Введение к работе
Актуальность проблемы. Монооксягсназные системы, содержащие гемопротеины надсемейства Р450, открыты в животных, растениях, грибах и бактериях. Эти системы демонстрируют редкое многообразие субстратов и катализируемых реакций, различны по внутриклеточной локализации, способам переноса и переносчикам электронов на Р450. К настоящему времени идентифицированы более 160 разных генов, кодирующих Р450. Аминокислотные последовательности Р450 из разных семейств обладают низкой степенью сходства (некоторые из них имеют не более 10% совпадающих остатков) и отличаются по длине (иногда более чем на 100 остатков). Несмотря на такое разнообразие, общий план строения молекул всех Р450, по-видимому, одинаков ( ' ' , Tretiakov et al. , 193Э*4).
Одной из проблем, связанных с анализом после доззтельпестей Р4 50, можно назвать классификацию. В настоящее время номенклатура Р450, разработанная Nebert et al. и основанная на гонологии последовательностей, получила широкое распространение и постепенно вытесняет тривиальные наименования Р450. Однако эта классификация не свободна от ряда существенных недостатков. Gotoh6 применил более совершенный и объективный иерархический метод для сравнения последовательностей Р450. Тем не менее, критеркз деления Р450 на семейства я подсемейства на основе сравнения только аминокислотных последовательностей не разработаны, следовательно, это деление не формализовано.
Другая проблема, кмеющая много общего с проблемой классификации
- моделирование процесса молекулярной эволюции P4S0. В отличие от
классического филогенеза, сочетание сложеых механизмов
специализации Р450 - удвоения и конзерсин геноз, видовой
Nelson, 'C.R. G Strobel, II. W. (1933) J. Biol. Cher,. 2S3, 6038-6050.
Ouzcaivs, С. A. fi Kelvin. W. T. (1991) Eur. J. ВіосЬгя. 198, 307-315.
Г.ог-h, 0. (1092) J. Siol. Cher.. 257, S3-30.
Сенлх'с, с?мс:чен:-ю ( ;, см. z zr.YCK?. пу5л;:кгса:" (стр. 13).
ilebart, П. V. , Usli.or., D. г.. , <"con. к. J. , Ectebrcok, П. W. , ~?yczzir.!?"., R. , г-.ij ii -Kuriya:^., V. . Gonzalez. Г. J. , cnr.rigsrich, Г.1"'., i,i;;:33lus, Г. С. , Joh^sc-it, . F. , Loo=r. J. C. , Sato, P., !?.:?гг,яп, IT. 3. ^ ТГг^ггп, С J. (1391) С.Ул Celi ЕізІ. 10, 1-14.
Г--..:'',, С (1992) In ЛгсІіа?:о-.-, Л. І. and C:ch"5Tiova. G.I. (сйи) -- " сг-,-* >-.7ъ о-Г 7ПЛ ."-::U'i:-.-:.^ticrj.->I Con.fer~i?e.-: o.:j Віссйеглігіїґу and
днффгренцировкг, горизонтального переноса генов - и конвергенции создает в высшее степени запутанную картину.
Еще одна проблема - моделирование пространственной структуры Р450 - также связана со сравнением последовательностей. Сегодня известна трехмерная структура единственного Р450 - водорастворимого генопротеина F450cam из бактерии Pseudomonas putida'. При отсутствии другой информации такое моделирование ножет опираться только на сравнение исследуеных последовательностей с Р450са» и аппроксимацию его структур на гомологичные участки. В недавних работах по моделированию трехмерной структуры Р450 ( 9,10> Uvarov et al. , 1992 ) было достигнуто только локальное оптимальное выравнивание эукариотического P4S0 с Р450сш. Например, неизвестно, какую конфоркацж») имеют участки, вообще отсутствующие у Р450сат, т. е. "вставки" мембраносвязанный фрагмент.
Итак, налицо ряд глобальных нерешенных проблем, тесно связанных с анализом гомологии в надсекействе Р450: проблема классификации, проблема реконструкции процесса молекулярной эволюции Р450, проблема моделирования пространственной структуры Р450. Мы надеемся, что настоящая работа внесет хотя бы небольшой вклад в их решение.
Цель работы заключается в построении глобального множественного выравнивания известных аминокислотных последовательностей Р450 и оценке относительных расстояний между ними. Для. ее осуществления необходимо было решить ряд задач:
- выбрать алгоритм и параметры для построения глобального
множественного выравнивания аминокислотных последовательностей Р450
в полностью автоиатическом режиме;
с помощь» множественного выравнивания построить консенсусные последовательности для семейств и подсемейств Р450, а затем
построить множественное выравнивание полученных консенсусних последовательностей семейств (подсемейств) Р450;
7 Poulos, Т. L., Finzel, B.C. S Howard, A.J. (1987) J. Hoi. Biol.
195, 687-700.
8 Graham-Lorence. S. , Khalil, M. W. , Lorence, M. . Mendelson, С R. S
Simpson. E. K. (1991) J. Biol. Chem. 2S6, 11939-11946.
9 Morris. G. M. S Richards, W. G. (1991) Biochem. Soc. Trans. 19.
793-795.
0 Zvelebil. JtJ.J. M., Wolf. С R. and Sternberg. M. G. E. (1991) Protein Engineering 4, 271-282.
- провести сравнение консервативных докенов Р450 (локальное
множественное выравнивание);
- построить эволюционное дерево для надсемейсгва Р450.
Научная новизна и практическая значимость работы. Множественное выравнивание с иерархической кластеризацией аминокислотных последовательностей Р450 проводилось в полностью автоматической режиме, без какого-либо предшествующего или последующего ручного редактирования. Последовательности выравнивались с использованием четырех альтернативных матриц замен. В результате проведенного анализа было показано, что в надсемействе Р450 последовательности группируются в определенные устойчивые кластеры независимо от типа используемой матрицы замен и порядка последовательностей в списке ("сильная иерархия"). В то же время имеются неустойчивые группы Р450 ("слабая иерархия").
Предложен и обоснован нетод множественного выравнивания консенсусних последовательностей устойчивых групп гомологичных белков (например, семейств или подсемейств). Получены консенсускые последовательности для семейств и подсемейств Р450, которое ножно рассматривать ;:ак последовательности, наиболее близкие к предшественникам . данных групп. Впервые проведеяо множественное выравнивание 22 консенсусних последовательностей (под)семейств Р450 к 21 уникальной последовательности Р450, на основании которого построено принципиально новое эволюционное дерево надсемейства Р450. Существенно новым является то, что скорость эволюции для зтого дерева определяется скоростью эволюции консервативных подпоследовательностей Р450.
Предложен* и обоснован метод дифференциального (локального) сравнения консервативных участков белкорых последовательностей на ч основе множественного выравнивания, который может использоваться для ::сследсзаняя эволюции структурных и функциональных доиенов гомологичїплх белкОЕ. С понощью этого метода было проведено дифференциальное сравнение 5 консервативных участков Р450.
АтіроСаииг. р?-лоты. Основ лае результаты исследований докладывались на Есоссвзкой кенфзрезд?*:* "Ш.то::роп Р--450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1S89) и на VII Международной конференции "Биохимия и биофизика кктохрокя Р-450" (Москва, 1991). Апробация диссертации состоялась 16 сентября 19Г.З г. на совместной заседании
- 6.-
учебно-научного комплекса кафедры биохимик нгдикс-бяслогичссксгс факультета Российского Государственного университета ми. Н. И. Пирогова к Института биологической и медицинской химии РАКН.
Публикация. По материалам диссертации опубликовано'7 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 155 страницах, включая 6 таблиц и 33 рисунка, и состоит из введения, разделов: "Обзор литературы" (главы "Понятие о гомологии", "Алгоритмы парного и множественного выравнивания биологических текстов", "Методы построения эволюционных деревьев", "Надсємейство Р450"), "Иатериалы и методы", "Результаты и обсуждение", выводов, благодарностей и списка цитируемой литературы.