Введение к работе
Актуальность проблемы.
Нарушение иммунологических механизмов защиты организма приводит к появлению инфекционных осложнений, аутоиммунной патологии, развитию злокачественных опухолей и аллергических заболеваний. Вторичная иммунологическая недостаточность часто наблюдается при вирусных, паразитарных и некоторых бактериальных инфекциях, при истощении организма, длительном стрессе, при тяжелых травмах, ожогах, интоксикациях, при лечении онкологических больных химиотерапевтическими средствами и/или с помощью лучевой терапии, при длительном воздействии вредных факторов в процессе профессиональной деятельности или в неблагоприятных экологических условиях. Известно, что причиной развития вторичных иммунодефицитных состояний (ИДС) при генотоксических воздействиях в процессе химио- и радиотерапии является повреждение генетического материала иммунокомпетентных клеток. Механизмы же развития ИДС, наблюдаемых при многих заболеваниях внутренних органов и инфекционных заболеваниях, мало изучены и до сих пор не ясны.
В тоже время нарушение процессов репарации ДНК и повреждение структуры ДНК лимфоцитов под действием эндогенных метаболитов или лекарств также может быть причиной развития вторичных ИДС при различных заболеваниях, так как известно, что наследственные болезни, обусловленные различными дефектами в системе репарации ДНК (пигментная- ксеродерма, агаксия-телангиэктазия, анемия Фанкони) сопровождаются глубокими нарушениями в функционировании иммунной системы.
В настоящее время при исследовании иммунного статуса человека заключение о состоянии клеточного звена иммунной системы делается, как правило, на основании фенотипирования лимфоцитов периферической крови, что безусловно, отражает определенную динамику в изменении гомеостаза иммунной системы, но не всегда позволяет адекватно оценить ее состояние. Поэтому исследование механизмов развития вторичных ИДС и разработка новых доступных способов выявления патологических изменений в иммунокомпетентных клетках человека является крайне актуальной
задачей.
В последние годы были развиты новые методические подходы, позволившие предпринять исследование способности лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека к эксцизионной репарации ДНК и структуры ДНК этих клеток у здоровых людей и при изменении эндогенной среды организма при заболеваниях в качестве параметров, определяющих устойчивость этих клеток к повреждающим воздействиям и их способность к полноценному функционированию.
Целью диссертационного исследования явилось: Изучение молекулярно-биохимических механизмов развития вторичных иммунодефицитных состояний при действии различных экологических факторов, а именно: изучение способности лимфоцитов периферической крови человека к репарации ДНК и структуры ДНК лимфоцитов, а в отдельных случаях и гранулоцитов, у здоровых доноров и при широком спектре заболеваний, сопровождающихся развитием вторичных ИДС: при неспецифических заболеваниях легких, остром инфаркте миокарда, рассеянном склерозе, опухолевом процессе, некогрых инфекционных заболеваниях; повреждений ДНК, индуцируемых, используемыми при лечении онкологических заболеваний химиотерапевтическими препаратами, а также изучение роли антигенной нагрузки в формировании генетической нестабильности ЛПК крови при заболеваниях и механизмов этого явления в модельных экспериментах in vitro.
Для достижения этой цели были сформулированы и выполнены следующие задачи:
Основные задачи диссертационного исследования:
-
Разработать экспериментальную модель для оценки способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК.
-
Исследовать способность к репарации ДНК лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и больных при заболеваниях, сопровождающихся развититем вторичных иммунодефицитных состояний.
-
Исследовать уровень повреждений в ДНК лимфоцитов и иммунологические показатели у здоровых доноров и у больных при различных заболеваниях.
-
Исследовать структуру ДНК и молекулярно-биохимические механизмы ее
лабилизации при активации лимфоцитов периферической крови человека in vitro.
-
Изучить уровень повреждений ДНК лейкоцитов периферической крови при генотоксических воздействиях у больных, получающих химиотерапию по поводу онкологических заболеваний.
-
Разработать количественные критерии оценки степени повреждения ДНК лимфоцитов для выявления и диагностики эндогенных генотоксических воздействий и воздействия генотоксических факторов окружающей среды.
Научная новизна и теоретическая ценность полученных результатов.
Впервые изучена способность ЛПК к эксцизионной репарации ДНК и обнаружено ее снижение при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных НДС.
Впервые показано, что свежевыделенные ядросодержащие клетки крови здорового человека практически не содержат спонтанных разрывов ДНК. Установлены средние значения и пределы варьирования скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулоцитов у здоровых доноров.
Впервые обнаружено накопление повреждений в ДНК лимфоцитов при широком спектре заболеваний, сопровождающихся развитием вторичных ИДС и при вакцинации здоровых людей.
Сформулированы представления о роли антигенной нагрузки в развитии вторичных ИДС.
В модельных экспериментах впервые обнаружено, что одним из ранних событий при активации лимфоцитов мнтогенами in vitro является лабилизация структуры ДНК, регистрируемая по увеличеншо скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток.
Обнаружено, что ДНК интенсивно пролиферирующих лимфоидных клеток содержит значительно большее количество щелочелабильных сайтов, чем ДНК покоящихся клеток. Активация лимфоцитов in vitro приводит к быстрому увеличению количества щелочелабильных сайтов до уровня, наблюдаемого в интенсивно пролиферирующих клетках, за несколько часов до начала пролиферации лимфоцитов.
Впервые обнаружено, что лабилизация структуры ДНК при активации лимфоцитов сопровождается понижением концентрации цАМФ и активности олигоАсинтетазы и повышением активности казеинкиназ.
Показано, что поддержание структуры ДНК интактных лимфоцитов обеспечивается высокой внутриклеточной концентрацией цАМФ и олигоаденилатов, а также интерфероном аг и зависит от ресинтеза короткоживущих РНК и белков.
Впервые показано, что в индукции повреждений в ДНК лимфоцитов наряду с генерацией активных метаболитов кислорода важная роль может принадлежать специфическим цитотоксическим факторам, образующимся при активации лимфоцитов суперантигенами (стафилококковым знтеротоксином В, СЭВ).
При активации мононуклеарных лейкоцитов СЭВ впервые обнаружена секреция цитотоксических факторов, индуцирующих на поверхности клеток-мишеней экспрессию FAS-антигена и появление ОР в их ДНК.
На основе обнаруженных закономерностей сформулированы представления о новых, неизвестных ранее механизмах нарушения функций иммунокомпетентных клеток.
Практическая ценность результатов проведенной работы определяется тем, что:
- Установлены средние значения и пределы варьирования способности
лимфоцитов к репарации ДНК и скорости щелочной денатурации ДНК
лизатов лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови человека,
которые могут быть использованы в качестве контрольных уровней в
различных медико-экологических исследованиях.
- Разработанные количественные критерии оценки степени тяжести повреждения ДНК лейкоцитов периферической крови человека при заболеваниях, при иммунизации и при химиотерапии онкологических больных могут быть использованы в практической медицине при дифференциальной диагностике эндогенных и экзогенных генотоксических воздействий.
- Установленные параметры оценки степени тяжести повреждения ДНК
лимфоцитов по изменению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов
клеток могут быть использованы для количественной оценки тяжести
иммунотоксических реакций человека.
- Разрабртанные подходы и обнаруженные количественные закономерности могут быть использованы для создания скрининговых тест-
систем для количественной диагностики действия генотоксических факторов.
Апробация диссертационной работы.
Результаты, описанные в диссертации, были представлены на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллин, 1990); на 2-ом Всесоюзном съезде гематологов и грансфузиологов (15-18 октября 1985 г., Львов); на 1-ом Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987 г.); на 6-ом Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988 г.); на 3-ей международной конференции по фактору активации тромбоцитов, Токио, Япония 1989; на 1-ом Всесоюзном радиобиологическом съезде (21-27 августа 1989г., Москва); на 1-ом Всесоюзном съезде научного общества иммунологов (15-17 ноября, 1989 г., Сочи); на 1-ом Всесоюзном конгрессе по болезням органов дыхания (9-12 октября 1990 г., Киев); на конференции ISOBM (23-27 сентября, Москва); на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" (Минск, 1990); на Международном симпозиуме "Проблемы иммунофармакологии" (2-6 октября 1990 г., Тбилиси); на 2-ом Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (22-28 октября 1991 г., Самарканд); на Всесоюзном симпозиуме "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и при патологии" (6-8 сентября 1990 г., Новосибирск); на 5-ой Европейской конференции по онкологии (19-25 января, Мерибель-Моттаре, Франция 1997 г.).
По теме диссертации опубликовано 45 работ.
Структура и объем диссертации. Структура диссертации страдиционна. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результаттов и их обсуждения, общих выводов, указателя литературы, включающего 46 отечественных и 255 иностранных