Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Гидрогеназы: классификация, структура, свойства 10
1.1 Hmd-гидрогеназы 10
1.2 Fe-Fe-гидрогеназы
1.2.1 Каталитический цикл железосодержащих гидрогеназ 14
1.2.2 Биосинтез железосодержащих гидрогеназ 15
1.3 Железоникелевые гидрогеназы 16
1.3.1 Каталитический цикл железоникелевых гидрогеназ 21
1.3.2 Биосинтез железоникелевых гидрогеназ 21
ГЛАВА 2. Методы определения структуры гидрогеназ 23
2. 1 Методы молекулярной спектрометрии в исследовании активного центра и электрон переносящих кофакторов гидрогеназ 23
2. 2 Методы расшифровки трёхмерной структуры гидрогеназ 24
2. 3 Вычислительные методы в исследовании гидрогеназ 26
Глава 3. Гидрогеназы thiocapsa roseopersicina и alteromonas macleodii 27
Глава 4. Взаимодействие железоникелевых гидрогеназ с редокс партнёрами 30
ГЛАВА 5. Материалы и методы 32
5.1 Моделирование гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina 32
5.2 Проверка качества моделей по геометрическим критериям 34
5.3 Минимизация энергии двусубъединичных моделей з
5.4 Моделирование С-концевого фрагмента малой субъединицы и полноразмерного фермента 35
5.5 Моделирование гидрогеназы HydSL Alt. macleodii 35
5.6 Реконструкция лигандов в полученных моделях 36
5.7 Подсчёт ионных пар 36
5. 8 Подсчёт водородных связей 36
5. 9 Картирование поверхностей гидрогеназ 36
5. 10 Картирование внутримолекулярных туннелей 37
5. 11 Моделирование взаимодействия гидрогеназы с метилвиологеном и полипептидами 37
5. 12 Выделение гидрогеназы Т. roseopersicina BBS 38
5. 13 Определение гидрогеназной активности 39
5.14 Определение константы ингибирования гидрогеназы положительно заряженными полипептидами 39
5. 15 Построение схемы направленной модификации гидрогеназы Т. roseopersicina 39
ГЛАВА 6. Результаты и обсуждение 41
6. 1 Модели гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina 41
6. 2 Моделирование полноразмерной малой субъединицы гидрогеназы HydSL Т.
roseopersicina 46
6. 3 Модели гидрогеназы HydSL Alt. macleodii 49
6. 4 Анализ взаимодействий внутри субъединиц и между субъединицами 55
6. 5 Картирование внутримолекулярных туннелей 58
6. 6 Картирование поверхностей гидрогеназ 61
6. 8 Влияние положительно заряженных полипептидов на активность гидрогеназы HydSL Т.
roseopersicina 64
6. 9 Докинг метилвиологена и полипептидов с гидрогеназой Т. roseopersicina 66
6. 10 Схема направленной модификации гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina с целью придания
ей повышенной устойчивости к кислороду 70
Заключение 79
Выводы 82
Список опубликованных работ по теме диссертации 83
Список использованной литературы
- Каталитический цикл железосодержащих гидрогеназ
- Каталитический цикл железоникелевых гидрогеназ
- Методы расшифровки трёхмерной структуры гидрогеназ
- Моделирование взаимодействия гидрогеназы с метилвиологеном и полипептидами
Каталитический цикл железосодержащих гидрогеназ
Группа 1 - мембраносвязанные водород-поглощающие гидрогеназы. К этой группе относится большинство гидрогеназ, для которых известна пространственная структура. Эти гидрогеназы могут быть локализованы как в периплазме, так и быть ассоциированными с мембраной за счёт заякоривания на цитохроме с-типа либо b-типа [Bernhard et al., 1997] или подобных им белках [Cauvin et al., 1991; Rossi et al., 1993; Ohtsuki et al., 1997; Gross et al., 1998], которые иногда называют третьей субъединицей гидрогеназы. Как правило, в клетке эти ферменты катализируют реакцию поглощения водорода с последующим восстановлением пула хинонов [Dross et al., 1992, 1993]. Гидрогеназы HupSL, присутствующие у пурпурных несерных и серных бактерий, выполняют важную функцию обратного захвата водорода, выделяющегося в нитрогеназной реакции при фиксации атмосферного азота [Meyer et al., 1978; Brewin, 1984; Colbeau et al., 1986; Brito et al., 1997, 2000], а также при недостатке азота, когда нитрогеназная активность нитрогеназы становится значительно ниже гидрогеназной (водород-выделяющей) [Chan et al., 1980]. При этом, регуляция синтеза HupSL-гидрогеназ и нитрогеназы согласована [Elsen et al., 2000]. Гидрогеназы HydSL и HynSL могут работать в обоих направлениях (на выделение и на поглощение водорода), что делает их регуляторами окислительно-восстановительного потенциала среды в клетке.
Поскольку гидрогеназы группы 1 локализуются в периплазме, для них характерно наличие особой сигнальной последовательности, распознаваемой трансмембранным переносчиком (Tat - twin-arginine translocon) [Sargent et al., 1998a], который осуществляет перенос после отщепления сигнального пептида [Wu et al., 2000].
Наиболее изученными гидрогеназами первой группы являются гидрогеназы сульфат-редуцирующих бактерий Desulfovibrio gigas, Desulfovibrio fructosovorans и Desulfovibrio vulgaris. У гидрогеназы D. vulgaris Miyazaki F структура была установлена с субатомным разрешением (0,89 А). Это позволило картировать путь переноса протона и атомы водорода в структуре белка [Ogata et al., 2015].
Активный центр железоникелевых гидрогеназ, располагающийся на большой субъединице, включает два атома металлов - атом железа и атом никеля [Volbeda et al., 1995, 1996]. Атом никеля заякорен четырьмя остатками цистеина, два из которых заякоривают также и атом железа. Электрон-переносящие железосерные кластеры располагаются на малой субъединице, причём обычно проксимальный и дистальный железосерные кластеры принадлежат к 4Fe-4S-rany, в то время как медиальный кластер принадлежит к 3Fe-4Snny. Помимо активного центра и железосерных кластеров, в гидрогеназах присутствует ион магния [Higuchi et al., 1997]. Его наличие связывают с необходимостью тонкой координации отрицательно заряженных аминокислотных остатков для формирования пути отвода протонов.
К первой группе относится и интересная группа гидрогеназ, содержащих в активном центре атомы селена на месте атома серы цистеина [Fauque et al., 1988]. Еще одним их структурным отличием является наличие 4Ее-48-кластера в медиальной позиции, что может обусловливать их высокую активность. Дело в том, что 3Fe-4S кластер обладает более высоким потенциалом, чем 4Ее-48-кластер, поэтому преодоление его электроном затруднено. Это привело к идее о том, что у электрона есть пути по белковой цепи в обход потенциального барьера, создаваемого ЗЕе-48-кластером. В случае селен-содержащих гидрогеназ, такого барьера нет, поэтому, возможно, они и обладают в несколько раз большей активностью по сравнению с классическими гидрогеназами группы 1 [Parkin et al., 2008].
К этой же группе принадлежат устойчивые к кислороду гидрогеназы HoxKG Ralstonia eutropha [Bernhard et al., 1996], HoxKG Hydrogenovibrio marinus, HyaAB Escherichia coli [Volbeda et al., 2012]. Они обладают характерным 4Ее-38-кластером в проксимальной позиции, для которого показана способность восстанавливать кислород до воды, что позволяет этим ферментам функционировать в атмосфере кислорода.
Группа 2 состоит из двух функционально гетерогенных подгрупп гидрогеназ, объединённых на основании наличия одной и той же консенсусной последовательности в большой субъединице.
Подгруппа 2а - это водород-поглощающие гидрогеназы цианобактериального типа [Нарре et al., 2000]. Как и многие гидрогеназы группы 1, они участвуют в обратном захвате водорода, образующегося в нитрогеназной реакции у цианобактерий. Принципиальным отличием их от группы 1 является иная локализация - они располагаются с внутренней стороны мембраны или в цитоплазме, поскольку у них отсутствует сигнал мембранной транслокации.
Подгруппа 2Ь - это гидрогеназы, выполняющие функцию сенсоров водорода, или сенсорные гидрогеназы (HupUV- и НохВС-гидрогеназы) [Black et al., 1994; Elsen et al., 1996; Vignais et al., 1997]. Их отличительная особенность - это высокая устойчивость к кислороду при очень низкой активности. Они взаимодействуют с гистидинкиназой, участвующей в передаче сигналов на транскрипционные регуляторы, ответственные за активацию оперонов гидрогеназ группы 1 [Elsen et al., 1996; Lenz et al., 1997; Bernhard et al., 2001; Lenz et al., 2002; Buhrke et al., 2004]. Известно, что одну из главных ролей в их устойчивости к кислороду играют массивные остатки в предполагаемом газовом туннеле, что было показано в нескольких работах по внесению одноаминокислотных замен в газовые туннели [Buhrke et al., 2005; Duche et al., 2005; Lerouxetal., 2008]. Группа 3 - это цитоплазматические гетеромультимерные гидрогеназы, функционирующие в двух направлениях в зависимости от условий. Они делятся на четыре подгруппы:
За - гидрогеназы, восстанавливающие фактор F420 (8-оксодеазафлавин). Эти гидрогеназы участвуют в процессе метаногенеза. Их участие в метаногенезе показано на рисунке 1 (выше).
В 2014 году вышла работа [Vitt et al., 2014], посвященная экспериментальному определению структуры Р420-восстанавливающей FrhABG-гидрогеназы Methanothermobacter marburgensis методом рентгеноструктурного анализа (РСА) (Рис. 6). Её активный центр, расположенный на FrhA-субъединице, устроен идентично гидрогеназам группы 1. В то же время в электрон-переносящей субъединице FrhG существуют отличия: проксимальный железосерный 4Fe-4S-KJiacrep этой гидрогеназы заякоривается тремя остатками цистеина и одним остатком аспартата, чего не наблюдается у гидрогеназ группы 1. Медиальный и дистальный железосерные кластеры (также 4Fe-4Snna, заякоренные остатками цистеина) располагаются на ферредоксин-подобном домене FrhG-субъединицы. FrhB-субъединица является дополнительным переносчиком электронов и содержит один 4Fe-4S-KJiacrep и простетическую группу FAD, которая находится близко к сайту связывания F420 и с которой идёт перенос электронов на этот акцептор. 3b - бифункциональные гидрогеназы, восстанавливающие NADP и способные к восстановлению серы до сульфида, встречающиеся у многих гипертермофильных бактерий, в частности, Pyrococcus furiosus [Ma et al., 1993, 2000].
Каталитический цикл железоникелевых гидрогеназ
Жёлтым цветом выделены остатки цистеина, взаимодействующие только с никелем, зелёным - остатки цистеина, образующие мостики между никелем и железом. Красным показаны остатки, принимающие участие в заякоривании иона магния. Подчёркивание означает, что данный участок выщепляется эндопептидазой НурС, для которой показана способность к удалению короткого пептида, располагающегося на С-конце больших субъединиц после остатка гистидина в процессе созревания гидрогеназ [Rossmann et al., 1995; Maroti et al., 2010a]. Поскольку все рассмотренные нами гидрогеназы из базы данных Protein Data Bank заканчиваются остатками гистидина, а процесс выщепления С-концевого пептида из больших субъединиц гидрогеназ хорошо изучен, мы вправе предположить выщепление данного участка у обеих гидрогеназ, которые мы моделировали.
Поскольку все лиганды рассматриваются программой MODELLER как абсолютно твёрдые тела, активный центр полученных моделей (Рис. 9 б) идентичен активному центру шаблона и находится в состоянии Ni-A state (окисленное неготовое состояние). Он состоит из атомов никеля и железа, связанных остатками цистеина большой субъединицы (Cys61, Cys64, Cys555, Cys558, согласно нумерации последовательности в базе данных Uniprot, Ш: 051823) и соединённых между собой атомом кислорода; атом железа связывает два СО- и один CN лиганд. Атом магния, связанный боковой цепью остатка глутаминовой кислоты Glu42 и СО-группой аланина А1а506 (Рис. 9 в) по-видимому, служит для координации отрицательно заряженных остатков, участвующих в отводе протонов, хотя для гидрогеназы Т. roseopersicina показан и альтернативный путь переноса протонов [Szori-Doroghazi et al., 2012].
Возможно, что реальная структура активного центра гидрогеназы HydSL Thiocapsa roseopersicina BBS немного отличается от вышеприведённой, поэтому в дальнейшем возможно уточнение моделей в случае расхождения теоретически предсказанной структуры активного центра с экспериментальными данными по длинам связей и углам между ними.
Электрон-переносящие кофакторы представлены тремя железосерными кластерами (Рис. 10), координированными остатками цистеина (проксимальный и медиальный кластеры) либо цистеина и гистидина (дистальный кластер). Дистальный и проксимальный кластеры принадлежат к 4Fe-4S-rany, а медиальный - к 3Fe-4S типу. Возможность наличия 4Fe-3S кластера в проксимальной позиции, характерного для таких устойчивых к кислороду гидрогеназ, как гидрогеназы HoxKG Ralstonia eutropha, HoxKG Hydrogenovibrio marinus, HyaAB Escherichia coli, исключается по причине отсутствия в малой субъединице необходимых для его координации двух дополнительных остатков цистеина (на соответствующих им позициях находятся остатки глицина, G21 и G122).
Зелёным отмечены остатки, заякоривающие проксимальный железосерный кластер, красным - остатки, заякоривающие медиальный кластер, жёлтым - остатки, заякоривающие дистальный кластер. Фиолетовым показан остаток аспартата, который может взаимодействовать с атомом железа проксимального кластера. Подчёркивание означает, что данный фрагмент аннотирован в базе данных Uniprot как отщепляемый при транслокации сигнал для Tat-транслокона. Поскольку обе гидрогеназы, исследованные нами, локализуются в периплазме, для них наличие подобного сигнала является необходимым.
Атомы железа показаны фиолетовым, серы - зелёным, углерода - голубым, кислорода -красным, азота - синим.
По-видимому, остаток аспартата не обязателен для стабилизации проксимального железосерного кластера, но возможно, что его наличие влияет на редокс-свойства этого электрон-переносящего кофактора.
Результаты моделирования С-концевого фрагмента на сервере QUARK показали, что вторичная и третичная структуры полученных моделей сходны: этот фрагмент состоит из трёх альфа-спиралей, разделённых участками неупорядоченной структуры. Последующее моделирование полноразмерной малой субъединицы в программе MODELLER показало значения Z-оценки DOPE для лучших моделей в районе -1, что означает, что данные модели с высокой вероятностью близки к нативной структуре. Полноразмерные модели HydSL были получены методом структурного выравнивания с шаблоном (Рис. 11). Значение RMSD для атомов малой субъединицы составило 0.92 А.
С-концевой фрагмент малой субъединицы находится вдали от малой субъединицы и состоит из трёх альфа-спиралей (Рис. 11 а). Возможно, он участвует в заякоривании на мембране (через цитохром-подобный белок Ispl) и олигомеризации гидрогеназы.
На возможное участие этого фрагмента в заякоривании гидрогеназы на белке Ispl указывают два факта: 1) гомологи этого фрагмента отсутствуют у периплазматических гидрогеназ сульфатредукторов родов Desulfovibrio и Desulfomicrobium; и присутствуют у мембраносвязанных гидрогеназ; 2) генетические эксперименты [Palagyi-Meszarosz et al., 2009] показали изменение in vivo активности гидрогеназы HydSL при делеции гена Ispl: полную утрату способности к поглощению водорода и значительное снижение способности к выделению водорода.
Суперпозиция четырёх лучших моделей малой субъединицы (Рис. 11 б) позволила предположить, что С-концевой фрагмент, обладающий довольно строгой трёхмерной структурой, расположен сравнительно свободно относительно основной белковой глобулы. Возможно, что подобное «качание» этого фрагмента прекращается при взаимодействии с редокс-партнёром или прикреплении к мембране. Причиной такого предположения является относительная гидрофобность этой последовательности (индекс GRAVY (grand average of hydropathicity) = +0.435 [Kyte, Doolittle, 1982]), поэтому этот фрагмент будет стремиться взаимодействовать с другими гидрофобными молекулами в водном окружении.
Согласно результатам нашего анализа на сервере MolProbity, качество моделей было весьма высоким, что подтверждалось значениями индекса MolProbity и индекса перекрывания, соответствующими процентилям 72-94. Однако значения индекса перекрывания для димерных молекул были высокими, соответствуя 18-й процентили. После минимизации энергии на сервере YASARA Energy Minimization Server эта проблема была решена, и значения индекса перекрывания стали соответствовать 98Й-100Й процентилям
Методы расшифровки трёхмерной структуры гидрогеназ
Следует отметить, что экспериментально определенная изоэлектрическая точка гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina находится в районе 4.1-4.2, в то же время расчетная составляет 5.32 для большой субъединицы и 5.42 для малой. Здесь стоит сказать, что расчётное значение изоэлектрическои точки определялось по первичной структуре, то есть, по аминокислотной последовательности, безотносительно структуры фермента.
Положительное значение электростатического потенциала поверхности при рН = 5 может в действительности не отражать общего заряда белковой молекулы. Дело в том, что в глубине белковой глобулы присутствуют не только гидрофобные, но и заряженные группы (в частности, во внутримолекулярных туннелях). Общий заряд белка, определяющий значение изоэлектрическои точки, может быть ниже заряда поверхности. Помимо этого, следует также с осторожностью относиться к полученным результатам, поскольку применение и метода частичных сумм Эвальда, и метода решения уравнения Пуассона-Больцмана к белкам иногда приводило к значительным отклонениям расчетных значений констант кислотности. Так, в работе Krieger et al. [Krieger et al., 2006] среднеквадратичное отклонение констант кислотности (рКа) составляло от 0.399 для лизина до 1.206 для гистидина при использовании метода частичных сумм Эвальда, и от 0.533 для лизина до 1.588 для гистидина при использовании метода решения уравнения Пуассона-Больцмана.
Акцепторы электронов в реакции окисления молекулярного водорода, катализируемой гидрогеназой, имеют положительный заряд. Роль акцептора электронов в этой реакции, наряду с природными акцепторами электрона, могут выполнять различные виологены, имеющие заряд +2 в окисленном состоянии, а также катионы никеля и кадмия, которые гидрогеназа восстанавливает в атмосфере водорода до металлического состояния [Zadvorny et al., 2006]. Таким образом, электростатическое взаимодействие имеет важное значение для взаимодействия фермента с субстратом (акцептором). Как было показано ранее [Задворный и др., 2000], катионы ряда металлов проявляют высокое сродство к гидрогеназе Т. roseopersicina и являются обратимыми и конкурентными по отношению к метилвиологену ингибиторами фермента. Увеличение сродства гидрогеназы к катионам при повышении рН [Задворный и др., 2000] когда увеличивается отрицательный заряд молекулы фермента, свидетельствует о важном вкладе электростатических взаимодействий в ингибирование гидрогеназы Т. roseopersicina катионами этих металлов. Нами было сделано предположение, что и другие вещества с положительным зарядом могут иметь высокое сродство к гидрогеназе и быть конкурентными ингибиторами по отношению к акцептору электронов. Для проверки этого предположения в качестве модельных полиионов были использованы полипептиды с различным зарядом. Наиболее сильный ингибирующий эффект проявлял полилизин (Кго), имеющий значительный положительный заряд (Рис. 18). Ингибирующее действие полилизина было обратимым и конкурентным по отношению к акцептору электронов - окисленному метилвиологену в реакции окисления водорода, катализируемой гидрогеназой. Константа ингибирования, отражающая сродство этого пептида к гидрогеназе, составляла К; = 2.1 мкМ. Эта константа на два порядка ниже величины Кт = 182 мкМ для метилвиологена [Zadvorny et al., 2006]. Полипептиды с меньшим положительным зарядом производили меньший ингибиторный эффект. Так, полилизин-лейцин (К(КЬК)бК), имеющий в своем составе 14 остатков лизина и 6 остатков лейцина, которые не имеют заряда, проявлял значительно меньший ингибирующий эффект, конкурентный по отношению к окисленному метилвиологену, С К; = 8.0 мкМ (Рис. 19). Незаряженные и отрицательно заряженные полипептиды, например, полилейцин (L20) и полиглутамат (Его), не проявляли ингибирующего эффекта на гидрогеназу (данные не приведены). Таким образом, экспериментально показано, что полипептиды с положительным зарядом являются эффективными и конкурентными по отношению к метилвиологену ингибиторами гидрогеназы Т. roseopersicina.
Зависимость обратной величины скорости окисления Н2 (І/v) в присутствии гидрогеназы от концентрации полилизина К20 ([p-Lys], мкМ) при фиксированных концентрациях окисленного метилвиологена 1мМ (1) и 4 мМ (2) при рН 9.0 (Ki = 2.1 мкМ). Измерения проводились Зориным Н. А. [p-Lys-Leu], мкМ
Результаты докинга метилвиологена показали, что энергия Гиббса связывания метилвиологена составляет от -5,6 до -4,7 ккал/моль (от -23,43 до -19,66 кДж/моль). Константа связывания, рассчитанная по этим энергиям, равна 91,3-407,2 мкМ, что достаточно близко к экспериментально определенной константе связывания, равной 182 мкМ. При этом два комплекса, полученных в результате докинга, обладали той особенностью, что молекула метилвиологена связывалась с участками малой субъединицы вблизи дистального железосерного кластера (расстояния 8.5 и 15 А, константы связывания 127 и 292 мкМ, соответственно). Это теоретически подтверждает экспериментально известную возможность переноса электрона с гидрогеназы на метилвиологен (Рис. 20 б). Для сравнения, расстояния между железосерными кластерами равны 9 А, а расстояние от активного центра до проксимального железосерного кластера равно 13 А.
Моделирование взаимодействия гидрогеназы с метилвиологеном и полипептидами
Подход, примененный в работе, помог построить структурные модели двух близкородственных железоникелевых гидрогеназ. Нам удалось впервые построить их полноразмерные модели, сочетая метод моделирования по гомологии и метод моделирования аЪ initio. Оценка моделей показала их высокое качество, то есть высокую степень реалистичности; в процессе оценки моделей введена формула, по которой можно оценивать качество практически любой модели белка в сравнении с шаблонной структурой.
Наш подход можно применять и для построения полноразмерных моделей тех гидрогеназ, для которых известна частичная трёхмерная структура, например, для гидрогеназы HydSL A. vinosum, для которой неизвестны координаты атомов 48 С-концевых аминокислот малой субъединицы.
Результаты работы не подтверждают гипотезу о стабилизирующем влиянии ионных пар на гидрогеназы. Гидрогеназа HydSL Alt. macleodii, весьма похожая по свойствам, в частности, по термостабильности, на гидрогеназу HydSL Т. roseopersicina, содержит меньше ионных пар между субъединицами.
Проведённое картирование внутримолекулярных туннелей показало, что наличие туннелей зависело от выбранного метода совмещения субъединиц, а это значит, что туннели весьма лабильны. Тем не менее, поскольку ни одна описанная в литературе детерминанта устойчивости к кислороду (атом селена в активном центре, характерные массивные аминокислотные остатки в туннелях или уникальный проксимальный железосерный кластер 4Fe-3Snna) не свойственна гидрогеназам HydSL Т. roseopersicina и Alt. macleodii, возникает логичное предположение, что детерминанта устойчивости к кислороду связана именно с тонкой структурой внутримолекулярных туннелей. При этом, поскольку при совмещении субъединиц методом суперпозиции туннели картировались сходно во всех гидрогеназах, возможно, что детерминанта связана с остатками, прилегающими к остаткам, фланкирующим туннели. Более того, возможно, что наличие определённых остатков может влиять на динамическое поведение туннелей (время перехода между открытым и закрытым состояниями), что будет темой дальнейшего исследования.
Картирование молекулярных поверхностей гидрогеназ при разных значениях рН показало разницу в распределении электростатического потенциала по поверхностям. Полученные данные могут помочь в выборе веществ для иммобилизации гидрогеназ на поверхности электродов с целью их практического применения или изучения фундаментальных особенностей электрокатализа в зависимости от задач. Например, если ставится задача исследования поглощения водорода, то раствор для иммобилизации должен быть щелочным, а в этих условиях оптимальным иммобилизующим агентом будет положительно заряженное вещество (например, используемые уже сейчас полипирролвиологен или полимер нейтрального красного). При исследовании выделения водорода для иммобилизации оптимальным будет кислый раствор, соответствующий термодинамическому оптимуму полуреакции восстановления протонов, а значит, иммобилизующий агент должен быть заряжен отрицательно. Различия между двумя исследованными гидрогеназами заключаются в том, что гидрогеназа Т. roseopersicina чувствительнее к изменению рН. Интересно, что вблизи дистальных железосерных кластеров показаны зоны сравнительно стабильного положительного потенциала, что может служить для ориентированной иммобилизации гидрогеназ. Например, при иммобилизации через отрицательно заряженную группу в щелочном растворе обе гидрогеназы, судя по картам потенциала, должны иммобилизоваться преимущественно за счёт взаимодействия областей, прилегающих к железосерному кластеру, с отрицательными зарядами поверхности электрода.
Картирование гидрофобных участков поверхностей показало, что в целом гидрофобные зоны распределены достаточно диффузно и вряд ли могут служить для иммобилизации на электрод через гидрофобный агент; достаточно крупная гдрофобная зона присутствует в гидрогеназе HydSL Т. roseopersicina, но специфичность её взаимодействия с гидрофобными веществами выглядит сомнительной.
Наиболее ценная информация была получена при докинге гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina с метилвиологеном и положительно заряженными пептидами. Во-первых, картированы два наиболее вероятных сайта связывания метилвиологена, в которых возможен перенос электрона. Показано, что в одном из этих сайтов связывание осуществляется за счёт чисто электростатических взаимодействий, а в другом вероятно стэкинг-взаимодействие метилвиологена с ароматическими остатками. При этом расчётные данные по константам связывания достаточно хорошо согласуются с экспериментально определёнными константами связывания. С этими же сайтами связываются и положительно заряженные полипептиды. Несмотря на то, что альфа-спиральная конформация, которая была выбрана для расчётов, может быть не характерной для полилизина в растворе при рН ниже 10.5, можно предположить, что полипептид приобретает её при взаимодействии с гидрогеназой. Расчётные константы ингибирования для полилизина и полилизин-лейцина не отличались между собой, но с точностью до порядка совпадали с экспериментальными. Данные результаты и предложенный подход могут служить для поиска агентов для иммобилизации гидрогеназы на электрод, причём возможно, что эти вещества могут быть как положительно заряженными, так и ароматическими.
На базе полученных данных о структуре гидрогеназы Т. roseopersicina и литературных данных о детерминантах устойчивости гидрогеназ к кислороду была предложена схема возможной модификации гидрогеназы HydSL с целью придания ей дополнительной устойчивости к кислороду. Эта схема ожидает своей экспериментальной проверки. Что же касается детерминант устойчивости к кислороду, то для их более точного картирования необходимы эксперименты по молекулярной динамике входа/выхода кислорода. Тем не менее, возможно существование не описанных ранее детерминант устойчивости к кислороду, поскольку ни одна описанная в литературе детерминанта не присутствует в исследованных гидрогеназах. Этот вопрос требует дополнительных исследований.
Подводя итог, можно сказать, что результаты работы открывают широкий простор для поиска веществ для иммобилизации гидрогеназ на поверхности водородного электрода. Помимо этого, знание трёхмерной структуры позволит спланировать точечный мутагенез гидрогеназ для улучшения их свойств.