Введение к работе
Актуальность проблей*
Расісритне биохимических механизмов взаимодействия организма и опухоли принадлежит к одной из самих актуальних проблем современной биологии и медицини. В первую очередь ото связано с тэм, что ь целостном организме неопластическая трансформация ткапк приводит к многочислегамм нарушениям метаболических звеш,ев обмома пєщ'істг; и энергии в органах и тканях, непосредственно не затронутых опухолевый процессом, что, в своь очередь, обуславливает нарушешт тканевого гомеостаза. Необходимо отметить, что советский ученым принадлежат приоретет в развитии общих подходов и концепция к ргз7лгпго метаболической депрессии, вызванной системним влиянием опухолевой ткани на организм и его защитных реакции (Р.Е.Кг.пєцїіиї'і, 3'.f!l, J.903; В.С.Шапот, 1975; В.М.Дильиаи, 1083; Г.И.Потапова и В.С.Шяізої,1937).
К настоящему времени получено много дачних о разнообразных нарушениях обиена веществ, возннкаіог;нх иод шылниим опухолевого процесса. Эти нарушения затрагивают белкозий, углеводной, лгоіидшй, водно-электролитиий и другие виды обмена (е. т. days, vr/ii
V.S.Shapot, 1979; B.Wocd et al., 1902). KpOMQ ТОГО, В ОІїуХОЛеііОМ
организме наступают специфические изменения в таких системах, как
реТИКуЛОЗНДОГеЛНадЬШіЯ (Tj.bifnecerrAf & D.Clnrk, 19Ы), ЗІ/ДОКріШНаЯ
(Е.М.Сануїїдяан, 1973; В.М.Дильиан, 1384), иммунная (Ю.А.УмансьиЛ, В.Г.Пинчук, IS82; В.В.Городнлова, МЛІ.Воепа, 1983) и друг'/л. Другими словзми, метаболическое, давление спухоли, оказываемое на Функциональное состояние различных систем организма приводит к разнообразны;.! растропствам гомеостаза, ускоряюцу.м, а во многих случаях и опредкллющш летальний исход.
Получегашо к настоящему времаїш результаты позволяют обсуждать конкретные биохимические механизма взаимодействия опухоли и организма, однако, необходимо отметить, что изучеіше процессов, протекающих в оргашізме-опухоленоситйле на молекулярном уровне находится в начало саоого пути. Дальнейшие исследования в этом направлении цогут иметь большое значение, для понимания этиологии и патогенеза "раковой болезни", а таило д/>я разработки путе!' резистентности организма к развитию'неоплазмы (Р.Е.Кэвецкий, I9G2),
В ряду систем, ответственных за сохранении гемеостази
целостного организма, одно из ключевых иест принадлежит ферментным системам обмена пуршювых и гогримидановых соединений. Вшіолияя "замечательное разнообразие функций" (АЛеішндаер), оші принимают у частое почти во всех видах обмена, являясь предшественниками нуклеиновых кислот (ГШК), npouesyточными продукташі биосинтеза углеводов и липидон, компонентами основішх коферіюіггов и переносчиками свободной энергии. За последнее десятилетие накоплено . много дашшх о физиологических и регуляторних функциях иуклеотидов и их произиодшх ' в контроле пролиферзтивной и функциональной активности клеток (t.hovi at at., 1977). Особеїшо пристальное внимание уделяется исследованиям особеїшостей обмена пуринових соединений в лимфоидной ткани и иммунокомпетентных клетках, в которых оші играет ретащую роль в регуляции пролиферации, диффереициротш и осуществлении функций (С.Н.Храмцова с еоавті,
1984,1986; Д.И.ЇИЛаїЮВСКаЯ С СОаВТ., 1987; О.J.Peters & J.H.Vbbi" kamp, 1<ї83; A.Cohen Ь J .Barani:ie»icz, 19B6).
Известно, что развитие неоплазмы сопровождается перестройкой Функционирования ферментных систем обмена ПИК в самих опухолевых клетках, связанной с резкими изменениями потенциальной активности ферментов биосинтеза иуклеотидов tie? novo, реутилизацш иуклеозидов и азотистых оснований, а гакяе ферментов их катаболизма (В.С.Шапот, Г.К.Потапова, 1986; и.ирьег, 1977,1903). С другой стороны, в ряде работ было показано, что в ткапях оргакизиа-хозтша выявляются нарушения нуклеинового обмана, изменений характера биосинтеза предшественников нуклеиновых кислот, особенностей транспорта через плазматические мембрана различных клеток и даМюренциальпой чувствительности к нуклеозидан и осхюпаїшяи (R.BaserQa &
W.E.Rir,n?leb(;i, 19615 T.Sirasaki & S.Fujii, 1975). ОДІИКО фраГМЗЦ-
тарность этих исследований не позволяют провесп: как систематизацдо знаний об особенностях содержания и метаболизма нукяаотидов в тканях, так и коітлексную сцепку нарусенай нуклеинового обмена в организме іфи канцерогенезе.
В то ке время, сопоставление особеїшостей пуклепкового обмена в
самой опухоли и тканях организма-опухолепоептеяя позволяет выяснить
N . характер их взаимодействия и определить конкрзткыв механизм,
благодаря котором каздал опухоль преобрзтает мзтаболкческио
преіщуїцества для ее роста (В.СЕапот а Г.И.Потапова, 1936).
Подобный подход нуждается в определении начальных,
проиєжуточшх н конечных субстратов слохных метаболических целой is различных ткаїшх опухолевого органнгиа, а также транспортних характеристик пуринових и пнригшдиновых производных в солоставлел.ш с активностью фериентов их метаболазиа.
Цель и задачи исследовании
Цель работы заключалась в изучении обмена пуриноеых и пнрииидшювих соединении в органах и тканях организма на разных стадиях развития опухолевого процесса и роли июткаиепого сопряжения их иетаболизыа и транспорта, опосредуемого зритроциташі крови, в системе становления таиноотношзннп "опухоль-органиэц".
Поставленная цель вшшчала в себя рзтения следувдо. конкретних задач:
1 - разработку н оптимизации различных методов ггиеоког^фехтаеноЛ
жидкостной хроматографии (анмонообызкксД, обращышо-^'^.г.-поа п иои-ларноп) для анализа качественного и количественного соет;л.іг< свободных нуклаотидов, нуклесзидов 'л азотистых оснсі'аіиїй в биологических образцах.
2 - выявление основних оеобеїшостеп формирования пула пуринових и
пнріпшдініових соединений в печени и аритровдтох кропи ччмвЯ, соответствующие начальной, экспоненшалъцей и стационарной стадиям, роста гепатоии 22, а также асцнтноД опухоли Эрлиха.
3 - исследований динамики интенсивности включения ыеченнх пуринових
и гшримидиноиих нуклеезидоп vl их оснований в печень л эритроциты в условиях ).л vivo и і'і vitro с помоііью р.эдиолзотоштих II хрсиатогркфическнх методов исследования с применением проточного радиоизотолного детектора.
4 - изучение тканеспеїглфкчностц нуклеогидного состава гелатош 22
в процессе ее развития с помощью хрсиатогра&гтсских м радиоиэотопкнх методов исследования,
5 - исследование характера взаиыоотпеившй иь-лщ различиям стадиями.
роста гепатоии и регепернрущеЙ; после операции частичное гепатэктоыил печеный на уровни пурпндвого обмена н сопоставлении с иорфологачосктш харшетеристлкаш пролиферации гопатоцитоп.'
6 - изучение основних закономерностей нн-.-енсканости транспорт
пуринових соединений в лшфоциты тимуса и селезенки даней о
процессе роста гелатоїш на основе разработанной формули расчета метаболического потока соединения в систеие
"эрИТрОЦИТЫ-ТКМСЩПи" В УСЛОВИЯХ in vivo.
7 - аналяз изменений в метаболических потоках пуринових соединений из эритроцитов и лимфоциты in vitro, выделенных на разных' стадиях роста геяатоыы, с помощью проточного радионзотошюго детектмровашг в высокоэффективной жидкостной хроматографію.
Научная новизна работы
Впервые предпринято систематическое исследование закономерностей обмана пуринових и пиримидиновых нуклеотидов, нуклеезидов и их оснований в различных органах и тканях организма с опухолью, а также в ткани солидной гепатоыы 22. Для этого били разработаны различные методические подхода к анализу как всего пула ПНК, так и отдельных групп этих соединении в биологических образцах с помощь» использования нон-парных реагентов в ВЭЖХ.
Впервые получены детальные качественные и количественные характеристика пулов пуринових, и пиримидиновых производных в печеїш, эритроцитах, тииоцитах и сшіенонитах организма-хозяина в условиях возникновения и роста злокачественной гепатоиы 22 н асцитного рака Эрлиха. Показано, что различный стздияи развития опухоли сопутствует глубокая перестройка функционирования ферментных систем обмена пуринових и шфинидшювых соєдіпіений в тканях оргашізиа, что шраяается в резких изменениях состава ПНК и характеристик интенсивности транспорта метаболитов в эти ткани.
В работе впервые обнаружена "активация катаболнзиа пуринов в
печени животных в экспоненциальную стадии роста гепатсии, что
сопровождается возрзсташіен концентрации промеї^точшх пурииовых
метаболитов в ткани печени и, одновременно, в эрнтроцгггарной фршщан
крови, которые активно ' аккумулируют пуриновыэ пуклеозиды ' в
основашш. Сравнительная кинетика включения иечекыхпуршшв в .печень
и эритроциты крови в процессе роста гепатоиы подтверздзет зто
положение. " -.
Получены новые данные -о роли эритроцитов, как транспортной системы переноса ПНК между органами и тканями организма. В -период максимального роста опухоли из состава эритроцитов исчезаэт ключевые метаболиты пуршювого ряда. В то же время, на всех стадиях роста сак солидной гепатоиы, так и асцитного рака- Эрлиха в эритроцитах
прослеживается одна и та же закономерность: накопление фосфорилировашшх форы аденшюьых и гуанинсвих нуклеотндо;), связанное с активацией пуринових киняз.
В работе получеш новые даншє о<5 огя-бенностлх иетаболнч* ског с пула пуринових н пирішидонових соединений в ткаїш растущей гепэтони. Показано значительное повшение фонда гуаиинорнх нуклеотидок г: одновреыешми дефицитом адеішлатов, а такла активное аккуцуліфовглип клеткаші гепатош пуринових основании из крови.
Впервые била исследована экспериментальная моделі, регенеріфуюцей печеїш после операции частичной гепатгктсши, выполненной на фоне роста опухолевой ткаїш. Эти. позі-.олило виявить закономерности ([юриировашш нуклеотидшх пулов, как в ткянм. г.очеки, так и в эритроцитах крови гивотшх, соответотьуип'и ачтипации и подавлению пролифератишюй активности гепатоцитов в экепскен/пм.г.ыг/ю и стационарную стадии роста гелатода в орхтншзме-опухолокоситоле.
Разработанная формула расчета метаболических погокоь сс^-дикептй
ИЗ ЭрНТрсЦИТОЗ D ТИМ01ПІТІ1 Я СПЛЄН01ПІТЦ В УСЛОВИЯХ ir. vivo С ПОМОГ,!.»
импульсного введения печеного соединения позволила получить характеріїстиші транспорта пуринових нуклеомідов и оснований, вклмчаифіо » с«бя обратно пропорциональную загітсішосгь меялу интенсивностью транспорта гтшог.ссаішша в тимоцитн и «го внутриклеточной концентрацией в экспоненциальную стада» рости гепзтомн. Для шюзина это соотношение било пряно прэпорцдюнчлыпдм.
Пр".пщиішально новим является разработанная подход п аналізу метаболических потоков соединений мехду различными клеткаші с помощью прішенеіиш' проточного радиоизотопкого детектирования в СЗЖХ. Вларвію били паГідени закономерности обілена пуринов в тимоннтах и эритроцитах .крови в условиях опухолевой прогрессии и показан; наличие сопрядепной системі транспорта и обиена пуринових соединений между крвснтгл клеткаш крови и лимфоцитами тіаіуса, поскольку аккуиуліфовашкш в эритроцитах ыетка была зарегистрирована т, ПШ0Щ1ТУХ после их совместной инкубации, с -. эритроцитами, причем в большей стйпеїш в видв.адеіюзшшонофоЬіюриой КИСЛОТЫ, '
В результате проведенного анализа . особоїтостей фотлафов&ш-,; ткпноспєци'імчтоах пулов свободшх ПНК., и их транспортних хярактервотп.. сформулировано представление о функциональной системе меаткаие^сг, сопряжения метаболизма пуринових и нирйимдиінсанх производто», которая включает в себя альтернативные пути vu биосинтеза (.jt. по-/., и
Ewiivjgu), китаболнзиі л^д-иоріа и ушизаци и функционирующая d режима гоиеостаза.
Научно-практическая значимость работы
Работа представляет ссбсЬ экспериментальное исследовашю закономерностей наручіьішй нуклеинового обмена в тканях опухолевого организма. Практической значение имеют разработанные хроматографические методики оптимизации разделения свободных ПИК в биологических образцах с учетои тканевой и клеточной специфичности состава пуршюиых и ішрш.мдико.шх соединений. Полученные данные раскрывает одно из звеньев метаболических нарушений при канцерогенезе, и могут Сыть использованы для разработки ковш; прл;и;шюь терапии злокачествешых новообразований с помощью естестшшшл метаболитов пуринового и пиримидшювого рада и аапраьлошшх на регуляцию и коррекцию ферментных систем обмена ПИК d тканях организма и, особенно, ишунокомпетентных органах.
Основные положения, вшюсгшие на защиту
і. Формирование пуринового и пяримидішового пула в печени и гепатомэ 22 в процессе со развития в организме обнаруживает тесную язаимозаиисимооть, опосредованную эритроцитами крови, что приводит к качественному и количественному перераспределению состава свободных продаестьсішикоіі ПК и отих тканях, вклвчакцему п себя:
- активацию биосинтеза гугниновых нуіиісотидов в клетках гепатоаы с
одноърештвил дефицитом адоннлатоп (ссобеїшо атї? ), а такке резкое
УбояііЧсіоіє концентрации пуринових оснований, связаннее с псапсєкноП
акиуиуляцней оауходаЕнжі глетками аденіша, гуанина н гипоксаігтшіа из
крозн оргашзиа-хозягаїа, что указшзат на специфический характер
сииана пуринов в опухолевой ткаїш. '-
актиьацка катаболизма пуринов. в почепи кзівотпих е йкспоненциальпу» стадия роста гепатопы с одновремэшми накоплением инозина, гипоксаитина, ксашшіа и мочевой іаіслотьі к З-u суткам.
- возрастание концентрации здонпнових и гуаншювих нуклеотмдов в эритроцитах крови на всех стадиях роста гепатокы.
резкое увеличение концентрации пуринових нуклеозвдов 5» оснований ,в эритроцитах в первые трое суток роста гепато.'яі. . -
истечение эритроцитов пуриновими иуклеозадаиї и основаниями' к моменту достіиения клетками гепатоиы цапепыалыюй скорости роста
(5-7 сутки после шюкулящш опухолевых КЛЄТОК)'
2. экспоненциальная стадия роста гепатомы 22 приводит і
подавлению пролиферации гепатоцитов через 42 часа после операции
частичной гепатэктоша$и вымывает активацию катаболіюма п/рунсил
ігуклеотидов в регенерирующей печени. Стационарная фаьа р:>;."г?
гепатомы 22 стимулирует пролиферативше процессы и ригонирирушчЛ
печени и активирует биосинтез адешшовш и гуаншюных нуклеотадов.
Частичная гепатозктомия, выполненная на 5-ые. сутки роста
гепатош вызывает увеличение концентрации нуриноьых нуклоотидов ri
эритроцитах крови мышеп-опухоленосмтелой. На І2-іі'з суть*. рост&
опухоли в эритроцитах резко снижаются концентрации гушиюпих
нуклеотвдов и ivip и ьозраотьш уровни содержании гг, ш.о~нна и
аденозина.
3. Функциональны» и пролиферативше изменения а лии^сцмяи
тішуса и селезенки шшей сзна в процессе роста генатоии ?2
сопровождаются значительными изменениями ьнутриюіеточноі'о
иетаболизма пуринов, характер которого, в ском очеродь, ї.гшисит от
транспортных характерней^ in vivo нуіслеозидоіз и оснований. Ряиоаюе
выраленные изменения транспортних характеристик были найдены г,
клетках тішуса в і-s сутки роста опухоли и вклпчалн:
- резкую- активацию интенсивности транспорта пшоксактин» в ткмоипти
на 3-5 сутлш роста гепатомы.
- обратно пропорциональную зависимость цеаду интенсивностью
транспорта гипоксантина в тимоцити и его внутртіклеточноп.
концентрацией и прямо пропорциональную зависимость отих показателей
для инозина в экспоненциальную стадії» роста гопатош.
4. Метаболические поташ ггаокеашхшз я его производим/, аз
эритроцитов в лимфоциты чимуса сопряжены с -'реакциями утилизаци*'.
ПурМНОВ "яяІУаде'*-фериеНТГіМИ ТОДОЦИТСй И 14МЄЮЇ шражег.ную
зависимость от стадии роста опухоли и организма.
s. Ка уровне целостного организма существует системи иеэтканеного сопряжения метаболизма ,. свободных прьдшоствешіикон нуклеиновых кислот, включающая в себя альтернагявние пути Оиосинт>"..-з;> die novo и -saivaqw"), катаболизма, транспорта и утилизации нуклеотидок, пуклеозидов и их оснований, фупкц>лшруюцая в р«іи>і;: гоу.зостаза.
- я -
Апробация работы
Материалы .щссергации докладывались на I Всесоганой конференции "Хроматография и биологии и медицине" (Москва, 1983), III Всесоюзной симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Рига, 1984), v Всесоюзной биохимической съезде (Киев, 1985), v Международной Дунайском симпоки.'-че по хроматографии (Ялта, 1985), Международном симпоЕ.иуме "Хроматоірафия в биологии и медицине" (Москва, 1986), iv Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата,' 1987), X Международном симпозиуме "Биоиедицинское применение хроматографии и электрофореза" (Прага, 1988), Мевдукародноа симпозиуме по гипоксии (Берлин, 1988), Научной конференции Института . биохимии Берлинского Ушшерситета им.Гумбольдта "Метаболизм нуклеотидов и его применение в биоиедицинских исследованиях" (Берлин, 1988), vin Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканна лекарственных вецеств
. "Компоненти нуклешових кислот" (Рита, 190Э), vu Международном Дунайском симпозиума по хроматографии и электрофорезу (Лейпциг, .1989), XII Мйздукзродноц симпозиуме по структуре и функции эритроцитов (Берлин, 1989), xt Иездународнои симпозиуме "Биомедицинокое прішенешш хроматографии к электрофореза" (Таллин,
,1990), y Есесоюном симпозиума по молекулярной' жидкостной хроматографии (Рига, 1990), 7-м Мездународнон симпозиуме "Пуршювый и іпіріїмидиновий метаболизм у человека" (Еониас, Англия, 19Э1).
Публикации результатов исследования
Пс теме диссертаціш опубликовано 45 основных работ, в том числе 21 работа на английском языке. Получено з авторских свидетельства us изобретения.
-і - i Объем и структура работы
Диссертация состоит из введеїшя, обзора литературы, глава
"Материалы и методы исследования", 6 глав экспериментального
материала, заключения,' выводов и списка цитируемой літератури.
Диссертация изложена на 20*1 странице, включая 23 таблицы а Б71
. рисунков. Список литературы содержит 54 отечественных и- . I9S
зарубежных источников. . .