Механизм ингибирования Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума мелиттином Маст Наталия Владимировна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Саркоплазматтгческий ретикулум (СР) скелетных мышц, играющий ключевую роль в регуляции мышечного сокращения, представляет собой замкнутую систему цистерн и трубочек, пронизывающих саркоплазму в непосредственной близости от миофибрилл. В ответ на деполяризацию сарколеммы из терминальных цистерн СР через Са-каналы (рианодиновые рецепторы) в цитоплазму выбрасывается Са²⁺, происходит образование актомиозинового комплекса и сокращение мышцы (Martonosi, 1984). Повышение концентрации кальция в цитоплазме активирует Са-АТФазу, встроенную в мембраны продолговатых трубочек ретикулума, которая обеспечивает перенос ионов Са²⁺ из цитоплазмы во внутреннее пространство ретикулума. Это приводит к снижению концентрации кальция в цитоплазме и расслаблению мышцы (Inesi, 1985).

Са-ЛТФаза СР относится к семейству АТФаз Е1-Е2-типа (или Р-типа). Ферменты этого семейства используют энергию гидролиза АТФ для транспорта катионов через биологические мембраны против электрохимического градиента. В процессе каталитического цикла происходит изменение конформации молекулы фермента, приводящее к изменению сродства АТФазы к переносимым катионам (Moller et al., 1996). В настоящее время известна первичная структура Са-АТФазы (MacLennan, 1990) и получены данные об организация пояипептидной цепи фермента в мембране СР (Green, Stokes, 1992). Механизм функционирования Са-АТФазы СР к настоящему времени довольно хорошо изучен и описан в ряде обзоров (De Meis et al., 1996; Maclennan et al., 1997). Ферментативный цикл начинается с активации Са-АТФазы, находящейся в Е1-конформации, за счет кооперативного связывания двух ионов Са²⁺ с ферментом со стороны цитоплазмы. После связывания кальция фермент фосфорилируется АТФ по остатку Asp-351. Фосфорилирование индуцирует конформационный переход Са-АТФазы из состояния Е1 в Е2, характеризующееся низким сродством к кальцию. Изомеризация фермента со связанным кальцием приводит сначала к «окклюзии» катиона внутри молекулы фермента (при этом он становится недоступным для обмена как с внешней, так и с внутренней стороны мембраны), а затем к его переносу во внутренние полости ретикулума (De Foresta et al., 1990). После Mg-зависимого гидролиза фосфофермента с освобождением Ф_и в цитоплазму цикл транспорта Са²⁺ завершается изомеризацией фермента из Е2 в Е1 копформацию.

Зависимость активности Са-АТФазы от концентрации АТФ не описывается-гиперболой: в области высоких концентраций субстрата наблюдается дополнительная

активация фермента (Yamomoto, Tonomura, 1967). Измерение кинетических параметров гидролиза АТФ Са-АТФазой в разных диапазонах концентраций субстрата позволило раду авторов определить два значения К_м для АТФ - около 10 мкМ и около 400 мкМ (в области низких и высоких концентраций АТФ соответственно) (De Meis, Inesi, 1982). Одни авторы объясняют активацию фермента в области высоких концентраций АТФ наличием на молекуле Са-АТФазы дополнительного регуляторного (аллостерического) центра связывания АТФ, характеризующегося низким сродством к нуклеотиду. Связывание АТФ с этим центром приводит к увеличению ферментативной активности (Coll, Murphy, 1991). Однако существование дополнительного центра связывания АТФ на молекуле Са-АТФазы пока достоверно не показано (Minz, Guillain, 1996). Второе объяснение негиперболической зависимости скорости гидролиза АТФ Са-АТФазой от концентрации нуклеотида заключается в том, что Са-АТФаза имеет один участок связывания АТФ (гидролитический центр), который изменяет свое сродство к субстрату на разных стадиях реакционного цикла (White, Dewey, 1987). Предполагается, что Са-АТФаза в конформации. Е1 имеет высокое сродство к АТФ, а после перехода фермента в конформацяонное состояние Е2 и освобождения продуктов реакции активный центр приобретает низкое сродство к субстрату. Скорость гидролиза АТФ Са-АТФазой лимитируется скоростью конформационного перехода Е2-Е1. Поэтому связывание АТФ с гидролитическим центром Е2-конформера Са-АТФазы (имеющим низкое сродство к нуклеотиду) приводит к образованию фермент-субстратного комплекса и значительно ускоряет конформационный переход Е2-АТФ - Е1-АТФ (реакция протекает по пути релаксационной кинетики) (Champeil et al, 1988).

Еще одно объяснение предполагает, что негиперболическая зависимость активности Са-АТФазы от концентрации АТФ является следствием взаимодействия активных центров молекул фермента, объединенных в олигомерные комплексы (Ikemoto et al., 1981). Присутствие в мембранах СР таких олигомерных комплексов (преимущественно, тетрамеров) было продемонстрировано многими исследователями с использованием различных методических подходов: радиоинактивации (Hyrael et al., 1984), метода ковалентних сшивок (Murphy, 1976; Geimonen et al., 1994), миграции энергии флуоресценции (Vanderkooi et al., 1977), анализа вращательной подвижности фермента в мембране методами ЭПР с переносом насыщения (Hidalgo et al., 1978) и затухания анизотропии фосфоресценции (Birmachu, Thomas, 1990; Рубцов и др., 1994). В нашей лаборатории было высказано предположение о том, что Са-АТФаза в мембранах СР существует в двух, формах: мономерной и олигомеркой. Мокомерцая форма фермента обладает высоким сродством к АТФ, тогда как активные центры

з фермента в составе олигомерных комплексов имеют низкое сродство к субстрату. При низких концентрациях АТФ (до 100 мкМ) активны только мономеры фермента, которые гидролизуют АТФ согласно кинетике Михаэлиса-Ментен, а при повышении концентрации субстрата происходит кооперативное насыщение активных центров молекул фермента, объединенных в олипжерные ансамбли, что и приводит к дополнительной активации Са-АТФазы (Болдырев, Рубцов, 1982; Лугцак и др., 1983).

В отличие от АТФ, другие нуклеотиды (ГТФ, ЦТФ, УТФ), а также искусственные субстраты (п-нитрофенилфосфат (пНФФ), ацетилфосфат, карбамаилфосфат и ряд других) гидролизуются Са-АТФазой СР в соответствии с кинетикой Михаэлиса-Ментен (Rossi et al., 1979; Casswell, Brandt, 1981; Рубцов, 1981). По-видимому, взаимодействие этих субстратов с активным центром фермента значительно отличается от взаимодействия с ним АТФ.

Активность ион-трапспортар}тощих АТФаз регулируется как ионным составом цитоплазмы и структурным состоянием липидного бислоя мембран (Starling et al., 1995), так и некоторыми эндогенными белками-регуляторами, которые взаимодействуют непосредственно с молекулами этих ферментов. Так, Са-АТФаза плазматических мембран регулируется Са-связывающим белком кальмодулином (Carafoli, 1991), Са-АТФаза саркоплазмагического ретикулума сердца - интегральным мембранным белком фосфоламбаном (James et al., 1989), а Н,К-АТФаза слизистой оболочки желудка -недавно открытым белком с молекулярной массой 67 кДа (Cuppoletti et al., 1993). Этот белок был обнаружен и очищен с помощью антител против мелиттина -амфипатического пептида из пчелиного яда, вследствие чего оп был назван мелиттин-подобным белком (МПБ). Показано, что МПБ активирует транспорт протона Н,К-АТФазой слизистой оболочки желудка, хотя сам мелитпш ингибирует этот фермент (Cuppoletti et al., 1995). Предполагается, что в тканях млекопитающих могут присутствовать регуляторные белки, имеющие в своей структуре участок, напоминающий по структуре молекулу мелиттина. Мелиттин ингибирует не только Н,К-АТФазу слизистой оболочки желудка, по и №Д-АТФазу плазматических мембран и Са-АГФазу СР и плазматических мембран (Cuppoletti, 1990; Baker et al., 1995; James et al., 1988). С использованием фотоаффинного аналога мелиттина было установлено, что мелиттин взаимодействует как с Н,К-АТФазой и Ка,К-АТФазой (Cuppoletti, 1990), так и с Са-АТФазой СР (Cuppoletti, Malinowsra, 1992). Была определена аминокислотная последовательность участка связывания мелиттина в молекуле Н,К-АТФазы (MI(603)DPPRAT). Этот участок находится в нуклеотид-связывающем домене фермента (Cuppoletti, 1990). Близкие по структуре последовательности - M1(591)DPPRAA и

ML(600)DPPRKE - представлены в нуклеотвд-связывающих доменах всех изоформ Ыа,К-АТФазы и Са-АТФазы соответственно (Sweadner, 1985; Carafoli, 1991). Механизм ингибирования Са-АТФазы мелиттином до настоящего времени детально не исследован, однако в литературе существует две точки зрения о механизме его действия на этот фермент. Одни авторы связывают ингибирующее действие мелитпша на Са-АТФазу с его встраиванием в липидный бислой мембран СР, что вызывает агрегацию молекул Са-АТФазы за счет уменьшения подвижности липидов и нейтрализации зарядов на молекуле фермента в области контакта мембрана-водная фаза (Voss et al., 1995). Согласно другой точке зрения, ингибирование активности Са-АТФазы мелиттином связано с его прямым взаимодействием со специфическим центром, расположенным в гидрофильном домене молекулы фермента (Cuppoletti, Malinowska, 1992; Baker et al., 1995).

Цель настоящей работы заключалась в изучении механизма ингибирующего действия мелитпша на Са-АТФазу СР. Кроме того, предполагалось получить антимеяиттиновые антитела и с их помощью выделить из различных тканей кролика мелитпш-подобные белки с целью анализа их возможного регуляторного воздействия на Са-АТФазу СР. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи: определить тип ингибирующего действия мелитпша на Са-АТФазу СР; проанализировать влияние рН и субстратов Са-АТФазы («аллостерического» субстрата АТФ и «неаллостерического» субстрата ГТФ) на ингибирование ферментативной активности; исследовать характер ингибирования солюбилизированной С12Е9 мономерной формы Са-АТФазы мелиттином; определить кинетические параметры ингибирования мелиттином гидролиза «неаллостерического» субстрата пНФФ Са-АТФазой; оценить влияние факторов, индуцирующих агрегацию Са-АТФазы в мембранах СР, на ингибирование фермента мелиттином; с использованием антимелитшновых антител протестировать ткани кролика на наличие мелиттин-подобных белков; выделить эти белки и оценить их влияние на активность Са-АТФазы СР.

Научная новизна работы. Впервые показано, что мелитган является необратимым ингибитором Са-АТФазы СР скелетных мышц кролика. Процесс ингибирования Са-АТФазы мелиттином во времени может быть описан суммой двух экспонент, характеризующих быструю и медленную фазы инактивации фермента. В условиях значительного молярного избытка мелиттипа по отношению к Са-АТФазе (реакция псевдопервого порядка) константы скорости инактивации Са-АТФазы в быстрой и медленной фазах различаются в 10 раз. Проведен анализ влияния рН и

субстратов Са-АТФазы на процесс ингнбирования фермента в быстрой и медленной фазах инактивации, который позволил заключить, что ингибирующее действие мелиттина в обеих фазах обусловлено его взаимодействием с молекулой фермента. Исходя из этого, ингибирующее действие мелиттина на Са-АТФазу было описано в рамках модели, предполагающей существование мопомерной и олигомерной форм фермента в мембранах СР. Исследование интибировагом Са-АТФазы, находящейся преимущественно в мономерпом или олигомерном состояниях, позволило сделать вывод о том, что быстрая фаза иитибирования отражает взаимодействие мелиттина с олигомерной формой фермента, а медленная связана с ингибированием его мономерной формы. С использованием аггпгмелитгиновьгх антител в скелетных мышцах и слизистой оболочке желудка кролика обнаружен 67-кДа мелиттин-подобный белок. Впервые показано, что данный белок, выделенный из цитозолыюй фракции слизистой оболочки желудка кролика, активирует Са-АТФазу СР.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования расширяют представления об организации Са-АТФазы в мембранах СР и возможностях регуляции этого фермента эндогенными белками. Подходы, примененные в данной работе, а также полученные результаты могут использоваться при изучении функциональных особенностей Са-АТФазы и других АТФаз Е1-Е2-ткпа. Результаты данной работы используются при организации экспериментальной работы студентов и аспирантов кафедры биохимии Биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на научных семинарах кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-96» (Москва, 1996) и «Ломоносов-97» (Москва, 1997), на II Всероссийском Съезде Биохимического общества (Москва, 1997), па II Съезде Биофизиков России (Москва, 1999).

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 3 статьях и 2 тезисах докладов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложеїшя результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит машинописного текста, таблиц и ^^рисунков. Список литературы включает^Я/7 источников.