Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 8
2.1. Введение 8
2.2. Истины морских беспозвоночных 11
2.2.1. Происхождение, локализация и биосинтез лектинов 12
2.2.2. Функции лектинов в организме 14
2.3. Углеводная специфичность лектинов 15
2.3.1. Моносахариды 15
2.3.1.1. GalNAc/GlcNAc специфичные лектины 18
2.3.2. Олигосахариды и полисахариды 19
2.3.2.1. Маннан-связывагощие белки 20
2.3.3. Углевод-содержащие гетерополимеры 22
2.3.3.1. Гепарин-связывающие лектины 24
2.4. Строение углевод-связывающих сайтов лектинов 32
2.5. Биологическая активность лектинов 38
2.6. Заключение 41
3. Материалы и методы 43
3.1. Материалы 43
3.2. Выделение лектинов 46
3.2.1. Выделение DTL-А 46
3.2.1.1. Получение аффинного сорбента 46
3.2.1.2. Приготовление экстракта асцидии Didemnum ternatanum 46
3.2.1.3. Гель-фильтрация DTL-A на Sephadex G-150 46
3.2.1.4. Аффинная хроматография 47
3.2.2. Выделение и очистка лектинов из Serpula vermicularis 47
3.2.2.1. Получение перекрестно-сшитого сорбента Ova-BSM 47
3.2.2.2. Приготовление экстракта Serpula vermicularis 47
3.2.2.3. Аффинная хроматография 48
3.2.2.4. Хроматография на DEAE-Toyopearl 48
3.2.2.5. Гель-фильтрация на Sephadex G-150 48
3.3. Определение молекулярной массы и гомогенности лектинов. 49
3.3.1. SDS-электрофорез 49
3.3.2. Гель-проникающая хроматография . 49
3.3.3. Вестерн-блоттинг. 50
3.4. Твердофазный анализ взаимодействия лектинов с гликоконъюгатами и сахарами. 50
3.4.1. Конъгогаты лектинов с пероксидазой из хрена (ПХ) 50
3.4.2. Взаимодействие лектинов с гликопротеинами 51
3.4.3. Ингибирование связывания лектинов со специфическими гликопротеинами 51
3.5. Исследование физико-химических свойств лектинов 52
3.5.1. Эффект рН на взаимодействие лектинов со специфическими лигандами 52
3.5.2. Температурная зависимость взаимодействия лектинов с их лигандами 52
3.5.3. Эффект дивалентных катионов на активность лектинов. 53
3.6. Определение биологической активности лектинов 53
3.6.1. Определение цитотоксичности 53
3.6.2. Ингибирование репликации ВИЧ-1 Шп 53
3.6.3. Ингибирование лектинами межклеточного слияния (ингибирование синцитиеобразования) 55
4. Результаты и обсуждение 57
4.1. Выделение DTL-A 57
4.2. Свойства DTL-A 62
4.3. Выделение и очистка лектинов из Serpula vermicularis 70
4.4. Свойства лектинов из Serpula vermicularis 78
4.5. Биологическая активность лектинов 84
4.5.1. Цитотоксическая активность 84
4.5.2. Анти-ВИЧ активность лектинов 87
4.6. Заключение 92
5. Выводы 95
Благодарности 96
Литература 97
- Происхождение, локализация и биосинтез лектинов
- Строение углевод-связывающих сайтов лектинов
- Гель-проникающая хроматография
- Выделение и очистка лектинов из Serpula vermicularis
Введение к работе
Углевод-опосредованное узнавание является одним из центральных событий в функционировании биологических систем. На клеточном уровне такое распознавание обычно осуществляется путем специфического углевод-белкового взаимодействия и предшествует таким важным биологическим процессам как оплодотворение, эмбриогенез, миграция лейкоцитов к месту воспаления, проникновение инфекции в клетки хозяина. Информация об узнавании заключена в углеводных структурах, которые представлены на поверхности клеток в виде гликопротеинов, гликолипидов и полисахаридов. Эту информацию воспринимают углевод-узнающие белки, иначе называемые лектинами, путем специфического связывания с углеводными структурами по типу ключ-замок. Хотя о существовании лектинов известно уже более 100 лет (Sharon and Lis, 1989b), идея, что они могут выступать как сигнал-передающие молекулы, до сих пор не утратила актуальности и, более того, интерес к лектинам продолжает расти.
К настоящему времени выделенные и охарактеризованные лектины являются эффективным инструментом в исследовании структуры гликоконъюгатов клеточной поверхности и в понимании углевод-зависимых процессов передачи сигнала. Лектины оказались полезным инструментом при исследовании патологически измененных гликоконъюгатов и при диагнозе углевод-зависимых патологий.
Морские беспозвоночные мало изучены в качестве источника лектинов по сравнению с микроорганизмами, растениями и теплокровными животными. Изучение лектинов из морских беспозвоночных впервые в мире было предпринято в начале 20 века Ногути Хидэё, который первым опубликовал сообщение об их способности агглютинировать эритроциты. В настоящее время обнаружено присутствие лектинов в различных органах и тканях (лимфе, слизи поверхности тела, гонадах и др.) в более чем 300 видов морских организмов (морские водоросли, кишечнополостные, членистоногие, иглокожие, хордовые и др.), но недостаточно известно об их углеводной специфичности, структуре и физиологических функциях (Shimizu and Kamiya, 1983).
Многие лектины из морских беспозвоночных обладают различной биологической активностью. Так лектин из морской губки Haliclona crater а токсичен по отношению к опухолевым клеткам HeLa и клеткам FemX (Pajic et а)., 2002), с другой стороны, он обладает митогенной активностью по отношению к другим клеткам. Лектин из морской губки Chondrilla nucula способен ингибировать прикрепление ВИЧ к клетке хозяина (Т-клеткам человека) (Schroder et al., 1990). GlcNAc-специфичный лектин из колониальной асцидии Didemnum ternatanum (DTL) ингибирует пролиферацию, снижает уровень включения [3Н]-тимидина, изменяет морфологию опухолевых клеток HeLa (Белогорцева и др., 1994; Odintsova et al., 2001) и проявляет себя как адгезивный и ростовый фактор по отношению к клеткам морского ежа и мидии (Одинцова и др., 1999) и др.
Настоящая работа посвящена выделению, характеристике и изучению углеводной специфичности лектинов из двух видов морских беспозвоночных морского червя Serpula vermicularis и колониальной асцидии Didemnum ternatanum. Целью данного исследования является выяснение биологической активности этих лектинов, в частности, как эффекторов процесса инвазии ВИЧ. Охарактеризованные лектины могут быть использованы как полезные инструменты для исследования заболеваний иммунной системы и нарушений процессов гликозилирования при различных патологиях.
2.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
2.1 Введение
Углевод-связывающие белки (лектины) были открыты более 100 лет тому назад (Sharon and Lis, 1989b). Однако, только в последние годы они оказались в центре внимания клеточных биологов, поскольку научные открытия последних лет показали, что углевод-белковое взаимодействие является важным механизмом передачи биологической информации на уровне клетки, то есть передачи информации при взаимодействии клеток друг с другом и межклеточным матриксом. Через углевод-зависимые взаимодействия осуществляются такие важные биологические процессы как оплодотворение, проникновение патогена в клетки хозяина, миграция лейкоцитов к месту воспаления, а также процессы малигнизации и метастазирования.
В настоящее время в различных областях биологических и медицинских исследований, в частности для решения проблем в области мембранологии и гликобиологии, широко используются и изучаются лектины.
Лектины - это общее название белков, обладающих свойством обратимо и избирательно связывать углеводы, не вызывая их химического превращения. Термин лектины (от латинского Legere-выбирать), предложенный У. Бойдом, подчеркивает избирательность их взаимодействия с углеводами. В 70-х годах его начали применять для обозначения углевод-связывающих белков растительного и животного происхождения. Позже появились сообщения, что лектины широко распространены в биологическом мире, начиная с вирусов и кончая млекопитающими (Kamiya, 1995).
Одним из главных свойств лектинов является их избирательное взаимодействие с углеводами. На сродство лектинов к углеводам обратили внимание исследователи, которые обнаружили, что моносахариды подавляют гемагглготинирующую активность лектинов. Углеводы, выступая в качестве гаптенов, блокируют сайты связывания лектинов. Изучение специфичности взаимодействия лектинов с углеводами проводилось на сходном принципе блокирования активных антител гаптеном.
Одна из первых классификаций лектинов, которая сохранилась и сейчас, основывается на том, что специфичность взаимодействия лектина с углеводом зависит от положения гидроксилов при 3-м и 4-м атомах углерода, а так же D-или L-формы пиранозного цикла углеводов.
В наше время лектины по специфичности подразделяют на четыре типа, первые два из которых наиболее широко представлены в природе: 1) С-тип лектины 2) S-тип лектины 3) Р-тип лектины 4) и другие. С-тип лектинов называется так потому, что для их связывающей активности необходимы ионы кальция. К S-типу относятся лектины способные связывать р-галактозиды, отсюда их второе название - галектины. Р-тип лектинов является специфичным для гликопротеинов, содержащих остатки маннозо-6-фосфата. Среди других групп следует отметить пентраксины, характеризующиеся пентамерной субъединичной структурой и 1-тип лектинов имеющих сходство с иммуноглобулинами.
Различные лектины способны реагировать с редко встречающимися в обычной практике углеводами и их производными, содержащими N- и О-ацетильную группу, сиаловыми и уроновыми кислотами, дигалактозидами, пентозами, фосфорилированными и сульфатированными углеводами.
Аминокислотный состав лектинов, особенно из эволюционно отдаленных организмов, существенно различается. Поэтому говорить об одном характерном типе аминокислотного состава для лектинов не представляется возможным.
В качестве кофакторов, поддерживающих их третичную и четвертичную структуру, лектины могут содержать углеводы и ионы металлов Са +, Мп +, в меньшей степени Zn +, Mg + и прочие. Удаление их из молекулы лектина приводит к потере их биологической активности. Вместе с тем, для некоторых лектинов ионы металлов не являются обязательным компонентом и не влияют на их биологическую активность (Лупик, 1981).
Количество углеводов в различных лектинах колеблется в широких пределах от 3% до 80%, но в типичных случаях составляет 3-10%. Моносахариды, образующие основные олигосахаридные цепи, представлены, как правило, Ы-ацетил-О-глюкозамином (GlcNAc) и D-маннозой (Man). Из всех известных лектинов только конканавалин Л (сопА) и лектин гороха не содержат углеводной компоненты.
Для выполнения своих биологических функций лектин либо содержит 2 и более углевод-связывающих доменов в молекуле, либо имеет способность к олигомеризации мономеров, содержащих один углевод-связывающий сайт (CRD). Это свойство позволяет лектинам перекрестно сшивать клетки (агглютинировать). Агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, - это главное свойство лектинов, которое позволяет обнаружить и охарактеризовать их (Lis and Sharon, 1998).
Четвертичная структура большинства известных лектинов построена из нескольких полипептидных цепей или субъединиц. Компоновка субъединиц в молекуле лектина весьма разнообразна. Для лектинов характерно явление множественности форм, т.е. наличие изолектинов в одном организме, необходимых для проявления мультифункциональности их действия в сложном организме. Множественные формы могут быть построены из различных видов субъединиц. Наиболее простым вариантом структуры молекулы является димер или тример, построенный из субъединиц одного типа, что характерно для растений. Более сложным вариантом структуры молекулы лектина являются олигомеры, построенные из субъединиц разного типа, характерные для высших организмов. Существенную роль в стабилизации третичной и четвертичной структуры лектинов играют дисульфидные мостики. Если же они отсутствуют, то субъединицы способны к самоассоциации за счет гидрофобных и водородных связей, в некоторых случаях за счет коллаген-подобных доменов по типу «подобное взаимодействует с подобным».
2.2. Лектины морских беспозвоночных
Начиная с 1970г} когда М.Л. Амус упомянул о существовании лектинов у беспозвоночных, эти молекулы начали широко изучать с целью установления их видового распределения, специфичности и молекулярных свойств (Gold and Balding, 1975), Поскольку лектины обычно находились в биологических жидкостях и могли агглютинировать вирусы и бактерии, их первоначально рассматривали как составную часть защитной системы (Unlenbruck et al., 1983). Впоследствии быстро развивались исследования лектинов на молекулярном уровне, изучалась таксономия лектинов с точки зрения гомологичности, их аминокислотная последовательность. С успехом продолжались исследования, касающиеся биологической функции лектинов, молекулярного развития с точки зрения расположения и структуры генов, функции лектинов в живых организмах на клеточном и молекулярном уровнях (Vasta, 1991).
На сегодняшний день обнаружено присутствие лектинов у более 300 видов морских беспозвоночных, определена их углеводная специфичность и молекулярная структура. Обычным для лектинов этих животных является специфичность по отношению к Gal, GIc, Lac, Fuc и сиаловым кислотам, а так же к гликопротеинам типа муцина (Kaoru et al., 1987; Kawagishi et al., 1994). И довольно редко встречается специфичность по отношению к GlcNAc/GalNAc одновременно как, например у лектина из Halichondria okadai HOL-[ (Kawagishi et al., 1994), или у лектина, выделенного из краба Tahypleus tridentatus (Beisel et al., 1999). Такая специфичность лектинов, а также высокое число связывающих сайтов на одной полипептидной цепочке позволяет узнавать углеводную поверхность патогенов с высокой плотностью лигандов (Beisel et aL, 1999).
Происхождение, локализация и биосинтез лектинов
Начиная с 1970г} когда М.Л. Амус упомянул о существовании лектинов у беспозвоночных, эти молекулы начали широко изучать с целью установления их видового распределения, специфичности и молекулярных свойств (Gold and Balding, 1975), Поскольку лектины обычно находились в биологических жидкостях и могли агглютинировать вирусы и бактерии, их первоначально рассматривали как составную часть защитной системы (Unlenbruck et al., 1983). Впоследствии быстро развивались исследования лектинов на молекулярном уровне, изучалась таксономия лектинов с точки зрения гомологичности, их аминокислотная последовательность. С успехом продолжались исследования, касающиеся биологической функции лектинов, молекулярного развития с точки зрения расположения и структуры генов, функции лектинов в живых организмах на клеточном и молекулярном уровнях (Vasta, 1991).
На сегодняшний день обнаружено присутствие лектинов у более 300 видов морских беспозвоночных, определена их углеводная специфичность и молекулярная структура. Обычным для лектинов этих животных является специфичность по отношению к Gal, GIc, Lac, Fuc и сиаловым кислотам, а так же к гликопротеинам типа муцина (Kaoru et al., 1987; Kawagishi et al., 1994). И довольно редко встречается специфичность по отношению к GlcNAc/GalNAc одновременно как, например у лектина из Halichondria okadai HOL-[ (Kawagishi et al., 1994), или у лектина, выделенного из краба Tahypleus tridentatus (Beisel et al., 1999). Такая специфичность лектинов, а также высокое число связывающих сайтов на одной полипептидной цепочке позволяет узнавать углеводную поверхность патогенов с высокой плотностью лигандов (Beisel et aL, 1999).
Лектины обнаружены в различных тканях морских беспозвоночных. Так, из мантии мидии Crenomytilus grayanus выделен CGL (Belogortseva et al., 1998a), из колониальной асцидии Didemnum ternatanum - DTL (Белогорцева и др., 1994). Целомическая жидкость Cucumaria echinata является богатым источником лектинов. Из нее были выделены, охарактеризованы и изучены лектины CEL-I, CEL-II, CEL-III и CEL-IV (Hatakeyama et al., 1994). Из моллюска Megabalanus rosa очищены три гуморальных лектина: BRA-1, BRA-2 и BRA-3 с молекулярной массой 330, 140 и 64 kDa, соответственно (Muramoto and Kamiya, 1990а, 1990b). Лектины Megabalanus rosa обнаруживаются во всех тканях: в лимфе, мантии, семенниках, мышцах и т.д., но до 70% лектинов присутствует в лимфе. Согласно предположению авторов лектины секретируются органами, заполняют лимфу и распространяются но всем тканям, однако сами секретирующие органы неизвестны. Секретируемые в гемолимфу лектины могут отличаться по специфичности и другим характеристикам от лектинов, накапливающихся в запасающих органах. Установлена сезонная зависимость концентрации лектинов в лимфе: летом содержание лектинов увеличивается, а зимой уменьшается. Основным компонентом во все сезоны является BRA-2, и в меньшей степени BRA-3 (Muramoto et al., 1991). Изменение содержания лектинов согласуется с количеством появляющейся mRNA и контролируется этой ступенью (Takamatsu et al., 1993). Лектины из запасающих органов представляют практический интерес, потому их что выделение и очистку можно производить в достаточных количествах.
Таблица 1 характеризует содержание лектинов в цел оми ческой жидкости некоторых видов морских беспозвоночных. Обычно в органах морского беспозвоночного содержится один или несколько лектинов в небольшом количестве, но большое количество лектинов присутствует в лимфе. Гуморальные лектины Megabalanus rosa являются секретируемыми белками. Белки проходят через липидный бислой клеточной мембраны, и для их секреции необходимо определенное расположение гидрофобных участков на их молекуле (Takamatsu et al., 1993). Подобные лектинам вещества обнаружены в секретах и жидкостях, выделяемыми морскими беспозвоночными при механических повреждениях и тепловом шоке.
Лектины являются основным компонентом лимфы некоторых беспозвоночных и составляют до 20-30% ее белков, а у отдельных особей более 60% (Muramoto et al.s 1994). Такое высокое содержание и множественность лектинов, а также сезонные изменения в их количестве трудно объяснить только их ролью в биозащите организма. Естественно, что лектины причастны не только к биозащите, они имеют отношение также и к таким основным биологическим процессам, как половое созревание и рост. Показана связь лектинов с ионным обменом: биоминерализацией и известкованием. Так, при введении в мантию моллюска крупного инородного тела происходит образование известкового слоя вокруг него с участием лектинов, в результате чего поражение сводится до минимума.
Строение углевод-связывающих сайтов лектинов
Сайты связывания лектинов организованы как полости на поверхности белковой глобулы. Обычно, только часть моносахаридного остатка углеводного лиганда участвует в образовании высокоаффинного комплекса с лектином. Формирование такого комплекса вызывает изменение конформации белка, в свою очередь. Обычно, внутри одного семейства лектинов места связывания высококонсервативны и похожи, и сильно отличаются для различных семейств лектинов, даже если углеводная специфичность их совпадает. Это подтверждает тот факт, что природа способна находить различные решения проблемы дизайна углевод-связывающего сайта в лектинах для структурно похожих углеводных лигандов (Lis and Sharon, 1998). .Лектины связываются с углеводами водородными и гидрофобными связями, в то время как, ионы двухвалентных металлов играют координационную роль (Rini, 1995; Weis and Drickamer, 1996; Lis and Sharon, 1998). Водородные связи образуются между гидроксильными группами и амидными группами углеводов, с одной стороны, и с гидроксильными, карбонильными и аминогруппами протеинов, с другой. Каждая из двух близлежащих гидроксильных групп моносахаридов взаимодействует с разными атомами кислорода остатков аминокислот в полипептидной цепи лектина (по два атома кислорода от карбоксильных групп глутаминовой или аспарагиновой кислот) (Quiocho, 1993), Для комплекса белков с углеводами характерна множественность водородных связей, которая лежит в основе высокой специфичности взаимодействия лектина и его лиганда. Гидроксильные группы одновременно являются донором и акцептором слабых сил Ван дер Ваальса (между парой атомов она составляет лишь долю 1 ккал/моль). Совокупность многочисленных водородных связей и сил Ван дер Ваальса в добавление к ионным и гидрофобным взаимодействиям составляет основу стабильности комплекса белка с углеводами.
Сахара являются полярными молекулами. Стереохимическая ориентация гидроксильных групп для каждого моносахарида составляет уникальную гидрофильную поверхность. С другой стороны метиленовые группы Сахаров способны взаимодействовать с гидрофобными областями молекул белка, обычно с остатками ароматических аминокислот -фенилаламином, тирозином или триптофаном. В дополнение к этому ацетамидная группа в N-ацетил-гексозаминах вносит дополнительный вклад в гидрофобные контакты сложного углеводного ли ганда с белком.
Контакты между рецепторами и их лигандами иногда определяются мостиками, образованными молекулами воды. Вода действует как молекулярный "цемент", её небольшой размер и способность быть донором и акцептором водорода определяют её идеальные свойства для этого. Тесно связанные мостики воды на поверхности белковой глобулы представляют собой особый тип "структурированной" воды. Сравнительные исследования серии Сахаров, связанных с лектином, или семейства родственных лектинов, связанных с определенным сахаром, выявили характеристичные молекулы воды, которые являются важными элементами в лиганд-рецепторном узнавании (Loris etal., 1994; Lemieux, 1996).
Исследования реакции ингибирования гемагглютинации или реакции преципитации просты и экономичны- Первый метод полуколичественный и не позволяет рассчитать термодинамические параметры связывания лектина с его лигандом. Большинство работ по количественному описанию ингибирования взаимодействия лектинов со специфическими углеводными лигандами проводиться с помощью физико-химических методов, например, равновесного диализа, спектрофотометрических, и флуори метрических методов, ЯМР-спектрометрии и микрокалориметрии (Shaanan etal., 1991; Wiseman et ai., 1989; Toone, 1994; Schwarz et al., 1996), полученные данные позволяют рассчитать константы аффинности лектинов с лигандами и термодинамические параметры связывания, такие как, изменение свободной энергии (AG), энтальпии (АН) и энтропии (AS).
Изучение особенностей взаимодействия лектинов с мультивалентными лигандами лежит в основе описания функции лектинов в живых системах. Природные гликонъюгаты, как секретируемые, так и мембран-связанные, являются мультивалентными и полидисперсными, количественные характеристики которых трудно получить. Использование неогликоньюгатов с точными характеристиками эпитопнои плотности остатков Сахаров на молекуле позволяют исследовать тонкие механизмы взаимодействия лектинов с мультивалентными лигандами. Так, исследование взаимодействия CGL с неогликоньюгатами, содержащими различную эпитопную плотность остатков P-Gal на полиакриламидной матрице (Gal-ПАА), позволило получить количественные параметры аффинности. Константы связывания CGL с такими мультивалентными лигандами возрастают от 139 мМ"1 до 600 мМ"1 при возрастании плотности остатков Gal от 10 моль % до 40 моль %. Одновременно, с увеличением аффинности возрастает и кооперативный эффект взаимодействия лектина с такими лигандами (Kobelev et al., 2001).
Другой удобной моделью углеводных мультивалентных лигандов, имитирующих гликокаликс клетки, являются гликолипосомы, т.е. липосомы с различной латеральной плотностью гликолиганда на поверхности бислоя. Используя неогликолипид - 4-(холистерилсукциноиламино)-фенил-р-0-галактопиранозид были получены липосомы с различной плотностью гликолиганда в мембране. Исследование взаимодействия CGL с такими гликолипосомами позволило рассчитать константы связывания. При повышении эпитопной плотности остатков галактозы от 2,5 моль % до 14,3 моль % константы возрастают с 3,5 нМ"1 до 7,2 нМ 1, что на порядок выше, чем для Gal-ПАА. Возможно, это связано с большей подвижностью остатков галактозы на поверхности гликолипосом по сравнению с жесткой полиакриламидной матрицей, и, в этом случае, более благоприятной ситуацией для высокоаффинного мультивалентного взаимодействия лектина с углеводными лигандами на поверхности лилидного бислоя. Как и в случае с Gal-ПАА кооперативный эффект при взаимодействии CGL с такими гликолипосомами возрастал до концентрации 14 моль %, при более высоких плотностях возникал эффект отрицательной ко оперативности, что, вероятно, связано со стерическими затруднениями поливалентного взаимодействия.
Аффинность взаимодействия лектинов с углеводными лигандами возрастает с понижением температуры согласно законам термодинамики. Используя разностные УФ-спектры комплекса лектина из колониальной асцидии (DTL) с Ы-ацетил-О-глюкозамином и свободного лектина при различных концентрациях моносахарида и температурах были рассчитаны константы связывания. Как видно из таблицы 4 константа связывания DTL при 10С в 4 раза выше, чем при 35С. Зависимость величины константы связывания лектинов от температуры позволило рассчитать из графика ван Ноффа термодинамические параметры взаимодействия DTL с М-ацетил-О-глюкозамином (-ДН=12,8 ккал/мол, Belogortseva et al., 1998b), что подтверждает умеренную аффинность DTL к свободному специфическому моносахариду.
Гель-проникающая хроматография
Для определения молекулярной массы нативных лектинов использовали метод гель-проникающей хроматографии на различных сорбентах, марки которых указаны в каждом конкретном случае в подписях под рисунками. Эксперименты повторяли с использованием системы для быстрого разделения белков AKTA-FPLC с использованием колонок Superdex 75 HR и Superose 6 HR. На колонку наносил 100 мкл раствора лектинов (1 мг/мл) в 0,01 М PBS. Отмечали объем выхода лектина в мл. В качестве маркеров молекулярной массы использовали Ferritin (440 kDa), Catalase (240 kDa), Aldolase (160 kDa) BSA (67 kDa) и Cytochrom С (12.3 kDa) (Serva, Германия). Молекулярную массу определяли графическим методом с использованием зависимости log м.м. от величины (Ve-Vo)/Vo, где Ve- объем элюции белков, Vo- объем элюции декстрана голубого, и расчета коэффициентов линейной регрессии (Excel, MS, США).
После SDS-электрофореза лектины переносили на нитроцеллюлозную мембрану и течение 1 часа при 400 мА. Электрофорез проводили на приборе марки Hoefer ТЕ в буферном растворе, содержащем 25 мМ триса, 192 мМ глицина, 20% метанола. Мембрану промывали буфером А 4 раза. Затем промывали водой и помещали в раствор гепарин-ПХ (1: 200). Инкубировали мембрану в течение 30 мин при 37дС. Опять промывали буфером А 4 раза и затем буфером Б, помещали в раствор субстрата, инкубировали при комнатой температуре до развития окраски. Затем вынимали, промывали буфером, водой и высушивали (Punkhurst et al., 1998). Буфер А: 0,05 М Трис-HCl с 0,15 М NaCl и 2%(v/v) Твин 20, рН 10,3 Буфер Б: 0,1 М Трис-HCl, рН 7,6 Субстрат: 5 мг 3,3-диаминобензидина, 10 мкл 0,1 М СоСЬ, 10 мкл 30% Н202 в 10 мл ОД МТрис-HCl, рН 7,6 Получали периодатным окислением ПХ и восстановительным аминированием в присутствии лектина по методу Наканэ (Nakane and Lavaoi, 1974). 2 мг пероксидазы хрена растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды и добавляли 0,1 мл 0,1 М NaJ04. Выдерживали 30 минут в темноте при комнатной температуре и диализовали в течение ночи против 1 л 0,001 М ацетатного буфера (рН 4,4). 4 мг лектина растворяли в 0,5 мл 0,1 М карбонатного буфера (0,1 М NaHC03, 0,15 М NaCl, рН 9,5), добавляли 0,1 М GalNAc для защиты углевод-связывающих участков и смешивали с окисленной пероксидазой. Смесь инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Затем добавляли 0,05 мл свежеприготовленного раствора NaBH,) (4 мг/мл) и инкубировали еще 2 часа при комнатной температуре. Смесь диализовали в течение ночи против 1 л PBS. К диализованному раствору добавляли равный объем глицерина и раствор конъюгата хранили при -18С.
На 96-луночный планшет (Dynatech, Швеция) адсорбировали гликопротеины по 0,1 мл в 0,1 М карбонатном буфере (рН 9,5) в концентрации 50 мкг/мл. Инкубировали в течение ночи при 4 С, после чего планшет промывали 3 раза 0,01 М PBS, содержащим 0,05% твин-20 (отмывочный буфер). Для забивки свободных мест a на планшете во все лунки добавляли по 0,25 мл BSA в PBS в концентрации 3 мг/мл, инкубировали два часа при 37С с перемешиванием. Избыток альбумина отмывали отмывочным буфером как описано ранее. На планшете двойными разведениями раститровывали конъюгат (лектин-ПХ) в отмывочном буфере от концентрации 1:100 до 1:6400. Инкубировали 1 час при 37С. Отмывали планшет, как описано выше. Для определения ферментативной активности пероксидазы в каждую лунку добавляли по 0,1 мл субстрата: 4,8 мг о-фенилендиамин и 5 мкл 37% Н2О2 в 12 мл 0,1 М фосфат-цитратном буфере (рН 5,0). Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре 5 минут и реакцию останавливали добавлением 0,05 мл 5% серной кислотой в каждую лунку. Оптическое поглощение измеряли на планшентных спектрофотометрах Multiskan Plus (Labsystems Оу, Финляндия) и pQuant (Biotek, США) при 492 им.
В каждую лунку 96-луночный планшет вносили по 0,1 мл раствора специфического гликопротеина (50 мкг/мл 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,5) и инкубировали ночь при 4С. После инкубации планшет трижды промывали отмывочным буфером, блокировали свободные участки связывания на планшете, добавляя по 0,25 мл BSA в PBS в концентрации 3 мг/мл. Планшет инкубировали два часа при 37С при перемешивании, промывали отмывочным буфером трижды. Раститровывали ингибиторы (по 0,05 мл в лунке) двойными разведениями в 0,01 М PBS (рН 7,5 для BSM, рН 5,5 для гепарина) от концентрации 5 мг/мл для моносахаридов и 3 мг/мл для гликопротеинов и ниже. Одновременно в каждую лунку добавляли по 0,05 мл конъюгата (лектин-ПХ) в рабочем разведении в отмывочном буфере (рН 7,5 для BSM и рН 5,5 для гепарина). Инкубировали при 37С в течение часа при перемешивании, промывали отмывочным буфером. Ферментативную активность определяли, как описано выше,
Выделение и очистка лектинов из Serpula vermicularis
Изучение углеводной специфичности лектина проводили методом ингибирования прямой гем агглютинации эритроцитов человека с использованием различных моносахаридов и их производных, олигосахаридов, гликопротеинов, гликозаминогликанов и сульфатированных полисахаридов (табл. 8). Как видно из таблицы, среди изученных простых моносахаридов ингибирующей активностью обладают лишь GIcNAc и GalNAc. На основании этого DTL-A был нами определен как GIcNAc/GalNAc-специфичный лектин. Напротив, N-дезацетилированные глюкозамин и галактозамин не проявляли ингибирующей активности даже при высоких концентрациях. Возможно, что отсутствие ацетамидной группы или положительный в физиологических условиях заряд при С-2 в этом случае препятствует связыванию с лектином. Отсутствие ингибирующей активности у других моносахаридов, таких как глюкоза, галактоза, манноза, арабиноза, ксилоза, глюкуроновая и галактуроновая подтверждает необходимость N-ацетильных групп в молекуле моносахаридов для взаимодействия с лектином. ManNAc (эпимер GIcNAc по С-2 углеродному атому, в котором ацетамидная группа находится в аксиальном положении,) также не обладают ингибирующей способностью, что указывает на вовлечение экваториальной ацетамидной группы N-ацетил-глюкозамина при взаимодействии лектина со специфическим моносахаридом. Вероятно, ориентация ацетамидной группы важна для высокоаффинного взаимодействия углеводного лиганда с лектином. З-О-Ме-GlcNAc и 4-O-Me-GlcNAc, а также олигосахариды Galp(l-»-3)GalNAc, Galp(l- 4)GalNAc, Gal30—4)GlcNAc не проявляли ингибирующей активности. Вероятно, заместители гидроксильных групп при С-3 и при С-4 стерически препятствуют образованию специфического комплекса с лектином.
Как видно из таблицы 8, введение неполярного пара-нитрофенильного агликона в N-ацетил-гексозамины усиливает их ингибирующую способность. Вероятно, гидрофобные свойства агликона и (или) наличие диполя нитрогруппы в нем важны для связывания, образуя дополнительные контакты с субсайтами связывания лектина. Гемагглютинация DTL-A также ингибироваласьнекоторыми пшкопротеинами, такими как муцин, фетуин и их десиалированными производными. Среди них асиало-BSM является наилучшим ингибитором. Отсутствие ингибирующей активности у овальбумина и овомукоида объясняется тем, что терминальные остатки М-ацетил-О-гексозаминов в их углеводных цепях имеют (р-аномерную конфигурацию (Yamashita et al., 1978; Yamashita et al., 1982; Parente et aL, 1982) (рис. 9). Данные, приведенные в таблице, предполагают, что DTL-A предпочтительно связывает производные N-ацетил-гексозаминов, содержащих а-, а но не р- гликозидные связи.
Нативный и десиалированный альфа-1-кислый гликопротеин (AAG) также не были активны. Анализ ингибирования РПГА гликопротеин ами показал, что потенциальными ингибиторами являются гликопротеины с 0-связанными гликанами, такие как BSM, гликопротеины со смешанным типом цепей (фетуин) были менее активны, а альфа-1-кислый-гликопротеин, имеющий только N-цепи, был не эффективен.
Гликозаминогликаны и сульфатированные полисахариды (гепарин, декстран-сульфат, хондроитин-4-сульфат, каппа-каррагинан) были эффективными ингибиторами гемагглюти нации. Среди них гепарин проявлял наивысшие ингибирующие свойства. Высокоаффинное взаимодействие DTL-A с гепарином использовали для проведения твердофазного анализа на нитроцеллюлозной мембране (Вестерн-блоттинг). После электрофоретического разделения, DTL-A переносили на иитроцеллюлозную мембрану. После инкубации в растворе конъюгата гепарина с пероксидазой из хрена (гепарин-ПХ, 1:200) и добавления субстрата только одна белковая полоса 14 kDa обнаруживалась в этом эксперименте (рис. 7). Это говорит, что в иммобилизованном на нитроцеллюлозе состоянии лектин способен взаимодействовать с гепарином п субъединичном состоянии. Исследование специфичности взаимодействия DTL-A с гепарином проводили также методом лектин-ферментного твердофазного анализа (ELLA) с использованием конъюгата DTLA с пероксидазой из хрена (DTL-A-ПХ) и гепарина, адсорбированного на планшете. Были подобраны оптимальные условия для взаимодействия лектина с иммобилизованным гепарином и исследовано влияние специфичных для лектина моносахаридов GIcNAc и GalNAc на его связывание с гликозаминогликаном. Специфические для CRD моносахариды GIcNAc и GalNAc не ингибировают связывании DTL-A с гепарином, в то время как сам гепарин отменял связывание на 50 % в концентрации 4 мкг/мл. Из этого эксперимента следует, что гепарин-связывающий сайт и CRD на молекуле DTL-A независимы, что согласуется с литературными данными о других гепарин-связывающих лектинах (Kochibe and Matta, 1989; Uelda et al., 1999).