Введение к работе
'
Актуальность проблемы.
Хронический миелолейхоз (ХМЛ) относится к числу неопластичесхих заболеваний, характеризующихся злокачественной трансформацией стволовых клеток-предшественников гсиопоэза.
Специфическим маркером ХМЛ является филадельфийская хромосома (РЪ), которая обнаруживается у 95% больных и возникает в результате реципрохнон транслокапяи t(?;22). Почти во всех случаях ХМЛ и в 50% случаев Ph'-ОЛЛ разрыв 22 хромосомы происходит в небольшом локусе МЪсг, размером 5.8 kb. В результате транслокации образуется "химерный* reHBCR/ABL, с которого считывается гибридная Ьсг/аЫ мРНК размером 8,5kb и синтезируется слитный белок Ьсг/аЫ р210.
Классический метод детектирования Ph'-хромосомы - цитогенетические исследования. Однако, обычное кариотвпнрованне без применения флуоресцентной in situ гибридизации является недостаточно чувствительным методом. Кроме того, существует 10% цотогенстнчесхи РЬ'-негативных ХМЛ, когда траяслокация на молекулярном уровне происходит, но бывает замаскирована вовлечением в неё других хромосом. Существующие молехул&рно-бнологическне методы детекции Ph'-хромосомы позволяют с большой точностью определить се присутствие в клетках крови и костного мозга и тем самым установить диагноз ХМЛ.
Наконец, существует еще одна причина для применения молехулзрно-биологических методов для изучения РЬ'-транслокаций. В зависимости от точки разрыва внутри локуса МЪсг образуются различные типы Ph'-хромосом, не отличимые на цитогенетичесхом уровне. В настоящее время в литературе широко обсуждается вопрос о возможной прогностической значимости зоны разрыва в МЪсг для характера протекания ХМЛ. Методы молекулярной диагностики, обладающие высокой чувствительностью, оказываются полезными не только дла диагностики ХМЛ и определения типа Ph'-хромосомы. С развитием кардинальных в интенсивных программ лечения они находят широкое применение для слежения за поведением лейкозного клона после применённого лечения. Успешные пересадки костного мозга и ннтерфероиотерапия приводят иногда к полной, но чаще к практически полной элиминации лейкозного клона. Для выявления "остаточного заболевания", т.е. тех лейхозных клеток, которые, несмотря на лечение остались и могу г начать вновь пролиферировать, представляя тем самым опасность нового витка болезни, методы молекулярной биологии являются незаменимыми. Для определения зоны разрыва внутри локуса МЪсг в гене BCR применяют методы блот-гибридязапии и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Цель работы - разработать и предложить для практического применения в клинике молекулярно-биологические методы диагностики Ph'-транслокапнй в оценить значение типов Ph'-транслохаіаш для характера протекания ХМЛ.
Задачи исследования:
-
Клонировать геномные ДНК-пробы для блот-гибридизационного анализа докусэ МЪсг у больных ХМЛ,
-
Синтезировать праймеры и наладить использование метода ПЦР для диагностики двух основных типов BCRMJ3L мРНК,
-
Определять типы РЪ'-траисдокацвй у больных ХМЛ, используя
-k-
методы блот-гибрщщзааяя и ПЦР и изучить зависимость стадий заболевания от типа Ph'-транслохацян,
4. Проанализировать возможность применения разработанных методо; для
оценки прогностической значимости типа Ph'-хромосомы для характера
протекания ХМЛ. ,
Научная новизна. Получены ДНК-пробы и применены для молекулярно-бяологнческойднапіостнЕиХМЛ. Для определения типа Ph'-транслокации разработан метод блот-гибриднзапии с применением только одного молекулярного зонда, что упрощіет и удешевляет этот анализ. Разработан модифицированный метод ПЦР с двумя парами праймеров для детекции двух основных типов BCR/ABL мРНК. Применяя методы блот-гибрнтизвпип н ПЦР, проанализированы типы РЬ'-транслокапяй у 41 больного ХМЛ и, совместно с сотрудниками Отделения химиотерапии лейкозов и патологии эрнтропа ГНЦ показано, что тин Ph'-Tj. інслокацни может иметь значение для прогнозирования характера течения ХМЛ.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Первой всесоюзной конференции Теаом человека", 1990, г.Псрсславль-Залесский, на Международной конференции патофизиологов, Москва, 1991.
В целом работа была апробирована на заседании проблемной комиссии "Экспериментальная гематология и биотехнология" ГНЦ РАМН 1 Еоабря 1993 года.
Практическая значимость. Разработанные молекулярно-бнологическве методы диагностики РЬ'-транслокацни при ХМЛ предложены для широкого внедрения в практическую медицину. Эти методы позволяют не только однозначно определять наличие РЬ'-транслокацин в клетках костного мозга и крови больных ХМЛ, но н детектировать тип траяслокации, что ьіокет иметь прогностическое значение. Кроме того, данные методы детекции Ph'-транслокапвй незаменимы при контроле за результатами лечения, в том числе после пересадок костного мозга. Поэтому мы убеждены, что молекулярно-биодогическне методы долзгаи найти широкое применение для детекции Ра'-трансжжащш при диагностике ХМЛ и контроля за лечением.
Положений, выносимьга из зшаату. Получена ДНК-проба на локус МЬсх, и разработаны системы определения типов РпЧрансяокацнй при ХМЛ -методами блот-габриддзавна с применением одного ДНК-зонда в 4х рестриктаз в поламеразвой пашой реакции на специфических праймер&х. Проведена геноднагиостика типа Рп'трансдокацни у 41 больного ХМЛ.
Публдкаиви. Материалы диссертации опублигованы в 5 научных работах.
Объем и структура диссертации. Диссертациа изложена на34 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы в методы исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы п список литературы. Список литературы содержит 78 ссыпогс на отечественные и зарубежные источники. Диссертация иллюстрирована вргсунхамг.