Введение к работе
Актуальность темы. Медь относится к незаменимым компонентам пищи. Она необходима для нормальной жизнедеятельности клеток всех типов. Это обусловлено тем, что ионы меди являются кофакторами нескольких десятков ферментов, которые участвуют в таких жизненноважных процессах, как окислительное фосфорилирование, фотосинтез, посттрансляционное созревание пептидных гормонов, регулирующих деятельность центральной нервной системы у млекопитающих, формирование матрикса соединительной ткани у животных и клеточных стенок у растений, синтезе гемоглобина (Cousin, 1985; Brovwn et al., 1994). В то же время, как сильные нуклеофильные агенты, ионы меди при прямом контакте действуют повреждающе на все типы биомолекул.
Для контроля за поступлением, сохранением, распределением и экскрецией ионов меди у всех типов организмов существуют специфические метаболические системы, состоящие из белков, способных переносить ионы меди по каналам внутриклеточной и межклеточкой коммуникаций через гидрофильные и гидрофобные компартменты организма. Дисбаланс этой системы, вызванный как врожденными дефектами белков, так и экологическими причинами, вызывает у человека и сельскохозяйственных животных медные микроэлементозы (Авцин и др. 1994). Многие из них могут быть излечены при изменении количества меди в рационе.
Самые скромные подсчеты показывают, что в контроле баланса меди у человека участвуют более двадцати генов, которые экспрессируются в различные периоды онтогенеза. В настоящее время изучены лишь три белка, физиологическая роль которых і метаболизме меди установлена. Это, в первую очередь, церулоплаэмнн (ЦП) [К.Ф.1.16.3.1,], медьсодержащий гликопротеин альфа-2-глобулиновой фракции плазмы крови, который у млекопитающих выполняет роль универсального транспортёра меди. Известна. первичная структура молекулы ЦП (Takahasi et al., 1984), она совпадает с последовательностью выделенной из данных анализа последовательности нуклеотидов клонированного гена ЦП (Koshinsky et al., 1980). Установлено, что ген ЦП расположен на хромосоме 3 (Yang et al., 1986). Показано, что ЦП, циркулирующий в кровотоке, синтезируется исключительно в печени (В.С.Гайцхоки и др., 1991). Обнаружено, что ЦП присутствует в белках желчи (Verbina I.A. et. al., 1992), а его количество в ней отражает состояние метаболизма меди в организме (Iyengar et al., 1989, Puchkova et al., 1990).
ЦП передаёт ионы меди в клетки негепатоцитарного происхождения через специфический рецептор интернализующего типа (Harris, 1991; Пучкова и др., 1995). Изучена кинетика взаимодействия ЦП с его рецептором, определена молекулярная масса рецептора ЦП (Пучкоза и др., 1991. Frieden,
1993). Показано, что экспрессия гена этого белка регулируется по типу обратной связи (Сасина, 1995). Третьим известным белком, участником метаболизма меди, является металлотионеин, цитозольный белок, связывающий избыток ионов меди в клетках. Экспрессия гена металлотионеина в клетках различных организмов изучена на всех уровнях (Cousin, 1985). Кроме этого, клонированы гены двух белков, мутации в которых приводят к наследственным дефектам метаболизма меди (болезнь Менкеса и болезнь Вильсона).
Анализ литературных данных показывает, что сведения о молекулярно-генетическом механизме, регулирующем баланс меди, фрагментарны. Отсутствие их препятствует разработке нучно обоснованной коррекции медных мнкроэлементозов.
В связи с изложенным выше представляется актуальным изучение центральной роли печени млекопитающих в поглощении, распределении и экскреции меди на молекулярном уровне.
Цель исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении экспрессии гена церулоплазмина, универсального транспортера меди млекопитающих на уровне белковых продуктов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи. I .Изучить динамику синтеза и секреции ЦП in vivo и in vitro у лабораторных крыс.
2.Установнть связь между образованием множественных самостоятельных молекулярных форм ЦП и периодом онтогенетического развития. 3.Исследовать молекуляр/но-генетический механизм образования множественных молекулярных форм ЦП на уровне экспрессии гена ЦП у эмбрионов и у взрослых крыс.
Научная новизна работы. На интактных крысах, крысах с катетеризированными желчным протоком и шейной артерией, изолированных гепатоцитах и срезах печеночной ткани в пульс-чейз экспериментах продемонстрировано, что в гепатоцитах синтезируются три самостоятельные формы ЦП: ЦП сыворотки крови, ЦП желчи и внутриклеточный ЦП.
Показано, что в эмбриональной печени синтезируется только ЦП сыворотки крови. Синтез ЦП желчи и внутриклеточного ЦП наступает примерно через 10 дней после рождения и совпадает по времени с переходом эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип.
Анализ лолирнбосомнон РНК печени крыс в разные периоды онтогенеза с помощью специфических молекулярных зондов позволил установить, ufd каждая из трех молекулярных форм ЦП транслируется с различных мРНК, которые, по-видимому, образуются в результате альтернативного сплайсинга общего первичного транскрипта гена ЦП.
Научно-практическое значение исследования. Полученные данные дополняют сведения о роли ЦП в метаболизме меди. Показано, что в экскреций" меди значительную роль выполняет ЦП желчи, самостоятельная молекулярная форма ЦП, синтезируемая гепатоцитами. Результаты, представленные в работе, позволяют рассматривать множественные молекулярные формы ЦП как семейство белков, участвующих в переносе ионов меди в различных отделах организма. Данные об изменении содержания ЦП в желчи при контролируемом поступлении меди в организм могут быть использованы в качестве диагностической характеристики фенотипа метаболизма меди у пациентов.
Апробация работы. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах. Результаты доложены на Первом Российском съезде медицинских генетиков, Москва, 14-16 декабря 1994 г.
Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты и их обсуждение, Заключение, Выводы и Список цитируемой литературы.Работа изложена на ..?..страницах стандартного машинописного текста, содержит ..д..схемы, ...З..таблицы, .12.. рисунков. Список литературы включает .(.С...ссылок, в том числе .№$. на английском языке.