«Молекулярно-генетические и биохимические характеристики цитратсинтазы, основного фермента синтеза лимонной кислоты, промышленного продуцента Aspergillus niger штамм Л-4» Алексеев Камиль Владимирович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1. Цитратсинтаза. Роль в клеточном метаболизме. 11

1.2. Молекулярно-биологические характеристики цитратсинтазы 15

1.3. Биохимические характеристики цитратсинтазы 19

1.4. Структурная организация цитратсинтазы 20

1.5. Механизм действия 22

Глава 2. Материалы и методы 24

Материалы 24

Методы 24

2.1. Среда и условия культивирования гриба Aspergillus niger 24

2.2. Разработка и оптимизация методов разрушения клеток гриба Aspergillus niger 26

2.3. Молекулярно-генетическая часть исследования: 27

2.4. Биохимическая часть исследования: 50

Глава 3. Результаты собственных исследований 62

3.1. Результаты молекулярно-биологической части исследования: 62

3.2. Результаты биохимической части исследования : 87

Глава 4. Обсуждение результатов исследования з

Глава 5. Заключение 105

Список сокращений и условных обозначений 107

Приложение А 109

Таблица А. 1 109

Приложение Б 111

Схема Б.1 111

Рис. Б.1 112

Приложение В 113

Литература 114

• Молекулярно-биологические характеристики цитратсинтазы
• Структурная организация цитратсинтазы
• Разработка и оптимизация методов разрушения клеток гриба Aspergillus niger
• Результаты биохимической части исследования

Введение к работе

Актуальность темы. Лимонная кислота (ЛК) является ключевым метаболитом и интер-медиатом первого этапа цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). ЛК обнаруживается во всех живых существах, т.к. является неотъемлемым промежуточным соединением аэробного метаболизма.

С точки зрения производства и потребления ЛК является одним из важнейших биопродуктов. На 2009 год мировое производство ЛК превышало 1,6млн тонн. ЛК и ее соли являются объектами многотоннажного биотехнологического производства и находят применение во многих отраслях промышленности, пищевой, фармацевтической, медицинской. ЛК и цитраты также используются как хелатирующие агенты, мономеры для производства функциональных и/или биоразрушаемых полимеров, в нефтедобыче и др. Поэтому потребление ЛК возрастает с каждым годом.

В настоящее время ЛК в промышленных масштабах производится посредством ферментации мицелиальным грибом Aspergillus niger на сахаросодержащих средах. Гриб A.niger был выбран в качестве продуцента т.к. способен давать высокие выходы ЛК даже при низких значениях рН среды без секреции токсичных побочных продуктов.

Производство ЛК является старейшим и наиболее изученным из биотехнологических процессов. Тем не менее, множество деталей биотехнологических процессов производства ЛК остается неизвестным. Несмотря на то, что метаболические пути, ведущие к образованию ЛК, хорошо изучены, механизм, а главное причины сверхсинтеза цитрата остаются до сих пор неясными.

Ключевым ферментом синтеза ЛК является первый фермент ЦТК, цитратсинтаза (ЦС), катализирующий стереоспецифический синтез цитрата из ацетил-коэнзима А и ок-салоацетата. Было показано, что в мицелии гриба фермент ЦС локализован в матриксе митохондрий.

От активности и способности фермента к катализу зависят уровни синтеза ЛК, поэтому полученная информация о ЦС дает возможность увеличить продуктивность по целевому продукту гриба А.niger посредством внесения целенаправленных изменений в его геном, а изучение биохимических характеристик фермента даст возможность оптимизировать процесс ферментации.

Степень разработанности темы. В настоящее время имеются работы, посвященных ЦС из различных организмов. Наиболее глубоко изучены ЦС животных и дрожжей. Для них были определены структура гена, белка и пространственная организация ЦС, строение активных центров и механизм работы фермента. Помимо этого, для множества ЦС, в т.ч. грибных, были выявлены изоформы, определены биохимические характеристики, которые, тем не менее, оказались весьма разнородны и зачастую противоречивы.

Несмотря на долгую историю изучения данного фермента, сведения о его регуляции ограничивались лишь ингибированием активности и доступностью субстрата. В настоящее время для животных и дрожжевых ЦС выявляются новые регуляторные воздействия: пост-трансляционные модификации (ПТМ), механизмы регуляции биосинтеза и транспорта белков. Однако новейшие данные не получили даже теоретического приложения для ЦС A.niger.

На данный момент знания о ЦС из штаммов гриба A.niger ограничиваются лишь структурой гена с предполагаемой промоторной областью, некоторыми биохимическими

характеристиками, адекватность которых таковым in vivo до сих пор находится под вопросом.

После секвенирования геномов некоторых штаммов A.niger был предпринят ряд попыток повысить продуктивность гриба по ЛК посредством внесения изменений в его геном, которые, к сожалению, в большинстве своем оказались безуспешными.

Представление о развитии интереса в научном сообществе к ЦС дает график количества публикаций рис.1, в которых используется термин "citrate synthase". Рисунок1. Статистика упоминания термина 'citrate synthase' в научной литературе

PubMEd Google Scholar ScienceDirect

Л>

О* О* О* О* Q> Qj

V .Of of Of Of of

&

^

"F

Годы

В нашей работе впервые проведено исследование ЦС из отечественного промышленного гриба-продуцента A.niger штамм Л-4, в частности идентификация кодирующих ее генов, получение их копий, определение экспрессионного профиля ЦС, а также биохимических характеристик.

Оценка экспрессии гена цитратсинтазы, тем более в динамике ферментации цитрата, сопоставление структуры гена ЦС с геном дикого штамма, выделенного из почвы, изменение активности фермента в ходе ферментационного процесса, возможные пути регуляции ЦС и реализации этого воздействия – ничего из того, что было приведено в данной диссертационной работе, в литературе, посвященной ЦС гриба A.niger, найдено не было.

Цель и задачи. Целью диссертационной работы является изучение генетических и биохимических характеристик цитратсинтазы для определения её вклада в механизм сверхсинтеза лимонной кислоты грибом А.niger Л-4. Для реализации указанной цели поставлены следующие задачи:

1. Разработка эффективной методики разрушения клеток гриба А.niger Л-4 с целью выделения нуклеиновых кислот и белков.

2. Оптимизация методики выделения нуклеиновых кислот, качественно пригодных для проведения молекулярно-генетических исследований из данного биообъекта.

3. Получение гена ЦС посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) из продуцента и дикого штамма А.niger.

4. Секвенирование гена ЦС, обработка полученных нуклеотидных последовательностей, выявление характеристических особенностей, идентификация потенциальных сайтов пост-трансляционных модификаций ЦС с привлечением биоинформатиче-ских методов.

5. Биоинформатическая обработка данных, с целью выяснения характеристик синтеза, созревания, транспорта и регуляции белка ЦС, особенностей пространственной организации фермента.

6. Определение профиля экспрессии гена ЦС в динамике ферментации.

7. Оптимизация метода аффинной хроматографии для выделения и очистки белка ЦС из клеток гриба А.niger Л-4.

8. Определение биохимических характеристик белка, а также анализ динамики изменения активности ЦС в ходе ферментации.

Научная новизна. Полученные в работе данные являются новыми. Впервые проведен анализ экспрессии гена ЦС промышленного продуцента A.niger Л-4, полученного во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевых добавок (ВНИИПД), в динамике ферментации ЛК. Полученный экспрессионный профиль сопоставлен с динамикой активности фермента в ходе биосинтеза и аккумуляции ЛК.

Впервые для гриба A.niger Л-4 была получена нуклеотидная последовательность гена ЦС, сопоставлена с последовательностью дикого штамма, выделенного из почвы, и другими штаммами из баз данных. С привлечением методов биоинформатики проведена работа по поиску точек приложения регуляторного воздействия на ген и белок ЦС, путей реализации такого воздействия, что в литературе не описывалось. В работе обобщен материал за 40 лет исследований метаболизма грибов, что позволило в некоторой степени объяснить феномен сверхсинтеза ЛК.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют существующие знания о гене и ферменте синтеза ЛК из гриба A.niger, открывают перспективы дальнейших исследований ЦС и метаболического пути, ведущего к аккумуляции цитрата. Это может быть использовано для усовершенствования как условий ферментации продуцента, так и его самого с целью увеличения выходов ЛК.

Прикладная значимость работы—методика определения активности ЦС в бесклеточных гомогенатах может быть использована для мониторинга жизнедеятельности и биосинтетической активности продуцента в ходе ферментации ЛК. Разработанная научно-методическая база может быть использована для создания и реализации стратегии увеличения биосинтетической способности по целевому продукту промышленного продуцента A.niger Л-4.

Методология и методы исследования. С целью исследования гена и белка ЦС гриба A.niger Л-4 были разработаны и оптимизированы методы разрушения мицелия, выделения и очистки нуклеиновых кислот и белков. Для выяснения характеристик гена и белка ЦС были применены молекулярно-генетические и биохимические методы исследования. Экспериментально наиболее сложные и труднореализуемые части исследования: определение пространственной структуры и ключевых областей белковой молекулы, идентификация сайтов ПТМ белка, его транспорта и процессинга — были осуществлены с помощью био-информатических программных средств.

Положения, выносимые на защиту:

1. Уровень экспрессии гена цитратсинтазы гриба-продуцента A.niger Л-4 и её каталитическая активность изменяются в ходе культивирования в условиях ферментационного процесса.

2. Регуляция цитратсинтазы гриба A.niger штамма Л-4 реализуется как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровнях.

3. По данным биоинформатических исследований установлены потенциальные пути реализации контроля цитратсинтазы гриба A.niger штамма Л-4.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность и обоснованность результатов диссертационной работы обеспечена применением адекватных и современных биохимических и молекулярно-генетических методов, достаточным объемом выборок, а также статистической обработкой полученных данных.

Основные результаты диссертационной работы представлены на конференциях с международным участием «Молодая фармация–потенциал будущего», «Инновации в здоровье нации» ежегодно начиная с 2013г., на VIII Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2015г., на VIII международной заочной научно-практической конференции «21 century: fundamental science and technology» США, Северный Чарльстон.

Тематика работы была поддержана грантом Фонда содействия инновациям УМНИК.

По материалам и основным результатам диссертационного исследования опубликовано 12 работ, 3 из которых в рецензируемых журналах перечня ВАК.

Личный вклад автора. Осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании и проведении экспериментов, обработке и обсуждении полученных результатов, написании статей и тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 2 глав собственных результатов исследования, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 134 страницах, иллюстрирована 11 таблицами, 39 рисунком. Библиография включает 294 литературных источника.

Молекулярно-биологические характеристики цитратсинтазы

После поступления из внешней среды в ци-тозоль, глюкоза и/или фруктоза фосфорилиру-ются с образованием глюкозо-6-фосфата и/или фруктозо-6-фосфата, которые являются ключевыми точками разветвления гликолиза, синтеза внутриклеточных запасающих соединений, синтеза компонентов клеточной стенки и пентозо-фосфатного пути. Фруктоза фосфорилируется гексокиназой, а глюкоза фосфорилируется либо глюкокиназой, либо гексокиназой [15]. Гены обоих этих ферментов A. niger были клонированы и охарактеризованы [40,41]. На основании свойств этих двух ферментов было предположено, что на глюкокиназу приходится большая часть фосфорилированной глюкозы при рН 7,5, в то время на гексокиназу приходится больше фос-форилированной глюкозы при рН 6,5 при ее концентрации более 0,5 мМ [41]. Далее фосфорили-рованная глюкоза через гликолитический путь в цитозоле превращается в пируват. Одна молекула пирувата декарбоксилируется с образованием ацетил-КоА посредством митохондриального пируватдегидрогеназного комплекса, а другая кар-боксилируется до оксалоацетата в цитозоле пируваткарбоксилазой. Оксалоацетат транспортируется в митохондрии (через малат) и конденсируется в ЦТК с ацетил-КоА посредством цитрат-синтазы с образованием цитрата. Последний транспортируется из митохондрий в цитоплазму и далее во внеклеточное пространство [15,23,42].

В этом процессе цитратсинтаза является ключевым ферментом, который помимо своей прямой синтетической функции имеет еще и ряд других, в частности, он осуществляет регуляцию цикла Кребса, а также способствует транспорту цитрата из митохондрий в цитоплазму [7]. Реакция, катализируемая этим ферментом, играет важную роль в -окислении жирных кислот, а у растений также в фото-респираторном гликолятном пути [43]. Цитрат для клетки гриба A. niger имеет огромное физиологическое значение, являясь энергетическим субстратом, являясь интер-медиатом в реакциях синтеза аминокислот и жирных кислот, энергетическим субстратом, переносчиком ацильной группы, а также играет регуляторную роль, хелатно связывая некоторые субстраты и коферменты, к примеру, ионы Mg2+ и других бивалентных металлов, необходимые для катализа [44]. Помимо физиологического, цитрат имеет большое биологическое значение, выделяясь во внешнюю среду и понижая рН, тем самым в диких условиях уменьшая конкуренцию за питательные ресурсы со стороны других микроорганизмов, ингибируя их рост. Широко известно, что цитрат и другие низкомолекулярные двухосновные органические кислоты (НМОК), продуцируемые грибами, обладают способностью к хелатному связыванию металлов, что имеет большое значение для растворения и поглощения минерального фосфора из среды, посредством комплексообразования с Ca2+ [45]. Цитрат также играет существенную роль в разложении древесины и природном распаде лигнина [4,46,47]. Таким образом сверхсинтез лимонной кислоты дает грибам продуцентам НМОК ощутимые преимущества в природе по сравнению с другими орга-низмами-сапрофитами. Этими фактами объясняется природная способность гриба A. niger к синтезу цитрата в количествах, превышающих необходимые для клетки.

Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста гриба-продуцента минеральными компонентами среды (фосфором, ионами Fe, Mn, Си, Zn) и одновременном избыточном содержании источника углерода. Однако высокая концентрация цитрата была бы губительна для клетки, если бы не эффективность системы элиминирования избытка цитрата. В ходе процесса ферментации рН от начального значения 6.8 - 7.2 может снижается до исключительно низких 3.0 и менее 2.0, в то время как внутри клетки поддерживается постоянное близкое к нейтральному значение рН 7.5 (концентрация внутриклеточного цитрата величина довольно постоянная и колеблется от 2 до 3 мМ) [15,48]. Это достигается благодаря наличию процесса, протекающего параллельно синтезу цитрата (см. рис. 1-2). Посредством цитратного челночного механизма, при повышении концентрации цитрата в матриксе митохондрий, он переносится через внутреннюю мембрану по градиенту концентрации белками переносчиками — специализированной транспортной системой, включающей трикарбоксилатный переносчик - citrate carrier (CIC, СС) [44,49].

Преодолев наружную мембрану митохондрии посредством простой диффузии и попав в цитозоль, цитрат распадается в реакции, катализируемой АТФ-зависимой цитратлиазой. В результате этой реакции образуется оксалоацетат, возвращающийся в митохондрию, и цитозоль-ный ацетил-КоА, вступающий в реакции синтеза и активации жирных кислот, протекающие в цитоплазме [15,42]. Этот процесс «утилизации» цитратлиазой лимонной кислоты наиболее выражен в фазе роста гриба, когда происходит наиболее активное накопление биомассы, это объясняется тем, что клеточная стенка гриба помимо полисахаридов содержит большое количество жиров [50,51]. Последний механизм регуляции содержания ЛК в клетках состоит в удалении цитрата из клетки во внешнюю среду через проницаемую для него клеточную стенку.

Цитратсинтаза — митохондриальный белок, кодируемый ядерными генами и осуществляющий свои функции в матриксе митохондрий [33]. Биосинтез матричной РНК осуществляется в ядре, после чего транскрипт транспортируется в цитоплазму, где на рибосомах шероховатого эн-доплазматического ретикулума (ШЭПР) происходит синтез полипептида, далее подвергающегося созреванию. Транспорт в митохондрии кодируемых в ядре белков происходит посредством различных механизмов, локализованных на внешней и внутренней мембранах митохондрий. Компоненты внешней мембраны, которые ответственны за рекогницию препротеинов и их перенос через внешнюю мембрану, организованы в единый мультикомпонентный ТОМ – (translocase of the outer membrane) комплекс [52,53]. Препротеины распознаются специфическими рецепторами импорта и связываются с субъединицами ТОМ–комплекса, далее они транспортируются к белок-специфичному проводящему каналу, также известному как главная пора импорта/инсер-ции GIP (general import/insertion pore), которая транслоцирует белки через внешнюю мембрану митохондрии [52,54]. Далее перенос белка внутрь/из митохондрии осуществляется посредством двух механизмов, TIM – (translocase of the inner membrane) комплексов, локализованных на внутренней мембране и специфичных для различных групп белков. Посредством TIM-комплексов зрелый белок импортируется в митохондрии, где и выполняет свои функции [52,55,56].

Стоит, однако, заметить, что транспорт протеинов через митохондриальные мембраны посредством ТОМ- и TIM-комплексов изучен только у таких грибов как N. crassa и S. cerevisiae. Определение основных характеристик этих транспортных комплексов у грибов, в частности у A. niger, является задачей будущих исследований, что поможет пролить свет на регуляцию экспорта/импорта белков и пептидов через митохондриальные мембраны, а это в свою очередь может открыть новые взгляды на регуляцию метаболических путей как в митохондриях, так и в клетках в целом.

Структурная организация цитратсинтазы

Нуклеотидные последовательности, кодирующие гены цитратсинтазы, были извлечены из базы данных NCBI (США) посредством поисковой системы ENTREZ. Аннотации к нуклеотид-ным и аминокислотным последовательностям генов цитратсинтазы, а также их особенности (features) были извлечены из базы данных NCBI и из литературных источников. Полученная нук-леотидная последовательность компьютерными методами была транслирована в аминокислотную и подвергнута дальнейшему анализу с помощью программных средств.

Наиболее общие свойства и характеристики цитратсинтазы из гриба A. niger штамм Л-4 были выяснены с помощью STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), представляющей собой интерактивную БД, агрегирующую данные из множества ресурсов, включающих в себя экспериментальные данные, методы копьютеризированного предсказания и литературные источники. STRING, охватывая данные по почти 10 миллионам протеинов из более чем 2000 организмов, позволяет выявлять и предсказывать функциональные и в меньшей степени структурные белок-белковые взаимодействия [98,99].

Цитратсинтаза, как правило, обнаруживается в митохондриях, однако у дрожжей, растений и некоторых грибов были обнаружены изоформы, локализованные в пероксисомах и цитозоле. В работе Рюйтера [48] было показано, что помимо митохондриальной транспортной последовательности MTS (mitochondrial targeting sequence) в аминокислотной цепи содержится пероксисо-мальная сигнальная последовательность. Ввиду этого было решено протестировать первичную последовательность белка ЦС на наличие возможных сигнальных последовательностей и сайтов ограниченного протеолиза.

C целью обнаружения N-концевой MTS и сайта ее отщепления при созревании белка было использовано специализированное программное средство MITOPROT [100]. Данные полученные с помощью MITOPROT подтверждали с помощью комплексного программного обеспечения TargetP 1.1 [101], предназначенного для предсказания локализации эукариотических протеинов по наличию или отсутствию в N-концевой части их аминокислотной последовательности сигнальных пептидов: хлоропластного транзитного пептида – cTP (chloroplast transit peptide), мито-хондриального адресного пептида (mitochondrial targeting peptide) – mTP и секреторного сигнального пептида (secretory pathway signal peptide) – SP.

Однако представленные программные решения не позволяют проверить полученную последовательность ЦС на наличие или отсутствие пероксисомального или иного сигнального мотива, кроме указанных выше. С целью разрешения данной неопределенности было решено использовать Target Sequence Predictor и PTS1 predictor [102], ориентированные на идентификацию пероксисомальных сигнальных мотивов у эукариот [103].

Аминокислотную последовательность ЦС также тестировали на наличие аргининовых и лизиновых пропептидных сайтов протеолиза посредством ProP 1.0 [104], а также на наличие сигнальных и несигнальных пептидов и различных сайтов расщепления с помощью SignalP 4.1 [105].

C точки зрения физиологии клетки и биохимии ЦС наиболее важными в регуляции активности фермента могут быть пост-трансляционные модификации (ПТМ) белка, связанные с кова-лентной модификацией боковых радикалов аминокислотных цепей. С целью выявления возможных ПТМ было решено протестировать первичную последовательность ЦС на наличие вероятных сайтов ковалентной модификации: фосфорилирования, метилирования, ацетилирования, сукцинирования, убиквитинирования, гидроксилирования и др.

Несмотря на то, что все вышеперечисленные ПТМ, встречающиеся в белках и полипептидах, известны довольно давно, предсказание соответствующих сайтов модификации по аминокислотной последовательности в качестве единственного вводимого данного до сих пор остается нетривиальной задачей [106–108].

Фосфорилирование является наиболее часто встречающейся ПТМ белков, по последним оценкам до 30% всех белков в клетках эукариот регулируются посредством фосфорилирования [108]. В данном случае модуляция функций и активности белков осуществляется посредством присоединения отрицательно заряженной фосфорной группы к сериновым (S – Ser), треонино-вым (T – Thr) или тирозиновым (Y – Tyr) остаткам, что в свою очередь может изменять конфор-мацию белковой молекулы, что в конечном счете влечет за собой изменения биохимических характеристик [109].

Традиционно сайты фосфорилирования в белках идентифицируют экспериментальными техниками, посредством тандемной масс-спектрометрии (MS/MS) [110]. Однако данный подход, основанный на MS/MS встречает массу технических трудностей, помимо этого сама процедура масс-спектрометрии дорога, сложна, трудозатратна и не позволяет полностью картировать фос-фопротеом клетки, упуская транзиентно фосфорилируемые и малораспространённые белки [110,111].

В виду этого, а также с увеличением доступности секвенирования разработка и использование программных средств предсказания сайтов фосфорилирования в белках приобретает особую важность [108]. Подходы к предсказанию сайтов фосфорилирования можно разделить на два больших класса: киназа-специфический подход и общий (киназа-неспецифический). Киназа-специфический метод ориентирован как на предсказание сайта фосфорилирования, так и на распознание специфической киназы (или их групп), осуществляющей данную модификацию. Общий же подход направлен на идентификацию предполагаемого сайта модификации безотносительно специфики той или иной киназы. Результаты общего подхода аналогичны получаемым с помощью MS/MS. Предсказательная способность киназа-специфических методов зачастую ограничиваются лишь небольшим числом киназ, это объясняется тем, что известные киназы соответствуют менее, чем 3% всех аннотированных сайтов фосфорилирования [112].

В данной работе для идентификации сайтов фосфорилирования (а также некоторых других) ЦС были использованы оба подхода, реализованные с помощью различных программных средств на базе искусственных нейронных сетей (ИНС), метода опорных векторов (SVM – Support Vector Machine) и RF (random forest) алгоритме "случайного леса": NetPhos 2.0 [113], NetPhosYeast 1.0 [114], NetPhorest 2.0 [115], PhosphoSVM [116], KinasePhos 2.0 [117,118], GPS 3.0 [106,119].

Стоит отметить, что некоторые из использованных программных средств проводят прогнозирование сайтов фосфорилирования чисто формалистически, т.е. без учета возможной топологии вторичной структуры полипептидной цепи. Идентифицированные таким образом сайты модификации могут иметь все признаки реальных: паттерны окружающих аминокислот, их соотношение и состав и т. п., но в действительности такой сайт фосфорилирования будет пространственно недоступен для протеинкиназы, осуществляющей "пришивание" фосфорной группы к S/T/Y остаткам [107]. Следовательно, это ложно положительное предсказание. С целью исключения ложноположительных результатов с помощью приложения NetSurfP [120] был проведен расчет доступности тех или иных аминокислотных остатков как для растворителя (accessible surface area – ASA), так и для возможных ПТМ, и в дальнейшем подтвержден результатами гомологического моделирования третичной структуры ЦС гриба. Полученные паттерны доступности в дальнейшем были использованы для выявления ложно идентифицированных сайтов ПТМ [107].

Ацетилирование гистонных белков было открыто более 50 лет тому назад [121] и долгое время ассоциировалось с регуляцией структуры хроматина [122]. Однако последние протеомные исследования показали, что по меньшей мере 2000 белков в клетках млекопитающих содержат почти 5000 сайтов ацетилирования [123–126]. Протеины, являющиеся субстратами для ацетили-рования по остаткам лизина, сосредоточены не только в ядре, но и практически во всех компарт-ментах клетки, в т.ч. митохондриях [123–126]. Помимо ацетилирования боковая цепь лизина является также является сайтом множества модификаций, как то: убиквитинирования, метилирования, пропионилирования и пр. [127–129]. В ряде работ было показано, что в таком случае может существовать как конкуренция за лизиновый сайт, так и своего рода кооперативный эффект – перекрестные воздействия [109,126,130–133]. Обобщая все выше сказанное, можно отметить, что механизмы, посредством которых происходит ацетилирование лизина, могут программировать белковые функции [134]. А высокая консервативность К-Ас сайтов предполагает, что аце-тилирование лизина находится под действием положительного давления (естественного) отбора в силу существенности его функций [126].

Ким и др. [123] в своих исследованиях показал, что ацетилирование лизина (К-Ас) является широко распространенной ПТМ в особенности среди митохондриальных белков и ферментов метаболизма. В частности Лю и др. [126] было обнаружено, что у млекопитающих и дрожжей домен, в который входит семейство цитратсинтазных ферментов, также имеет К-Ас ПТМ [135]. Помимо этого было обнаружено, что чаще всего К-Ас сайты встречаются в -спиралях [126], в тоже время известно, что ацетилирование лизина дестабилизирует -спирали, что в свою очередь может отвечать за изменения в паттернах фолдинга более высоких порядков [136,137].

Факты приведенные выше указывают на то, что ацетилирование лизина может иметь место и в случае ЦС гриба и потенциально осуществлять регуляцию активности фермента, как само по себе так и чрез взаимодействие с другими окружающими сайтами фосфорилирования, метилирования и убиквитинирования [126].

Для идентификации сайтов ацетилирования был использован ряд программных средств, реализующих компаративный подход к анализу специализированных БД, ИНС, SVM- и RF-алгоритмы: CPLM 1.0 [138,139], NetAcet 1.0 [140], LAcep [141], PSKAcePred [142], PAIL [143], ASEB [144–146].

Разработка и оптимизация методов разрушения клеток гриба Aspergillus niger

По полученным в результате секвенирования нуклеотидным последовательностям была выведена аминокислотная последовательность, сопоставленная с имеющимися в аннотированных базах данных PDB и UniProt, что подтвердило соответствие белку цитратсинтазе.

По полученной программными методами первичной структуре белка ЦС был проведен поиск сигнальных последовательностей, транспортных мотивов и сайтов расщепления, ограниченного протеолиза, и др.

Анализ аминокислотной последовательности ЦС посредством программного средства MITOPROT [100], специализированного на поиске и предсказании митохондриальных транспортных мотивов, показал, что в ней с 96% вероятностью содержится специфическая митохон-дриальная адресная/транспортная последовательность MTS (Mitochondrial Targeting Sequence):

MASTLRLGTSALRSTSIAAKPVVQSAAFNGLRCYS, состоящая из 35 аминокислот, обогащенная основными, и, судя по высокому алифатическому и среднему значению индекса гидрофобности GRAVY (Grand average of hydropathicity) 92,06 и 0,350, соответственно, обладающая амфифильными свойствами (см.п. 3.1.5.2). Сайт расщепления подчеркнут и отмечен вертикальной чертой. Полученные данные по сигнальным последовательностям были подтверждены проверкой с помощью комплексного программного средства TargetP 1.1 Server [101], которое также показало отсутствие в аминокислотной последовательности ЦС иных сигнальных мотивов. Однако эти данные вступают в противоречие с работой Рюйтера и др. [48], в которой было показано, что первичная последовательность ЦС помимо MTS содержит пероксисомальную сигнальную последовательность PTS (Peroxisomal Targeting Sequence) AKL на С-хвосте. Поэтому было решено провести целенаправленный анализ молекулы белка ЦС гриба A. niger на наличие PTS с привлечением программного обеспечения, включающего в себя алгоритмы MEME [229] и BLOKS [230,231], специализированные на поиске PTS.

К настоящему времени у большинства эукариот идентифицировано три разновидности PTS: две из них PTS1 и PTS2 ответственны за транспорт протеинов в матрикс пероксисом, третья PTS19BS указывает на пероксисомальную мембранную локализацию белка (см. рис. 3-8). В зависимости от разновидности сигнального пептида, который несет на себе белок, он транспортируется в пероксисомы тремя возможными путями, через Pex5 — рецептор PTS1, Pex7 — рецептор PTS2 и Pex19 — мембранный белковый рецептор см рис.29. PTS1 — это наиболее распространённый и эволюционно высококонсервативный сигнальный мотив, представляющий собой консенсусный трипептид S/A-K/R-L/M. Впоследствии данный мотив был расширен до 12 С-концевых аминокислотных остатков: С-концевой трипептид; тетрапептидный участок взаимодействия с рецептором Pex5, отстоящий от трипептида в сторону N-головы, и полярный, доступный для растворителя неструктурированный регион, выполняющий линкерную функцию [103]. Различия в PTS, характерных для грибов и других таксонов, заключены в основном в превалирующем аминокислотном составе трипептида и различиях в паттернах гидрофобности в линкерном регионе [103]. Исходя из всего выше сказанного очевидно, что вероятность обнаружения PTS (случайного или нет) в аминокислотной последовательности снижается, т.к. требования к истинности мотива значительно возрастают (помимо самого состава трипептида, появляются дополнительные требования в виде необходимости тетрапептида связывания, а также линкерной области со специфическими аминокислотными составами), что и было подтверждено программным средством Target Signal Predictor. По всей видимости, локализованная в хвосте AKL последовательность, соответствующая PTS1, является не более чем случайным совпадением, на что указывает высокое значение комплексного параметра оценки E-value 0,61, которое, впрочем, отчасти можно отнести к влиянию малой длины выравниваемых фрагментов в алгоритме BLOKS. Результаты, полученные с помощью программы PTS1 Predictor [102] и анализа БД PROSITE относятся к результатам, находящимся в области высокой вероятность ошибки предсказания. Тем не менее полностью отрицать отсутствие пероксисомального сигнального мотива в аминокислотной последовательности ЦС гриба A. niger нельзя [232], несмотря на то, что в литературе нет экспериментальных подтверждений немитохондриальной локализации данного фермента у грибов вида A. niger [233].

Помимо этого, аминокислотная последовательность ЦС гриба была протестирована посредством ProP 1.0 [104] и SignalP 4.1 [105] на наличие иных сигнальных последовательностей и сайтов протеолиза, в частности общего Arg(R)/Lys(K) мотива протеолитического расщепления препротеинов, характерного для пост-трансляционной модификации секреторных биологически активных полипептидов и энзимов [101]. Иных сигнальных последовательностей и мотивов расщепления, кроме найденного выше митохондриального обнаружено не было.

В первичной последовательности ЦС гриба с помощью ряда инструментальных программных средств ExPASy Proteomics tools (http://www.expasy.org/proteomics) не было обнаружено сайтов модификации анкорными группами, однако по проанализированным данным БД PROSITE было предсказано наличие возможных сайтов миристоилирования и гликозилирования, что может указывать на то, что белковая молекула хотя и не заякорена жестко в мембране, но имеет примембранную локализацию и по всей видимости может быть слабо ассоциирована с ее микродоменами [60,234,235]. В этом случае наиболее вероятной представляется ассоциация ЦС с внутренней поверхностью внутренней мембраны митохондрий, реализованная за счет электростатических и/или слабых и гидрофобных взаимодействий с интегральными и/или периферическими белками и/или липидными рафтами [236].

C точки зрения физиологии клетки и биохимии ЦС наиболее важными в регуляции активности фермента могут быть пост-трансляционные модификации, связанные с ковалентной модификацией боковых радикалов аминокислотных цепей (фосфорилирование, метилирование, сук-цинилирование, ацетилирование, убиквитинирование, гидроксилирование).

Идентификация сайтов ПТМ была проведена с использованием программных средств и методов, описанных в п. 2.4.6.1. Результаты идентификации представлены в сводной таблице в Приложении В с ранжированием предсказаний по уровням значимости. На рис. 3-9 представлено расположение предсказанных сайтов ПТМ на схеме белка ЦС (красным обозначена область ми-тохондриальной сигнальной последовательности – MSPS /Mitochondrial signaling peptide sequence/, голубым обозначены области взаимодействия субъединиц димеров – DI /Dimer interaction/, синим – участки, входящие в области активного сайта или сайтов связывания субстратов – A/BS /Active/Binding Site/).

Результаты биохимической части исследования

Как было указано в п. 2.5.2.3 кинетическая характеристика фермента была изучена в условиях максимально приближенных к условиям in vivo [269], в бесклеточных гомогенатах при рН 7,5. Для обоих субстратов ЦС, ацетил-КоА и оксалоацетата, наблюдалась гиперболическая кинетика. Кажущиеся значения константы Михаэлиса для ацетил-КоА составляли 29 мкМ (при 0,5 мМ оксалоацетата, рН 7,5), для оксалоацетата 9 мкМ (при 0,3 мМ ацетил-КоА, рН 7,5).

Полученные кинетические характеристики ЦС хорошо согласуются с данными для других штаммов A. niger, описанных в литературе [48,78,269], однако существенно отличаются от цит-ратсинтаз из представителей других таксонов [194,195,197,270]. Данные значения констант Ми-хаэлиса для двух субстратов фермента находят подтверждение в теории Йоханссона и Петтер-сона [271,272] о последовательном механизме функционирования ЦС, т.е. оксалоацетат, имея более высокое сродство к активному центру фермента, присоединяется первым и увеличивает тем самым константу связывания ацетил-КоА [272,273].

Стоит отметить также тот факт, что функционирование фермента по данному механизму несколько затрудняет определение значений константы Михаэлиса для субстратов, а также других кинетических параметров, что объясняется достаточно высокой сложностью и громоздкостью получаемых уравнений для скорости реакции и констант скоростей [216,274]. Помимо этого, имеются методические сложности, обусловленные возможным ингибированием фермента продуктом или продуктами реакции; использование сопряженных ферментативных систем для решения данной проблемы, влечет за собой усложнение эксперимента, появление новых трудно-учитываемых в расчетах погрешностей, а также увеличение вероятности появления случайных и систематических ошибок [215,216,274]. Также не стоит упускать из виду тот факт, что оксало-ацетат в растворах существует в ионизированной форме, для которой характерно наличие кето-енольной таутомерии, однако только кето-форма этого соединения является истинным субстратом для ЦС. Факт того, что обе формы оксалоацетата существуют в таутомерном равновесии, сам по себе ставит проблему определения истинной концентрации субстрата фермента, т.е. кето-формы, в таких сложных системах как многокомпонентные буферные смеси и тем более бесклеточные гомогенаты, в которых некоторая его часть неизбежно связывается с белками.

Тем не менее полученные результаты возможно сравнивать с данными других исследователей, хотя и принимая во внимание некоторые вышеозначенные сложности и ограничения. Глава 4. Обсуждение результатов исследования

В настоящей работе были изучены молекулярно-генетические и биохимические характеристики цитратсинтазы из гриба-продуцента лимонной кислоты A. niger штамм Л-4.

С целью определения генетических характеристик ЦС была оптимизирована методика выделения рибонуклеиновых кислот из мицелия гриба. Данная методика является модификацией фенол-хлороформной техники выделения РНК/ДНК Хомчинского [91]. Основной сложностью при выделении РНК стало наличие жесткой хитин-глюкановой клеточной стенки, которая помимо нерастворимых полисахаридов обогащена жирами, стеринами, всё это в сочетании с морфологическими особенностями гриба продуцента, культивируемого в условиях глубинной ферментации, а именно жесткая плотно переплетённая пеллетная морфология вегетативного тела гриба в отличие от воздушного и пр. видов мицелия сильно затрудняет его полную гомогенизацию и деструкцию клеток. Помимо этого, выделение тотальной РНК затруднено высокой активностью мощной внутриклеточной нуклеазной системы гриба. С данными проблемами также столкнулись авторы статьи [275]. В данной публикации для выделения и анализа РНК было использовано автоматизированное биоаналитическое оборудование, с помощью которого было показано, что время существования выделенной РНК не превышает минуты, после чего происходит полная деградация фракции. Бернштайном и др. [87] было показано, что для 80% мРНК тран-скриптов E.coli время полужизни находится в диапазоне от 3 – 8 мин, в то время как большинство транскриптов генов из эмбриональных стволовых клеток мыши имеют время полураспада 7 часов и лишь небольшая популяция генов распадается менее, чем за 1 час [88]. Столь высокая лабильность РНК, и мРНК фракции в особенности, из A. niger помимо нуклеазной активности может быть объяснена структурными особенностями транскриптов [88], что однако требует экспериментального подтверждения.

Все вышеприведённые препятствия, а также свойственная мРНК высокая лабильность и не стопроцентная эффективность ингибиторов РНКаз значительно затрудняли проведение работы, однако не стали непреодолимым препятствием. В конечном счете были получены препараты тотальной РНК, хотя и содержащие остаточные загрязнения в виде протеинов, жиров, нерастворимых солей и полисахаридов, однако пригодные для проведения дальнейшей ОТ-ПЦР. В работе было показано, что некоторое загрязнение комплексов нуклеиновых кислот и полисахаридов гуанидиновыми солями и жирами не сказывается на эффективности прохождения ПЦР и некоторых других молекулярно-генетических операциях [276].

В генетической части исследования посредством ОТ-ПЦР были получены копии гена ЦС, секвенированные впоследствии. Таким образом были получены сведения о нуклеотидной последовательности гена ЦС из штамма-продуцента и сопоставлены с таковыми для дикого штамма, а также для других штаммов, имеющихся в БД. В ходе исследования была выявлена почти полная идентичность цитратсинтаз из грибов вида A. niger и высокая степень сходства с ЦС организмов из других таксонов. Всё это свидетельствует о высокой консервативности структуры ЦС у эука-риот, что также может быть проиллюстрировано результатами оценки эффектов одноаминокис-лотных замен на функцию белка с помощью программного средства SNAP2 (https://rostlab.org/services/snap2web) рис. 4-1 (рамкой отмечена MTS и ниже показана увеличенная область, синим - нейтральные одноаминокислотные замены, не оказывающие эффекта на функциональность протеина, красным - оказывающие существенное воздействие). Наибольшие различия в структуре ЦС из различных организмов наблюдаются в линкерных областях, которым примерно соответствуют синие области на рис. 4-1. Рисунок 4-1 Оценка эффектов одноаминокислотных замен на функцию белка ЦС гриба A.niger.

На основе сопоставления полученной последовательности ЦС с аннотированными в БД, а также по результатам моделирования пространственной структуры белка были определены области, ответственные за связывание субстратов, составляющие поверхности взаимодействия диме-ров и активный центр фермента. Как и ожидалось в самой кодирующей последовательности ре-гуляторных элементов обнаружено не было.

Одной из главных задач диссертационной работы было построение экспрессионного профиля ЦС в динамике ферментации лимонной кислоты. Стоит заметить, что в изученной литературе подобных данных нет и, по-видимому, никто из исследователей такого рода задач перед собой не ставил, что само по себе удивительно. В имеющейся литературе вопрос об изменении экспрессии (количества транскриптов) ЦС либо обходился вниманием, либо гипотетизировалась конститутивность экспрессии, однако никаких за или против фактов или данных не приводилось.

С целью получения данных об уровне экспрессии гена ЦС была выбрана полуколичественная методика с оптической денситометрией — для реализации данного методического решения был подобран референсный ген, кодирующий yS-актин, и проведен необходимый этап оптимизации ПЦР.