Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы: 10
2.1. Индуцированная устойчивость: 10
2.1.1. Современные представления об индуцированной устойчивости 10
2.1.2. Элиситоры 13
2.1.3. Рецепторы элиситоров 20
2.2. Индуцированная восприимчивость: 24
2.2.1. Современные представления об индуцированной восприимчивости 24
2.2.2 Иммуносупрессоры 28
2.3. Роль салициловой кислоты в индуцировании устойчивости и восприимчивости растений 29
2.4.4.ФК и антиоксидантная система клеток: роль в индуцировании устойчивости и восприимчивости растений 40
3. Экспериментальная часть 49
3.1. Цель и задачи исследования 49
3.2 Объекты и методы исследования 50
3.2.1. Объекты исследования 50
3.2.1.1. Картофель 50
3.2.1.2. Возбудитель фитофтороза 50
3.2.1.3. Иммуномодуляторы 51
3.2.2. Методы исследования 54
3.2.2.1. Испытание биологической активности иммуномодуляторов 54
3.2.2.2. Выделение салициловой кислоты из тканей картофеля 55
3.2.2.3. Определение активности ферментов 56
3.2.2.4. Определение количества белка в ферментных препаратах 57
3.2.2.5. Определение ингибирования активности каталазы салициловой и янтарной кислотами... 57
3.2.2.6. Определение влияния ингибиторов НАД(Ф)Н-оксидазной сигнальной системы на устойчивость картофеля к возбудителю фитофтороза 58
3.2.2.7. Статистическая обработка данных 59
3.3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.3.1. Скрининг фракций хитозана 60
3.3.2 Определение концентрации хитозана, оптимальной для индуцирования устойчивости 65
3.3.3. Опеределение концентрации ламинарина, оптимальной для индуцирования восприимчивости 66
3.3.4. Иммуносупрессорная активность ламинарина 67
3.3.5. Влияние инфицирования P. infestans на содержание салициловой кислоты в тканях клубней картофеля 69
3.3.6. Влияние иммуномодуляторов на содержание салициловой кислоты в тканях картофеля 76
3.3.7. Влияние иммуномодуляторов на активность бензоат-2-гидроксилазы тканей клубней картофеля 78
3.3.8. Влияние инфицирования P. infestans на активность каталазы клубней картофеля 79
3.3.9. Влияние иммуномодуляторов на активность каталазы клубней картофеля 80
3.3.10. Ингибирование активности каталазы клубней картофеля салициловой и янтарной кислотами 82
3.3.11. Чувствительность к салициловой кислоте каталаз из тканей клубней картофеля, обработанных иммуномодуляторами 86
3.3.12. Перекись водорода как индуктор фитофтороустойчивости клубней картофеля 88
3.3.13. Гипотетическая модель индуцирования фитофтороустойчивости клубней картофеля 89
3.3.14. Влияние ингибиторов НАД(Ф)Н-оксидазной сигнальной системы на индуцирование фитофтороустойчивости клубней картофеля 92
3.3.15. Защитные свойства композиционного препарата 94
3.4. Выводы 98
4. Литература 100
- Современные представления об индуцированной устойчивости
- Роль салициловой кислоты в индуцировании устойчивости и восприимчивости растений
- Скрининг фракций хитозана
- Ингибирование активности каталазы клубней картофеля салициловой и янтарной кислотами
Введение к работе
Последние годы отмечены активным внедрением в сельское хозяйство инновационных технологий защиты и повышения урожайности растений, что обусловлено высокой поражаемостью культурных растений патогенами и вредителями, которые ежегодно уносят 20 - 40 % урожая (данные ФОС, 2004).
Как в нашей стране, так и за рубежом для сохранения урожая до сих пор еще применяются химические средства защиты растений -пестициды. Однако, обработка растений пестицидами - далеко не идеальный с экологической точки зрения способ фитопротекции. Именно «побочные эффекты» пестицидов заставляют исследователей искать альтернативные способы защиты растений. Большие надежды возлагаются на биологические средства защиты растений, и одним из эффективных и экологически безопасных таких методов является использование биогенных элиситоров для индуцирования естественной устойчивости растительных тканей (Метлицкий, Озерецковская, 1968, 1985; Метлицкий, 1973, 1976; Озерецковская, 2002; Cruickshank, Perrin, 1968; Кис, 1968, 1976, 1977, 1993; Albertsheimetal., 1975, 1985, 1992).
По сравнению с химическими методами защиты, действие элиситоров направлено не на уничтожение патогенов, а на швдуцирование иммунных свойств самого растения. Недостатком этого метода является относительно невысокая эффективность индуцирования устойчивости растений (не более 30-40% защиты). Поэтому познание механизмов действия элиситоров, которое, бесспорно, представляет интерес для фундаментальных основ биохимии и физиологии растений, тесно связана с попытками усовершенствования их защитного действия (Ильинская и др., 1991; Озерецковская, 1994, 2002; Тарчевский, 2002; Тютерев, 2002). Исследования механизмов индуцированной устойчивости показали, что ее формирование осуществляется в два этапа (Tolboys, 1958). Во время первого, называемого детерминантным, происходит взаимное распознавание партнеров, в результате чего и определяется, будет ли в растении реализован иммунный ответ. За детерминантной фазой следует экспрессивная, на которой включаются или не включаются (в случае совместимости партнеров) защитные механизмы устойчивости (Метлицкий, 1987; Озерецковская и др., 1982, 1987,2002).
К настоящему времени достаточно хорошо исследованы конечные продукты экспрессивной фазы: антибиотические вещества -фитоалексины, ингибиторы протеиназ, PR-белки, вещества, модифицирующие клеточную стенку растения и др. защитные средства (Деворолл, 1980; Кис, 1976; Keen, 1992).
Относительно исследованы начальные продукты детерминантной фазы: элиситоры, индуцирующие защитные ответы растений, токсины и супрессоры, препятствующие индуцированию устойчивости (Метлицкий и др., 1979; Озерецковская и др., 1987, 2001; Кис, 1976, 1993; Кис et al., 1977). В меньшей степени изучены рецепторы, взаимодействие которых с иммуномодуляторами определяет характер иммунного статуса растения: его активацию в случае взаимодействия элиситора с рецептором, или угнетение, в случае, если иммуносупрессор препятствует распознаванию элиситора рецепторами (Hang et al., 1994; De Wit et al., 1997; Ito et al., 1997).
На данном этапе значительные усилия фитоиммунологов направлены на исследование событий, происходящих между детерминантной и экспрессивной фазами. В основном, они включают систему внеклеточных и внутриклеточных сигналов, которые ишщиируются в сверхчувствительной — погибшей или погибающей клетке и приводят к экспрессии защитных белков, ответственных за реализацию собственно фитоиммунного ответа (Ильинская и др., 1991; Гречкин, Тарчевский, 1999; Тарчевский, 2002; Alvares et al., 1998; Alvares, 2000; Durrant, Dong, 2004; Suzuki et al., 2005).
Значительно меньше внимания исследователи уделяли и уделяют проблеме индуцированной восприимчивости растений, преодолению патогеном барьеров иммунного статуса растения-хозяина и существованию в природе антагонистов элиситоров -иммуносупрессоров.
Мысль о восприимчивости растений, индуцируемой патогеном, менее интересна по сравнению с индуцированием устойчивости, поскольку последняя связана с возможностью практического применения элиситоров. Предполагается, что в основе индуцированной восприимчивости растений лежит активное подавление патогеном или его метаболитами защитньгх механизмов растения - хозяина (Озерецковская и др., 1982; Васюкова и др., 1989; Озерецкоская, Васюкова, 2002; Heath, 1979, 1981, 1982; Ouchi, Oku, 1981, 1982; Ouchi, 1983).
Вопрос о том, что представляет собой процесс восприимчивости — супрессию иммунной зашиты растений, т.е. «выключение» зашнтных реакций, или индуцированную восприимчивость (специфический сигнальный путь, который включается супрессорами и делает невозможным развитие иммунного ответа) — до сих пор остается открытым. Выяснение механизмов не только индуцированной устойчивости, но и индуцированной восприимчивости создает предпосылки для разработки перспективной стратегии защиты растений. Рядом исследователей показано, что в процессе индуцирования устойчивости растений принимает участие салициловая кислота (СК) (Васюкова и др., 1999; Тарчевский, 2002; Meuwly et al., 1995; Molders et al., 1996; Yu et al., 1997; Coquoz et al., 1998; McDowell, Dungl, 2000; Alvares, 2002). Некоторые исследователи подразделяют пути формирования иммунных ответов растений на СК-зависимые и СК-независимые, которые функционируют в растительных тканях, взаимно влияя друг на друга и составляя комплексную сеть регуляторных взаимоотношений (Chen, Sylva, 1993; Lee, Leon, 1995; Yu, Liu, 1997; Kunkel et al.; 2002; Nibble et al., 2002). Однако до сих пор не существует достаточно ясных представлений о том, каким образом СК принимает участие в механизмах шпгуцирования устойчивости, и, тем более, восприимчивости растений (Lawton et al., 1995; Mur et al., 1996; Shirasu et al., 1997; Wees et al., 1997; Vidal et al., 1998; Chen, Klessig, 1999; Huckelhoven et al., 1999).
Современные представления об индуцированной устойчивости
В последние годы значительно возрос интерес исследователей к проблемам индуцированной, или приобретенной болезнеустойчивости растений, которую также называют иммунизацией. Приобретенная устойчивость основывается на временной экспрессии множества генов, и в этом отношении похожа на горизонтальную, или полигенную устойчивость, с той, однако, разницей, что последняя является генетическим признаком, тогда как приобретенная устойчивость — фенотипическим (Вавилов, 1935, 1964; Вердиревский, 1959; Метлицкий, 1976; Дьяков и др., 2001; Chester, 1933; Ross, 1961, 1966).
Индуцированная устойчивость (ИУ) основана не на изменении генома растительной ткани, а на изменении его функционирования, связанном с активацией экспрессии защитных генов. Как правило, иммуностимуляция, лежащая в основе ИУ, связана с комплексной активацией множества защитных механизмов, и это делает ее неспецифической, т.е. комплексной к патогенам разных таксономических групп, что является большим преимуществом этого способа защиты (Метлицкий, Озерецковская, 1985).
Индукция устойчивости растений к патогенам осуществляется путем предварительной обработки семян (клубней) или вегетирующих растений ослабленными патогенами, а также метаболитами, способными стимулировать иммунные системы растений. Эти вещества должны усиливать в растениях реакции защиты от патогенов таким образом, чтобы при последующем заражении растение реагировало на инфекцию как относительно устойчивое. Согласно современным представлениям, иммунные системы защищают организм не только от патогенов, но и от всего генетически чужеродного, чем достигается внутреннее постоянство организма и его функциональная целостность (Метлицкий, 1987). По мере накопления данных об иммунитете растений, исследователи пришли к выводу, что иммунная система растений, обладающая не меньшей, по сравнению с животной, способностью к специфическому иммунологическому узнаванию, представляет собой мультикомпонентный ответ растительной ткани на различного рода стрессы. Защитные реакции, лежащие в основе индуцированной фенотипической устойчивости, практически не отличаются от таких же реакций генетической устойчивости. К их числу относятся: реакция сверхчувствительности (СВЧ), образование ФА, PR-белков, ингибиторов протеиназ, АФК, модификация клеточной стенки и другие процессы (Метлицкий, Озерецковская, 1973, 1985; Озерецковская, 1994; Аверьянов, 2002). Участию АФК (супероксид-аниона, перекиси водорода, гидроксил-иона и др.) в защитных реакциях растений посвящен специальный раздел настоящей работы.
Реакция СВЧ. или реакция гиперчувствительности - защитная реакция устойчивого растения в ответ на заражение широким спектром несовместимых патогенов (вирусы, бактерии, грибы, нематоды), проявляющаяся в быстрой локальной гибели клеток растения и накоплении в них токсических продуктов (Дьяков и др., 2001).
СВЧ — гибель пораженных клеток в процессе устойчивости - иногда рассматривается как «жертва частью клеток во имя сохранения целого» (Greenberg, 1997). Можно полагать, что в реакции СВЧ участвуют два механизма клеточной гибели - некротическая и программированная (Дьяков и др., 2001; Staskawicz et al., 1995). Предполагается, что клетки, отмирающие изначально, самоуничтожаются по пути апоптоза (Дьяков и др., 2001; Heath, 2000), изолируя пораженный участок от здоровых тканей клубня, тогда как клетки, которые оказываются изолированными внутри СВЧ-участка, отмирают путем некроза из-за дефицита питания и избыточной концентрации фитоалексинов и АФК внутри зоны СВЧ (Дьяков и др., 2001). Механизм СВЧ изучается фитопатологами более 50 лет, однако до сих пор ее природа недостаточно ясна (Метлицкий, Озерецковская, 1973, 1985; Tomiyama et al., 1967, 1979; Huckelhoven et al., 1999).
Накопление фитоалексинов (ФА) является важнейшей составной частью иммунного ответа растительной клетки и хорошим критерием, позволяющим осуществлять скрининг элиситоров среди метаболитов патогенов. ФА представляют собой низкомолекулярные индуцированные «растительные антибиотики», активно синтезирующиеся и накапливающиеся в местах инфицирования патогеном (Метлицкий, Озерецковская, 1973; Бейли, Мансфилд, 1985; Tomiyama et al., 1966, 1968; Sato et al., 1971; Keen, 1972, 1975, 1977; Bracker, Littlefield, 1973; Bailey et al., 1975; Stoessl et al., 1977; Dixon et al, 1992, 1995). ФА обладают прямым токсичным действием на патогены и способствуют тем самым его локализации в зоне инфицирования. Природа ФА чрезвычайно разнообразна. Из представителей 20 семейств растений выделено более 200 ФА, имеющих разную химическую природу. Для каждого таксона характерны определенные групппы ФА (Inghem, 1977а, 1977b, 1977с; Keen and Bruegger, 1977; Stoessl et al., 1977). Установлено, что ФА синтезируются в живых метаболитически активных клетках растения, непосредственно окружающих зону СВЧ, и впоследствии транспортируются в отмершие клетки (Метлицкий, Озерецковская, 1973; Shiraishi et al., 1978; Кис, 1993; Dixon, Palva, 1995).
PR-белки с антигрибными свойствами впервые были обнаружены при изучении патосистемы табак - ВТМ (Van Loon, Van Kammen, 1970; Gianinazzi, 1980). PR-белки были найдены и в других видах растений в ответ на грибные, бактериальные и вирусные инфекции. Позднее PR-белки стали называть белками, связанными с патогенезом (pathogenesis-related proteins) (Van Loon, 1985; White et al, 1986; Linthorst, 1991; De Wit et al., 1997).
PR-белки табака обычно делят на 5 групп (Дьяков и др., 2001). Известно, что PR-2 белки являются Р-1,3-глюканазами, PR-3 -хитиназами, PR-5 - тауматиноподобными белками. Что касается групп PR-1 и PR-4, то они охарактеризованы лишь частично, и их функция до конца не ясна (Тарчевский, 2002).
Ингибиторы протеиназ представляют собой особую группы белков или пептидов растений, обладающих способностью образовьюать с протеиназами стехиометрические комплексы, что приводит к конкурентному ингибированию их каталитической активности (Мосолов, Валуева, 1993). Большая часть ингибиторов протеиназ представляет собой пептиды или небольшие белки. Особенностью ингибиторов протеиназ является устойчивость к действию собственно протеиназ. Предполагается, что ингибиторы протеиназ подавляют протеиназы патогенов, а также регулируют активность протеолитических ферментов самого растения (Тарчевский, 2002).
Роль салициловой кислоты в индуцировании устойчивости и восприимчивости растений
В последнее время не ослабевает интерес исследователей к салициловой кислоте (СК) и ее роли в возникновении ИУ растений к патогенам (Васюкова и др, 1996, 2003а,б; Тарчевский, 2002; Meuwly et al., 1995; Molders et al., 1996; Shah, 2003). В результате исследований механизмов формирования ИУ было установлено, что при иммунизации в тканях растения аккумулируется СК, т.е. происходит «салицилатный взрыв» (Molders et al., 1996; Coquoz et al.,1998). В настоящее время признано, что СК является одной из ключевых молекул, принимающих участие в формировании иммунного ответа растений, но роль ее в ИУ все еще является предметом дискуссий исследователей, поскольку, несмотря на большое количество работ по этой теме, данные об участии СК в ИУ достаточно сложны и противоречивы (Chen, Klessig, 1991; Lawton et al., 1995; Mur et al., 1996; Shirasu et al., 1997; Vidal et el., 1998; Huckelhoven et al.,1999). Исследование этой проблемы осложняется еще и тем, что в каждой патосистеме, по всей видимости, существует своя специфика формирования ИУ, и роль СК, соответственно, тоже может меняться.
Конститутивный уровень СК в широком диапазоне различается в разных видах растений и даже в разных сортах одного и того же вида. Так, в табаке, огурце и арабидопсисе содержится низкое конститутивное количество СК (Yu et al., 1997; McDowell, Dungl, 2000). Для этих растений повышение концентрации СК в 2-4 раза уже существенно для развития ИУ. Вместе с тем у растений с высоким содержанием СК - рис, соя, картофель, томаты (Yu et al., 1997)- основной уровень салицилата на порядок выше, чем в табаке, огурце и арабидопсисе (McDowell, Dungl, 2000), но это не мешает данным растениям реагировать на дополнительное внесение экзогенной СК шадуцированием устойчивости.
Велики также межсортовые различия растений. Так, тсонститутивный травень салицилата Б листьях устойчивого к Meloidogina incognita сорта томатов «Сольвейг» значительно превышая уровень СК в восприимчивом сорте «Карлсон». Интересно, что концентрация салицилата в корнях томатов в 5-10 раз превышает таковую в листьях, и следовательно уровень СК может сильно различаться в разных органах одного и того же растения (Васюкова и др., 2003а). Yu et al. (1997), изучая участие СК в механизмах ИУ в табаке и арабидолсисе (растения, с низким содержанием СК) и в картофеле (растение с высоким содержанием СК), предположили, что в первом случае ИУ связана с индукцией биосинтеза СК на фоне конститутивно высокой чувствительности к ней, что и приводит к экспрессии защитных генов. Во втором случае предполагалось, что ткани растений обладают высоким конститутивным уровнем биосинтеза СК, но слабой чувствительностью к ней тканей; а индукция приводит к усилению такой чувствительности к СК.
В растительных организмах СК существует как в свободной, так и в связанной форме. Из связанных форм СК в растениях содержатся метилсалицилаты, эфиры глюкозидов, конъюгаты СК с амшюкислотами, однако, основным метаболитом связанной формы СК является 2-0-P-D-глюкозид(ЕпуесІіега1., 1992; Coqirozetat, 1998).
Эндогенно продуцируемая и экзогенно нанесенная СК метаболизируется до 2- 2-р-0-глюкозида. В здоровых листьях табака присутствуют лишь следовые количества глюкозида (Enaedy, 1992). Однако, ВТМ-инокулированные листья накапливали значительные количества СК-глюкозида (до 80% от общего содержания СК) в области, окружающей некротические районы. Незначительные количества СК-глюкозида обнаруживались ва флоэмном эксудате и неинокулированных листьях ВТМ-инокулированного табака. Исследования с меченой 14С-СК подтвердили, что в ответ на ВТМ преимущественно накапливался СК-тлюкозид, та лишь следовые количества эфира СК-тлюкозида. Превращение СК в 2- 9-р-В-глюкозид катализируется УДФ-глюкозо-СК-глюкозилтрансферазой, наибольшая активность которой была отмечена вблизи СВЧ-области листьев табака (Yalpany et al., 1992; Enyedi, Raskin, 1993), Показано, что связанные формы СК обладают крайне слабой способностью к. индукции ПР-белков и не вызывают ИУ (Raskin, 1992)-Отсутствие СК-глюкозида во флоэмном эксудате делает его маловероятным кандидатом для транспорта СК и участия ъ индукции системной ИУ. Тем не менее, роль ковьюгатов СК в процессе развития иммунного ответа достаточно велика, так как они выступают резервом, обеспечивающим запас СК в тканях растения (Chen et at., 1995). К тому же, образование СКнрлюкозида является обратимой реакцией и первой ступенью катаболизма СК (Lee et al., 1995).
Интересно отметить, что метшісалицилат обладает важной функцией сигнала для коммуникации между растениями. Обработка растений метил-СК приводила к повышению содержания СК в тканях и продуцированию PR-белков в составе растений. Наличие метил-СК способствовало большей" устойчивости" растения (Тарчевский, 2002; Raskin, 1992),
Несмотря на важную роль СК в защитных ответах растения, пути ее биосинтеза продолжают уточняться (Frienrich et al., 1995; Lee et al., 1995). Считается, что синтез СК происходит по фенилнроианоидному пути из коричной кислоты, которая синтезируется из шикимовой кислоты при участии ФАЛ (Smith-Backer et al., 1998), далее с образованием бензойной кислоты и финальной ступени биосинтеза СК - гидроксилировании бензоата с помощью фермента бензоат-2-гидроксилаза (БК-2-Г). Этот путь подтвержден генетически: растения со сниженным уровнем экспрессии гена, кодирующего ФАЛ, имели пониженный уровень СК и не были способны к развитию ИУ (Mather et al., 1994; Pallas et al., 1996); ИУ не развивалась также при обработке листьев картофеля ингибитором ФАЛ - 2-аминоиндан-2-фосфониковой кислотой {Coquoz et al., 1998). Также этот путь биосинтеза СК подтвержден биохимически путем выделения и частичной очистки фермента БК-2-F (Lee et at, 1995; Verbeme et at, 1999). Установлено, что ЕК-2-Г представляет собой нетипичный высокомолекулярный,, растворимый цитохром Р-450 (Leon et al., 1995). Тем не менее, ген, жэдирующий этот фермент, все еще не идентифицирован (PodstolsM et at, 2002; Suzuki et at, 2004, 2005).
Однако, в растительных тканях существует и альтернативный способ биосинтеза СК при участии ферментов - изохоризмат-синтазы и шохоргоматішруват-лиазьь, которые катализируют две ступени синтеза СК из хоризмата. Первый фермент катализирует реакцию превращения хоризмата в изохоризмат, а второй — превращение изохоризмата в СК (Wildermuth et at, 2001; Shah, 2003).
Скрининг фракций хитозана
Определение СК при инфицировании клубней совместимыми и несовместимыми расами P. infestans предоставляло нам возможность сравнить полученные результаты с соответствующими данными при действии иммуномодуляторов, имея в виду, что иммуносупрессор должен функционировать в патогенезе при совместимой комбинации паразита и хозяина, тогда как элиситор — при несовместимой.
Одним из моментов, которые мы пытались прояснить в работе, была локализация СК в тканях клубней картофеля в зонах инфицирования.
На первом этапе работы для определения содержания СК использовали верхние 3 мм тканей, считая от обработанной поверхности дисков клубней картофеля. Оказалось, что уже через сутки после инфицирования дисков несовместимой расой гриба резко возрастало содержание кокьюгированной, т.е. связанной формы СК (552 нгнаг сырой ткани против 30 нг при заражении совместимой расой) (табл. 5). Если проанализировать общее количество СК - в свободной и связанной форме - то количество салицилата, накапливающееся при несовместимой комбинации хозяина и паразита, более чем в 5 раз превышала соответствующее содержание СК при совместимости партнеров (рис. 6).
Очевидно, что сразу после инфицирования дисков несовместимой расой возбудителя фитофтороза начинается усиленный биосинтез свободной формы СК — так называемый «салицилатный взрыв». Через некоторое время уровень СК начинает снижаться в силу образования конъюгированных форм.
Для контроля использовали ткани клубней картофеля — как «свеженарезанные» (гомогенизация ткани жидким азотом происходила через 1-2 минуты после разрезания клубней и обозначалась как Ксв), так и «залеченные» (ткани, полученные из дисков, на поверхность которых наносилась вода и где протекали процессы раневой репарации в течение времени инкубации зараженных дисков, обозначены как К3). Второй контроль использовался прежде всего с целью выяснить, какой вклад в аккумуляцию СК вносит процесс раневой репарации.
Данные литературы свидетельствуют об участии в раневых реакциях не салицилатного, а преимущественно жасмонатного сигнального пути (Enyedi et al., 1992). В нашем случае процесса залечивания тканей клубней картофеля при экспозиции 24 часа функционирование салицилатного пути не было зафиксировано, так как разница между уровнем СК в КсВ и К3 не наблюдалось (табл. 5). Через 48 часов в К3 по сравнению с Ксв возрастал как уровень свободной формы СК, так и наблюдалась взрывообразная аккумуляция связанных форм СК (табл. 6). Если проанализироБать суммарный уровень СК (общее количество ее свободных и связанных форм), то ее содержание в К3 возрастало более чем в 10 раз по сравнению с IQB.
Выше уже упоминалось, что при инфицировании совместимой расой 1.3 (экспозиция 24 часа) общий уровень СК не изменяется по сравнению с Ка (табл. 5). Что касается уровня СК при несовместимой комбинации, то он возрастал более чем в 6 раз по сравнению с К3. При экспозиции 48 ч общее количество СК в несовместимой комбинации по-прежнему превышало ее содержание в совместимой, однако, уровень СК в К3 превышал таковой при обеих комбинациях хозяина и паразита (табл.6).
Далее нами было проведено сопоставление аккумуляции ОС с ранее выполненным микроскопическим анализом состояния гриба в исследованных тканях. Согласно данным литературы, поведение обеих рас P. infestans в тканях клубня картофеля одинаково лишь в первые часы после проникновения (Tomiyama et al., 1967, 1979). Так, в течение первых 3 часов после инфицирования зооспоры обеих рас прорастают на поверхности дисков, образуя апрессории, которые прободают клеточную стенку клубня. В этот период никаких различий в поведении обеих рас при наблюдении в световом микроскопе не обнаруживалось. Различия начинают наблюдаться после соприкосновений апрессории гриба с плазмалеммой клетки клубня хозяина.
При несовместимой комбинации наступает быстрая гибель (некротизация) клеток картофеля. В ходе этого процесса ядро из центра клетки перемещается к месту инфекции, начинается усиленное круговое движение протоплазмы. Однако уже примерно через 30-60 минут движение протоплазмы останавливается, ядро обесцвечивается и сжимается, клетка погибает (Tomiyama et al., 1967, 1979). К 6 часам часть инфицированных клеток, в которые проник паразит, гибнет. Через 24 часа гибнут все клетки с несовместимыми гифами патогена. Сам же патогенный оомицет в погибших клетках остается живым еще в течение 12-15, а иногда и 24 часов. Затем погибают и гифы паразита.
При гибели гриба его гифы деформируются, утолщаются, начинают лизироваться, затем деструктирируются, в результате чего их уже трудно отличить от содержимого таїеток хозяина, погибших Б процессе реакции СВЧ. Через 48 часов все погибшие клетки некротизируются (рис. 6) (Караваева и др., 1983).
Совместимая раса патогена беспрепятственно проникает в живые клетки клубня и уже в первые 12 часов удается наблюдать ветвление ее гиф в первом ряду клеток диска, считая от поверхности инфицирования. К часам практически все клетки в 1-ом, 2-ом и даже частично в 3-м рядах диска заполнены хорошо развитыми гифами. Через 48 часов гифы гриба по межклетникам проникает в нижележащие слои, достигая примерно 10-15 рядов клеток или 1.5 мм, считая от поверхности инфицирования (если условно принять клетку клубня картофеля сорта Истринский за шар, то ее диаметр в среднем составит 80 мк) (Караваева и др., 1983). Дальнейшее исследование показало, что преимущество несовместимой комбинации перед совместимой заключается не столько в количественном содержании салицилата, сколько в особенностях его локализации.
Ингибирование активности каталазы клубней картофеля салициловой и янтарной кислотами
В свете данных о способности каталазы из интактных (не подвергнутых обработке) клубней картофеля ингибироваться салицилатом, факт накопления СК под воздействием элиситора вполне согласуется со снижением активности каталазы в процессе формирования ИУ. Что касается данных по иммуносупрессии то здесь наблюдалось некоторое противоречие: уровень СК под воздействием ламинарина не изменялся, однако активность каталазы в тканях обработанных клубней резко возрастала уже в течение 5 ч после обработки иммуносупрессором. Одним из возможных объяснений этому могло служить предположение, что в данном случае наблюдается индукция иммуносупрессором экспрессии каталазы, по аналогии с данными литературы о патогениндуцированной экспрессии каталазы в совместимой комбинации картофеля с паразитическими нематодами и бактериальными инфекциями (Niebel et al., 2002).
На наш взгляд, чрезвычайно интересным представлялась попытка выяснить, одинаковой ли чувствительностью к ОС обладают каталазы, выделенные из клубней, подвергнутых предварительной обработке элиситором и иммуносупрессором. Для того, чтобы это выяснить, сравнивали способность СК ингибировать каталазу, выделенную из картофеля, обработанного водой, а также каталазы клубней, в которых индуцировали ИУ и ИВ элиситором и иммуносупрессором, соответственно.
Оказалось, что чувствительность к СК каталазы, изолированной из контрольных, а также иммунизированных хитозаном клубней, была значительно выше, чем чувствительностБ каталазы, выделенной из клубней, обработанных ламинарином (табл. 11), Как правило, в тканях растений содержится несколько изоформ каталазыг которые могут обладать несколько различными свойствами в том числе различной чувствительностью к СК. Факт снижения чувствительности каталазы к СК, вероятно, объясняется тем, что под воздействием нммуносупрессора начинает экспрессироваться ген каталазы, менее чувствительной к СК. Обращает на себя внимание различие в механизмах регулирования активности каталазы между процессами ИУ и ИВ. Так, при индуцировании устойчивости в тканях клубней картофеля активность фермента регулируется путем изменения концентрации СК в тканях. Что касается индуцирования восприимчивости, то регуляция активности каталазы, по-видимому, производится с помощью экспрессии гена менее чувствительной к СК изоформы каталазы.
Предполагается, что ПВ, накапливающаяся в тканях клубней картофеля в результате ингибировання активности каталазы СК, является вторичным мессенджером,. запускающим каскад защитных реакций. Поскольку именно повышение ее концентрации в клетках запускает иммунный ответ, возникает закономерный вопрос — возможно ли напрямую индуцировать устойчивость, используя в качестве индуктора ПВ?
Известно, что воздействие ПВ на растительную клетку зависит от ее концентрации. Так, в концентрации 0.1 — 2.5 мМ перекись необратимо повреждает клетки растений, в концентрации 250 мкМ повреждение становится обратимым. В концентрации 0.1 — 50 мкМ клетки внешне остаются неповрежденными, но в них происходит ряд метаболитических изменений, приводящих к индуцированию устойчивости (Гамалей, Клюбин, 1996). Мы провели обработку тканей клубней картофеля ПВ в различных концентрациях. Согласно полученным данным, ПВ индуцировала иммунный ответ (табл. 12). Максимальная степень защиты наблюдалась при использовании концентрации ПВ 25 мкМ, но другие ее концентрации также были эффективны. Вероятно, для процесса иммунюации в первую очередь необходимо накопление перекиси водорода (окислительный взрыв). Основываясь на полученных данных, мы попытались предложить модель индуцирования устойчивости с помощью хитозана. Согласно модели индуцирования: устойчивости, при иммунизации тканей клубней картофеля хитозаном функіщонирует следующая регуляторная цепочка: в процессе элиситации в результате гидролиза связанных форм СК и синтеза de novo происходит накопление свободной формы СК, которая ингибирует активность каталазы, в результате чего происходит накопление перекиси водорода («окислительный взрыв»), и формируется шщуцированная устойчивость (рис. 13). Индуцирование восприимчивости ламинарином менее ясно: в этом случае не происходит накопления СК, но чувствительность каталазы к СК снижается, и активность фермента возрастает. В результате процесс формирования индуцированной восприимчивости не сопровождается накоплением ПВ, более того - за счет возрастания активности каталазы уровень ее несколько понижается. Снижение концентрации АФК в клетках не позволяет развиться устойчивости, и клубни: становятся восприимчивыми к патогенам. Справедливость предложенной модели формирования индуцированной устойчивости (с помощью хитозана и несовместимой расы возбудителя фггофтороза) и индуцированной восприимчивости (с помощью ламинарина и совместимой расы возбудителя фитофтороза) подтверждается результатами ингибиторного анализа и созданием композиционного препарата (хитозан и СК) с более эффективным, чем у собственно хитозана, защитным действием.
