Введение к работе
Актуальность проблемы. Значительный прогресс в области молекулярной биологии, вирусологии, технологии рекомбинантных ДНК и картировании генома человека определил основы для нового направления бмомодицинских исследований - соматической генной терапии. Этот подход имеет своей целью предупреждение и лечение наследственных и приобретенных заболеваний. Существует большое количество наследственных заболеваний человека, которые представляют собой потенциальные объекты для такого рода исследований. Более 4500 заболеваний человека классифицируются как генетические (McKusick, 1908).
В настоящее время существуют два основных подхода к генной терапии заболеваний человека. Это прежде всего так называемая генная терапия ex vivo, представляющая собой многоступенчатый процесс, который включает трансплантацию генетически модифицированных аутологичных клеток. Менее разработанный, но теоретически более эффективный подход к генной терапии состоит в непосредственном нг.рцоиин необходимого генетического материала в клетки in vivo (Friedman, 1989). Генетическая терапия требует не только введения чужеродных последовательностей ДНК в эукариотические клетки, но также их стабильной и регулируемой экспрессии в новых условиях, а следовательно создания адекватных векторных систем переноса и экспрессии (Wilson, Grossman, 1992).
И настоящее время семейная гиперхолестеринемия (СГХ) и недостаточность альфа-1-антитрипсина (ААТ) являются относительно распространенными наследственными заболеваниями человека, молекулярные основы которых изучены достаточно хорошо.
СГХ - это моногенное наследственное заболевание человека, в основе которого лежит нарушение экспрессии и функционирования рецептора лииопротеинов низкой плотности человека (рЛНП), что в свою очередь ведет к развитию коронарной недостаточности в относительно раннем возрасте (Goldstein, Brown, 1909). В большинстве популяций частота встречаемости гомозиготной формы составляет 1:1000000, а гетерозиготной 1:500.
Недостаточность ААТ - заболевание наследуемое по аутосомно-рсцессшшону типу, его клинические проявления связаны с ранним
развитием эмфиземы лег'ких или цирроза печени, преимущественно в детском возрасте. О основе заболевания лежит нарушение секреции Л основного ингибитора сериновнх протеаз, в кровоток, которое проявляется в резком снижении его концентрации в плазме крови (Draiitly cl al., І908). Частота встречаемости данного заболевания варьирует от 1:1000 до 1:2Ь00 в различных популяциях Европы и Северной Америки (Crystal et al., 1909).
Представляется интересным дальнейшее развитие подходов к гешк терапии СГХ и недостаточности ЛЛТ путем моделирования их генетической коррекции на различных клеточных системах и путем создании тртнегешшх животных.
Дели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась разработка подходов к созданию модельных систем генетичесі коррекции СГХ и недостаточности ЛЛТ и моделирования этих заболеваи на клеточном уровне. Б задачи исследования входило:
создание реконбинантпых ДНК, содержащих нолноразмернне кДНК рЛ11 и ЛЛТ человека под контролем эукариотических промоторов и анализ v экспрессии в гетерологичиых животных клетках.
получение стабильно трансформированных клонов животных клеток, экспрессирующцх рЛНП человека.
изучение действия антисмысловых олигонуклеотидов на синтез эндогенного рЛНП человека и на синтез эндогенного ЛЛТ человека.
Положения выпоенные на защиту.
-
Показана временная экспрессия гена рЛНП человека в клеточной линии L9M (фибробласты мыши).
-
Получены стабильно трансформированные клеточные клоны (исходная клеточная линия - CHOLA3 - клетки яичника китайского хомячка), экспрессирующие рЛНП человека.
-
Создана рекомбинантная ДНК, содержащая полноразмерпую кДНК ЛЛТ человека, и проверена ее экспрессия в клетках CIIOLA3.
'1. Показано ингибирующие действие антисмысловых олигонуклеотидов н эндогенный синтез рЛНП и АЛТ человека в клеточной линии HepG3 (гепатоциты человека).
5. Создана антиеннсловая конструкция кДНК рЛНП, использованная в эксперпнента:: но получению трансгенных животных. Показано, что полученные "ранегешше животные содержат в своем геноме
аптионыеловые последовательности кДІІК рЛНП.
Научная новизна работы. Выполненная работа посвящена разработк' иу/Г'одпг! тс созданию модельных систен генетической коррекции сеиєйної 1*11 игрколеетеринении и недостаточности альфа-1-аптитриисина, а также ноин-п'.о создания генетических моделей данных заболеваний.
Проблема переноса генов с целью генетической коррекции заболеваний находится на ранних этапах своего развития. Поэтому, представляется актуальним реализация первого этапа ее решения, г'аг.лтчаї'іщсгося в создании модельных систем генетической коррекции и vitro і' in vivo.
Научно-практическое значение полученных результатов: ). Полученные рекомбинантные ДНК могут быть использованы в качестве поддон при проведении диагностики наследственной недостаточности ЛАТ.
Л Создание векторних молекул, эксирессирующих рЛІШ и ЛАТ человека г животных клетках дают возможность изучения терапевтического действия реконбшіантпнх рЛНН и ЛАТ в экспериментах на лабораторных животных. .!. Изучение действия антисмысловых олигонуклеотидов на синтез эндогенных белков (рЛНН и ЛАТ) в клеточных культурах открывает пути созд.тщн генетических неделей СГХ и недостаточности ЛАТ.
Апробация. Результаты работы были доложены I и II Всесоюзных конференциях по г'еиотерапии (Киев, июнь 1989г. и июнь 1990г.); на Всесоюзной школе-семинаре " Молекулярная биология и медицина " (12-13 пая 1<)90г..г.Ленинград). Тезисы работы были опубликованы в труда>: Пторсга Всесоюзного съезда медицинских генетиков ('1-6 декабря 1990г..г.Алма-Ата) и конференции " Молекулярная биология и медицина", (Москва, 1990). Но теме диссертации опубликовано 7 работ ii 1 находится в печати.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах и состой- из введения , обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 20 рисунками. Список литературы
1Ж.ІІІТП0Т НИ) источников.