждений у больных фенплкетонурией.
Задачи исследования включали:
-
Определение в популяции Санкт-Петербурга частоты встречаемости наиболее распространенных Европейских ФКУ-мутаций;
-
Поиск мутаций, характерных для Петербургской популяции;
-
Изучение полиморфного минисателлитного 3'-участка гена ФАГ с целью использования его для пренатальной диагностики в семьях с ФКУ;
-
Анализ сцепления ФКУ-мутаций с полиморфным VNTR-локусом и выяснение механизмов распространения мутационных повреждений;'
-
Разработка на основе полученных данных оптимальной схемы молекулярной диагностики ФКУ.
Научная новизна полученных результатов
В результате проведенного исследования определен спектр мутационных повреждений гена ФАГ у больных ФКУ Петербургской попу-ляичи. чт'о впервые позволяет говорить о создании надежной системы диагностики ФКУ в данной популяции. Обнаружено 10 мутационных повреждений гена ФАГ и два нейтральных полиморфизма.
Проведен семейный анализ полиморфного минисателлитного участка гена ФАГ и определена его информативность для пренаталь-ной диагностики ФКУ. Впервые для Восточной Европы изучено сцепление мутаций с идентифицированными полиморфизмами гена и с полиморфным VNTR-локусом. Анализ сцепления мутаций R243X и R261Q с данным полиморфным локусом опровергает существующее предположение об их едином происхождении в Европе
Обнаружена ранее неизвестная мутация - делеция одного нук-леотида в 11 экзоне гена ФАГ (K363fs) в одной азербайджанской семье и предложен рестрикцконный тест для быстрого ее скрининга.
Для одновременногс определения известного спектра мутационных повреждений предложено использовать SSCP-анализ как самостоятельный диагностический метод в различных популяциях с определенным ранее набором мутаций. Для Петербургской популяции разработана оптимальная схема проведения пренатальной диагностики ФКУ.
Научно-практическая значимость работа Теоретический интерес представляют:
определение спектра мутационных повреждений гена ФАГ у больных ФКУ Санкт-Петербурга и понимание гетерогенной природы заболевания в Российской популяции;
подтверждение выдвинутой ранее гипотезы о возможном Балто-Сла-вянском происхождении мутации R408W;
получены данные, указывающие на то. что мутации R243X и R261Q возникли по крайней мере дважды на разных гаплотипах;
Обнаружение неизвестной ранее делеции одного нуіслеотида K363fs в гене ФАГ в азербайджанской сшье.
Практическая ценность работы:
- Впервые появилась возможность непосредственного определения
ФКУ-мутаций в Санкт-Петербурге, что позволяет проводить не толь
ко диагностику ФКУ, но и скрининг на гетерозиготное носительство
дефектного ФАГ гена:
определена информативность для пренатальной диагностики анализа гипервариабельного по числу тандемных повторов 3'-участка гена (VNTR);
ра?тботана оптимальная схема молекулярного обследования ФКУ-семей для проведения пренатальной диагностики для Санкт-Петербурга;
предложен метод одновременного определения целого ряда мутаций в любых популяциях с известным спектром молекулярных повреждений.
Исключительная важность молекулярной диагностики определяется тем. что биохимический метод пренатальной диагностики невозможен вследствие органо-сиецифического синтеза фермента в печеночной ткани (гепатоцитах).
Апробация работы v
Предложенные к защите результаты были доложены на Всероссийской конференции "Геном человека", г.Черноголовка (1993); на Первой конференции молодых физиологов и биохимиков России. Санкт-Петербург' (1995). По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезиса.
Структура и обьем работы
Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов ис-след.вания, обсуждения, выводов и списка литературы (145 наименований). Работа изложена на 122 страницах машинописного текста и сомзржит 13 таблиц и 30 рисунков и фотографий.