Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор .11
1.1 Гипометаболические состояния млекопитающих 11
1.1.1 Естественный гипобиоз млекопитающих .11
1.1.2 Искусственный гипобиоз млекопитающих 17
1.2 Структурная и функциональная роль липидов в ядрах клеток млекопитающих .20
1.2.1 Ядра клеток млекопитающих, структура и функции .20
1.2.2 Липиды и их функции 22
1.2.3 Фосфолипиды: метаболизм, функции, локализация в ядрах клеток млекопитающих .23
1.2.4 Нейтральные липиды: метаболизм, функции, локализация в ядрах клеток млекопитающих .32
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 37
2.1 Объекты исследования 37
2.1.1 Якутские длиннохвостые суслики Spermophilus undulates 37
2.1.2 Крысы Wistar .39
2.2 Методы исследования 39
2.2.1 Охлаждение крыс методом «закрытого сосуда» .39
2.2.2 Выделение ядерных фракций печени .40
2.2.3 Биохимический контроль чистоты ядер печени
2.2.4 Выделение и очистка общей фракции липидов .42
2.2.5 Анализ липидов методом тонкослойной хроматографии .42
2.2.6 Определение нейтральных липидов
2.2.7 Определение количества белка .43
2.2.8 Статическая обработка результатов исследования .45
ГЛАВА 3. Результаты исследований и обсуждение .46
3.1 Влияние зимней спячки на липиды ткани и ядер клеток печени суслика S. undulatus .46
3.1.1 Фосфолипиды ткани печени при зимней спячке суслика S. undulatus 46
3.1.2 Фосфолипиды ядер клеток печени при зимней спячке суслика S. undulatus .48
3.2.1 Нейтральные липиды ткани печени при зимней спячке суслика S. undulatus .53
3.2.2. Нейтральные липиды ядер клеток печени при зимней спячке суслика S. undulatus .54
3.3 Влияние искусственного гипобиоза на липиды ткани и ядер клеток печени крыс Wistar 57
3.3.1 Влияние искусственного гипобиоза на липиды ткани печени крыс Wistar 57
3.3.2 Влияние искусственного гипобиоза на липиды ядер клеток печени Wistar 59
3.3 Сравнительная характеристика количественных изменений липидов ядер клеток печени млекопитающих при естественном и искусственном гипобиозе 62
Заключение .67
Выводы 68
Библиографический список 70
- Искусственный гипобиоз млекопитающих
- Охлаждение крыс методом «закрытого сосуда»
- Анализ липидов методом тонкослойной хроматографии
- Нейтральные липиды ядер клеток печени при зимней спячке суслика S. undulatus
Введение к работе
Актуальность проблемы. Температура является важным экологическим
фактором, который определяет способ адаптации живых систем к условиям
окружающей среды. Пойкилотермными называются организмы, температура
тела которых зависит от температуры окружающей среды.
животные (теплокровные) - млекопитающие и птицы -температура тела которых поддерживается в диапазоне 35 - 43C и не зависит от температуры окружающей среды. В группе существуют гетеротермные, у которых периоды постоянной температуры тела сменяются периодами значительных колебаний, зависящих от сезона года. К таким животным относятся медведи, барсуки, сурки, суслики, ежи и летучие мыши. У таких животных непостоянство температуры тела проявляется во время сна (колибри, летучие мыши) или же в период сезонной Этот способ терморегуляции является специальной формой адаптации, который обеспечивает оптимальный уровень обмена веществ в широком диапазоне температур окружающей среды [Калабухов, 1985; Lyman, 1982]. Гибернация млекопитающих, как пример естественной адаптации, позволяющая выживать в экстремальных условиях, является моделью для изучения механизмов устойчивости к действию экстремальных факторов. У животных, способных к погружению в состояние гибернации, клетки и системы устойчивы к различным повреждениям, поэтому для экспериментальной биологии и прикладной медицины методы искусственного снижения метаболизма гомойотермного организма представляет большой интерес [Delgado, Garza, 2012]. Состояние сниженной жизнедеятельности для незимоспящих млекопитающих возможно создать в условиях гипотермии с использованием гипокси–гиперкапнических газовых сред. При этом незимоспящие животные впадают в состояние так называемого «холодового наркоза», гипобиоза [Игнатьев и др., 2006].
Гибернация вызывает специфические изменения липидного состава
мембран и органелл клеток млекопитающих. В состоянии оцепенения
якутского суслика Spermophillus undulatus в ткани неокортекса уменьшалось
количество общих фосфолипидов на 20% по сравнению с летним периодом,
количество всех остальных фосфолипидов было несколько ниже, чем у
летних. В неокортексе у зимнего суслика S. undulatus также наблюдали
изменения липидов в органеллах (митохондрии и микросомы). При
исследовании липидного состава неокортекса крыс при искусственном
гипобиозе не выявили изменений. Однако в ядрах нейронов и глии
неокортекса наблюдали возрастание на 60% отношения
холестерин/фосфолипиды. В ядрах глии неокортекса количество
сфингомиелина и холестерина увеличивалось на 50% и 60%, соответственно. Сравнительное исследование метаболизма липидов при естественном и искусственном гипобиозе перспективно для выяснения механизмов адаптации
млекопитающих к низким температурам окружающей среды [Коломийцева, 2011; Garza, 2012].
Исследования по влиянию естественного и искусственного гипобиоза важно для клинической медицины и криомедицины (при лечении ишемии, мышечной атрофии и др., а также для длительного хранения клеток, органов и тканей [Тимофеев, 2005; Бабийчук, 2002].
Цель работы:
Выяснение участия липидов ядер клеток печени млекопитающих в естественном и искусственном гипобиозе.
Задачи исследования:
-
Определить количество фосфолипидов (сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, кардиолипина, фосфатидилэтаноламина и лизофосфатидилхолина) и количество нейтральных липидов (холестерина, свободных жирных кислот, моно- и диглицеридов) ткани и ядер клеток печени якутского суслика Spermophillus undulatus в летний период и при гибернации.
-
Определить количество фосфолипидов (сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, кардиолипина, фосфатидилэтаноламина и лизофосфатидилхолина) и нейтральных липидов (холестерина, свободных жирных кислот, моно- и диглицеридов) ткани и ядер клеток печени крыс линии Wistar при искусственном гипобиозе.
Научная новизна работы.
Впервые показано, что гипометаболические состояния млекопитающих
(естественный и искусственный гипобиоз) приводит к изменениям липидного
состава ядер клеток печени. Гибернация якутских сусликов S. undulatus
сопровождается изменениями липидного состава ядер клеток печени. У
зимоспящих животных в состоянии оцепенения увеличено количество общих
фосфолипидов, за счет сфингомиелина, фосфатидилсерина и кардиолипина и
снижено количество массовых фосфолипидов – фосфатидилхолина и
фосфатидилэтаноламина по сравнению с летними сусликами. Переход в
нормотермию (активные зимние суслики) сопровождается снижением
количества сфингомиелина и фосфатидилсерина, количество
фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина возвращается к уровню летних животных. Количество холестерина и жирных кислот в ядрах клеток печени спящих сусликов увеличивается в 2 раза по сравнению с летними. У активных зимних сусликов количество холестерина остается повышенным, а количество жирных кислот снижается в 2 раза по сравнению со спящими животными.
Состояние искусственного гипобиоза у крыс вызывает изменения липидов
ядер печени: увеличивается количество общих фосфолипидов за счет
сфингомиелина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола и
лизофосфатидилхолина. Таким образом, искусственный гипобиоз крыс, по
сравнению с гибернацией сусликов, отличается участием
фосфатидилинозитола и лизофосфатидилхолина в изменениях количества фосфолипидов ядер клеток печени. Количество холестерина и жирных кислот увеличивается аналогично росту этих липидов в ядрах печени гибернирующих сусликов. Таким образом, показано увеличение количества минорных фосфолипидов, холестерина и жирных кислот в ядрах печени при естественном гипобиозе сусликов S. undulatus и искусственном гипобиозе крыс Wistar.
Научная и практическая значимость работы.
Диссертационная работа имеет фундаментальное и практическое значение в биологии, адаптационной медицине, физиологии стресса и в использовании гипотермии для медицинских целей. Из анализа результатов следует, что липиды ядер клеток печени принимают участие в адаптации зимоспящих и незимоспящих млекопитающих к гипобиозу.
Результаты представляют практический интерес для использования гипотермии в медицине для лечения ряда заболеваний, для проблемы липотоксичности, при чрезвычайных ситуациях (переохлаждение), для методов консервации и хранения тканей.
Апробация работы.
Результаты исследований и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на следующих конференция: на 18 школе-конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2014 г) и на конференции «Проблемы современной физико-химической биологии» (Пущино, 2015 г).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 92 страницах машинописного текста, содержит 8 рисунков, 12 таблиц. Список цитируемой литературы включает 231 источник.
Искусственный гипобиоз млекопитающих
При гипотермии-гипоксии-гиперкапнии функционирует ряд естественных механизмов, сопутствующих у гибернантов входу в оцепенение. В частности, перед залеганием в спячку у многих видов норных зимоспящих (суслики, хомяки, сурки) в норах, с плотно закрытым зимой «земляной пробкой» входом, поддерживается повышенное содержание углекислого газа (до 10-12%) при недостатке кислорода [Baudinette R.V., 1974; Kuhnen G., 1986; Ануфриев А.И., Ахременко А.К., 1994]. Гипоксия способствует накоплению основного тормозного медиатора центральной нервной системы, ГАМК, предшественником которого является возбуждающий медиатор, глютамат: превращение глютамата в ГАМК продолжается и в анаэробных условиях, синтез же глютамата при этом резко замедляется [Siesjo B.K., 1978; Bradford H.F., 1986]. Уменьшение соотношения глютамат-ГАМК, наряду с другими факторами, способствует перестройке ЦНС для функционирования на более низком уровне. Во время стабильного состояния оцепенения, когда в условиях минимального обмена газовый состав в норе гибернантов нормализуется, внеклеточное содержание глютамата и ГАМК в мозге восстанавливается до исходного уровня [Osborne P.G. et al., 1999; Zhou F. et al., 2002], что важно для обеспечения очередного пробуждения животных.
Вход незимоспящих млекопитающих в состояние гипотермии осуществляется в две стадии. На первой стадии происходит активация сократительного термогенеза (дрожь, судороги) с выбросом гормонов надпочечников - катехоламинов (адренергическая стадия). После истощения пула катехоламинов отключается сократительный термогенез. Холодовую блокаду процессов сократительного термогенеза принято считать состоянием «холодового наркоза». Далее наступает вторая стадия - холинергическая или несократительный термогенез, обусловленный процессами нефосфорилирующего тканевого дыхания, связанного со свободным теплообразованием [Тимофеев М.Н., 1997]. Состояние искусственного гипобиоза приводит к замедлению всех физиологических процессов в организме и изменения его реактивности, что делает организм более устойчивым к разнообразным патологическим процессам: травмам, интоксикациям, кислородной недостаточности, увеличивает устойчивость млекопитающих к ионизирующему излучению и т.д. Устойчивость млекопитающих к ионизирующему излучению была отмечена у млекопитающих в состоянии естественного гипобиоза - зимней спячки и у обычных теплокровных, искусственно введенных в гипотермию [Константинова М.М., 1961; Гордейчева Н.В., 1968; Гордон Р.Я. и др., 2006; Kolomiytseva I.K. et al., 2012; Cerri M. et al., 2016].
Изучение природных адаптационных механизмов и роли липидов субклеточных структур при искусственном и естественном гипобиозе важно для решения прикладных задач, связанных, с температурной адаптацией, повышением возможности выживания человека в экстремальных условиях и для практической медицины.
Ядро как внутриклеточная структура была впервые описана в работе Франца Бауэра в 1802 году. Эта органелла является двумембранной структурой, которая содержит генетический материал, находящийся в ядерном матриксе и запакованный в виде хроматина [Dundre M., Misteli T., 2001; Prunuske A.J., Ullman K.S., 2006]. Ядро клетки является высокодинамичной и пространственно разделенной структурой. В хроматине сосредоточены основные функции ДНК - репликация ДНК и транскрипция РНК. Ядерные ламины представляют собой белковую сеть между ядерной оболочкой и хроматином, что позволяет поддерживать форму ядра. Результаты многих экспериментов показывают, что ядерные ламины могут играть важную роль в регулирование экспрессии генов, в процессах синтеза ДНК и РНК и митозе [Adam S.A. et al., 2001]. Клеточное ядро содержит подструктуры: ядрышко, отдел фактора сплайсинга, тельца Кахаля, тела онкобелка промиелоцитарного лейкоза (PML). Ядрышко представляет собой сайты синтеза и процессинга рибосомальной РНК, а также центры биогенеза для рибосомальных субъединиц. Ядерные тела или домены (тельца Кахаля), содержат множество различных белков (коилин p80, различные транскрипционные факторы и маленькие рибонуклеобелки) и вероятно играют роль в биогенезе маленьких ядерных РНК-белок комплексов и в их транспортировке. PML ядерные тела являются доменами, связаными с матриксом и предположительно регулируют репликацию ДНК, репликацию и подавление экспрессии генов [Jackson D.A., 2012].
Ядерная мембрана представляет собой высокоорганизованную и многофункциональную структуру, которая ограничивает генетический материал от окружающей ее цитоплазмы, влияет на экспрессию генов, координирует многие сигнальные пути [Tripathi V., Kannanganattu P.V., 2011]. Ядерная оболочка состоит из внутренней и внешней мембран, находящихся параллельно друг другу примерно на расстояние 50 нм. К внутренней мембране прилегает ядерная ламина. Комплекс ядерных пор обеспечивает связь ядра и цитоплазмы. Внешняя ядерная мембрана представляет собой продолжение эндоплазматического ретикулума (ЭР) [Chow Kin-Hoe et al., 2012]. Основу ядерной мембраны составляет фосфолипидный бислой, инкорпорированный интегральными белками. Внутренняя и внешняя ядерные мембраны связаны между собой ядерными порами, которые представляют сложные комплексы из примерно 30 различных белков (так называемые нуклеопорины) и образуют селективные каналы, которые обеспечивают вместе с рецепторами регулируемый транспорт макромолекул между ядром и цитоплазмой [Brown C.R., Silver P.A., 2007]. Состав ядер определяется метаболизмом нуклеиновых кислот, белков и липидов и транспортом РНК, белков и липидов через ядерные поры.
Липиды - это группа органических соединений, которые не растворимы в воде, но растворимы в органических растворителях. Они являются важным классом биологических молекул, представляющие собой сложные эфиры высших карбоновых кислот и ряда спиртов. В группу этих природных соединений входят жирные кислоты, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, стеролы и др. [Fahy E.W. et al., 2011].
Липиды выполняют структурную, энергетическую и сигнальную роль. Они являются предшественниками ряда жирорастворимых витаминов, регуляторами клеточного метаболизма и др. [Dowhan W., Bogdanov M., 2002; Green D.E., Tzagoloff A., 1966]. Липиды также выступают в роли источников вторичных мессенджеров (диглицериды, церамиды, сфингозины) [Alessenko A.V., Burlakova E.B., 2002; Spiegel S. et al., 1996]. В последние время большой внимание уделяется сигнальной роли липидов. В клеточных мембранах липиды образуют рафты или микродомены, которые представляют собой высокодинамичные структуры, содержащие специфические белки. Липидные рафты играют важную роль во многих клеточных процессах, включая передачу сигнала, эндоцитоз и сортировку белков [Mrwczyska L., 2012; Alonso M.A., Milln J., 2001; Albi E. et al., 2013].
Охлаждение крыс методом «закрытого сосуда»
В ядрах тканей крыс - в печени, тимусе, в клетках нейронов и глии неокортекса - ЖК присутствуют в количествах, превышающих количество других нейтральных липидов, в частности, холестерина, и выступают как массовый компонент нейтральных липидов ядер. Превышение количества ЖК над массой холестерина было показано также в хроматине печени [Kolomiytseva I.K. et al., 2002].
В ядрах клеток печени летних сусликов количество холестерина и МГ -несколько больше, а ЖК - несколько меньше, чем в ткани печени, мажорным компонентом остаются ЖК. ДГ в ядрах печени летних сусликов обнаружить не удалось. Нейтральные липиды ядер клеток печени испытывают значительные изменения в зависимости от функционального состояния животного в ходе гибернации. В ядрах клеток печени спящих сусликов количество всех нейтральных липидов увеличивается по сравнению с летними: ЖК и МГ - в 2,5 раза, холестерина - в 2 раза. Появляются неопределяемые у летних сусликов ДГ; мажорным компонентом остаются ЖК. У активных зимних сусликов количество холестерина не изменяется по сравнению со спящими, оставаясь повышенным по сравнению с летними; количество ЖК у активных сусликов по сравнению со спящими уменьшается наполовину, возвращаясь к уровню летних. Количество моно- и диглицеридов уменьшается наполовину по сравнению со спящими, однако остается повышенным по сравнению с летними. Следует отметить, что рост холестерина, моно- и диглицеридов в ядрах совпадает с некоторым уменьшением их концентрации в ткани печени (табл. 8).
Таким образом, гибернация якутского суслика сопровождается глубокими функциональными изменениями количества нейтральных липидов ядер клеток печени, в отличие от сезонных изменений нейтральных липидов гомогената печени. Представляет интерес вопрос о функциональной роли и источнике роста количества нейтральных липидов в ядрах печени при гибернации. Сезонное возрастание количества холестерина в 3 раза было обнаружено в митохондриальной и в 5 раз - в микросомальной фракции печени гибернирующих сусликов S. undulatus. При этом количество жирных кислот в митохондриальной фракции было в 7 раз и в микросомальной - в 2 раза выше, чем у летних, при увеличении количества моно- и диглицеридов в 2 -3 раза в обеих фракциях [Коломийцева и др., 2013]. Таким образом, рост количества нейтральных липидов в органеллах печени спящих сусликов происходит на фоне уменьшения количества холестерина, моно- и диглицеридов в ткани печени. Эти результаты можно рассматривать как свидетельство внутриклеточного перераспределения нейтральных липидов при гибернации, но только в ядрах изменения имеют функциональный характер. При анализе источников увеличения количества нейтральных липидов в органеллах печени гибернирующих сусликов заслуживает внимания то обстоятельство, что органеллы - мембранные структуры - обогащены фосфолипидами, а концентрация нейтральных липидов значительно выше в ткани печени, чем в клеточных органеллах. Гепатоциты обладают резервуарами нейтральных липидов в виде так называемых цитозольных липидных капель [Garca-Arcos I. et al., 2010]. Поверхность липидных капель образована обращенным к цитозолю листком - монослоем мембраны ЭР, с липидным составом, отличающимся от такового ЭР или его микродоменов [Tauchi-Sato K. et al., 2002]. В составе цитозольных липидных капель большую часть занимают триглицериды, холестерин и его эфиры [Garca-Arcos I. et al., 2010], однако триглицериды, за счет липаз и эстераз, могут быть источником образования жирных кислот [Papackova Z., Cahova M., 2015].
Количество липидных капель в печени возрастает при нагрузке организма жирными кислотами или диетой с холестерином [Судаков Н.П. и др., 2014]. Предположительно источником роста нейтральных липидов в органеллах печени при гибернации могут быть цитозольные липидные капли. Ядра гепатоцитов крыс также содержат липидные капли - из ядерной оболочки гепатоцитов крыс с помощью Тритона Х-100 были выделены ядерные липидные капли (NLC), содержащие 63% белков и 37% липидов, обогащенных нейтральными липидами. Липиды ядерных липидных капель составляют 0,002 % липидов ядра печени крыс. Гораздо больше липидов содержат цитозольные липидные капли гепатоцитов - 9,3% липидов печени крыс [Layerenza J.P. et al., 2013]. Цитозольные липидные капли могут взаимодействовать с митохондриями, ЭР, и пероксисомами, образуя протяженные синапсы [Goodman J.M., 2009]. Присутствие триглицеридов, при используемых количествах материала, не обнаружено нами среди липидов ядер печени гибернирующих сусликов, однако триглицериды и эфиры холестерина липидных капель могут быстро высвобождать жирные кислоты за счет активации липаз и эстераз [Papackova Z., Cahova M., 2015]. Рост количества нейтральных липидов в ядрах спящих сусликов и уменьшение при пробуждении также может быть связано с функцией ядра как секретирующей органеллы и участием липидов в формировании ядерных пор [Kuvichkin V.V. et al., 2009]. Рост количества ЖК в ядрах гепатоцитов спящих сусликов свидетельствует об их важной роли в спячке и пробуждении.
Из анализа результатов следует, что фосфолипиды и нейтральные липиды ядер клеток печени принимают участие в функциях ядерного аппарата гепатоцитов в условиях гипобиоза и переходов оцепенение/активность.
Искусственный гипобиоз не вызывал изменений количества липидов в ткани печени крыс по отношению к белку (мкг липида/мг белка) (табл. 9), однако в фосфолипидном составе обнаружились изменения: моль% ФЭА снизился на 11% (Табл. 10). Ткани печени сусликов и крыс несколько различаются по количеству липидов: у крыс выше количество ОФЛ на 28%, ФС в 2 раза и количество ЖК на 25% (табл. 1 и 10). Таблица 9. Влияние искусственного гипобиоза на количество липидов ткани печени крыс Wistar (мкг липида/мг белка).
Анализ липидов методом тонкослойной хроматографии
Количество липидов в ядрах клеток печени отличается от такового в ткани печени: в ядрах количество ОФЛ и ЖК на мг белка примерно в 3 раза, а холестерина - на 30% меньше, чем в ткани. Различия в количестве МГ и ДГ незначительны (табл. 9 и 11). Фосфолипидный состав ядер клеток печени близок к фосфолипидному составу ткани печени, отличаясь в 2 раза меньшими долями ФС и КЛ, а также наличием ЛФХ (табл. 10 и 12). Таким образом, ядра обеднены фосфолипидами и ЖК и обогащены холестерином по сравнению с тканью, так что соотношение холестерин/фосфолипиды, М/М, (ХЛ/ОФЛ, М/М), в печени в 2 раза ниже, чем в ядрах (табл. 9 и 11).
В ядрах нейронов и глии неокортекса крыс, как и в ядрах печени, третьим массовым фосфолипидом является ФИ. Однако в ткани неокортекса третьим массовым фосфолипидом служит ФС [Коломийцева И.К. и др., 2010]. Отличие фосфолипидного состава ядер нейрональных клеток от фосфолипидного состава ткани за счет ФИ в качестве третьего мажорного фосфолипида свидетельствует о его роли в функциях ядер.
Искусственный гипобиоз вызывал изменения количества липидов в ядрах печени крыс, при этом изменения липидов в ядрах также наблюдали в течение 24, 48 и 72 ч после окончания охлаждения и перевода животных в нормальную газовую среду при комнатной температуре (табл. 11). Количество ОФЛ ядер при искусственном гипобиозе, и в состоянии нормотермии через 24 ч окончания охлаждения было увеличено на 20% по сравнению с контролем, возвращаясь к норме через 48 и 72 ч.
Количество мажорных фосфолипидов ядер клеток печени - ФХ и ФЭА -ни в состоянии гипобиоза, ни в течение 72 ч после окончания охлаждения не изменялось (табл. 11). Изменения ОФЛ при искусственном гипобиозе определяли минорные фосфолипиды. Количество СМ ядер клеток печени крыс в состоянии гипобиоза увеличено в 2,5 раза по сравнению с нормой; к 24 ч возвращалось к контрольным значениям и через 48 и 72 ч снижалось до 50% от нормы. Количество ФС в состоянии гипобиоза возрастало почти в 3 раза, однако затем не отличалось от контроля. Количество КЛ не изменялось при гипобиозе и уменьшалось через 48 и 72 ч, до 50 и 20% от нормы, соответственно. Выразительна динамика ЛФХ, количество которого в состоянии гипобиоза увеличивалось в 3 раза, оставалось на этом уровне к 24 ч и затем, снижаясь до нормы к 48 ч, через 72 ч было за пределами чувствительности метода. Можно полагать, что последствия искусственного гипобиоза - охлаждения в условиях гипоксии/гиперкапнии - по критерию липидного состава ядер проявляются по времени и за пределами 72 ч после воздействия. Количество ФИ ядер клеток печени при гипобиозе было увеличено в 3 раза по сравнению с нормой, через 24 ч возвращалось к контролю, через 48 ч повышалось и снова возвращалось к норме через 72 ч после окончания охлаждения (табл. 11).
Изменения фосфолипидного состава ядер по моль% ОФЛ вообщем повторяли закономерности, выявленные для соотношений фосфолипид/белок (табл.12). Доля ФЭА ядер печени после гипобиоза не изменялась. Доля ФХ к 72 ч увеличивалась на 30% за счет снижения количества минорных фосфолипидов. Наиболее выразительны колебания моль% ФИ ядер клеток печени.
Влияние искусственного гипобиоза и времени после окончания охлаждения на фосфолипидный состав ядер клеток печени крыс Wistar (моль %). Липиды Контроль (6) Время после окончания охлаждения, часы 24(5) 48(4) 72(4) Сфингомиелин 5,3±0,8 11,3±2,7 (4) 4,4±0,5 2,3±0,3 2,6±0,2 Фосфатидилхолин 57±3,5 52,7±2,7(4) 51,5±4,9 66,4±7Д 74,5±6 Фосфатидилсерин 4,8±0,6 10,5=Ы,6 (6) 4,2±0,7 3,5±0,3 2,7±0,6 Фосфатидилинозитол 8,5±1,2 20,7±3,2 (5) 7,7±0,8 13,2±1,6 12,6±1,4 Кардиолипин 4,5±0,9 7,9±2,2(4) 3,4±1,2 2,4±0,5 0,7±0,3 Фосфатидилэтаноламин 19,4±2Д 17,7± 1,1(4) 18,2±2Д 21,9±2,7 22,9±1,5 Лизофосфатидилхолин 3,5±0,7 11±1,4 (5) 11=Ы 3,9±0Д Примечание: - различие достоверно по отношению к контрольным крысам при 0,05; (n) - количество экспериментов.
Искусственный гипобиоз вызывает изменения количества нейтральных липидов ядер клеток печени крыс. Количество ДГ в ядрах в состоянии гипобиоза возросло на 40%, возвратилось к норме через 24 ч после гипобиоза и далее не изменялось (табл. 11). Количество ДГ в ядрах можно полагать зависимым от активации ядерной фосфолипазы С и скорости выхода ДГ в цитоплазму. Количество холестерина ядер печени крыс при гипобиозе также возросло на 40 %, возвратилось к контролю через 24 ч и не менялось в течение 72 ч. Количество ЖК в ядрах клеток печени крыс в состоянии гипобиоза возрастало на 30%, и далее не отличалось от нормы. Количество МГ не изменялось (табл. 11). Таким образом, фосфолипиды и нейтральные липиды ядер клеток печени крыс принимали участие в ответе на воздействие искусственного гипобиоза. Повышение количества холестерина и СМ наблюдали и в ядрах глии неокортекса при искусственном гипобиозе крыс [Коломийцева И.К. и др., 2010]. Однако, в микросомальной мембране печени крыс под влиянием искусственного гипобиоза было показано уменьшение холестерина на 16%, а через 24 часа - увеличение на 17% [Melnychuk S. et al., 2013]. Эффекты искусственного гипобиоза на фосфолипиды и нейтральные липиды ядер печени могут быть обусловлены активацией гипофиз-адреналовой системы. Было показано, что трийодтиронин вызывал снижение количества ФИ и увеличение КЛ в печени и в ядерной фракции печени крыс [Bucki R. et al., 2000]. Введение гидрокортизона увеличивало количество общих фосфолипидов, ФХ [Gevorkian E.S. et al., 1986] и ФИ в ядерной мембране печени крыс [Gevorkian E.S. et al., 1999]. Исследование динамики липидов в ядрах печени при искусственном гипобиозе и выходе из него в сопоставлении с ролью метаболитов индивидуальных липидов и нейроэндокринных факторов представляется плодотворным для понимания роли ядерных липидов в ответе млекопитающего на внешнее воздействие.
Состояние гипобиоза специфически влияет на липидный состав ядерной фракции печени зимоспящих и незимоспящих млекопитающих. Показано, что состояние оцепенения у сусликов (по сравнению с летними животными) и гипотермия у крыс (по сравнению с контролем) вызывает увеличение количества ОФЛ, СМ, ФС, ЖК, ДГ и холестерина. Количество ОФЛ повышалось на 40% у сусликов и на 20% у крыс (рис. 6), количество СМ и ФС увеличивалось в 7-8 раз у сусликов и в 2,5-3 раза у крыс (рис. 7), количество КЛ увеличивалось на 80% у спящих сусликов по сравнению с летними, но не изменялось у крыс (рис. 6). Таким образом, количество ОФЛ, СМ и ФС в ядрах клеток печени при искусственном и естественном гипобиозе изменяются однонаправленно, с большей выраженностью у сусликов. В то же время изменения некоторых фосфолипидов отличались по направленности у сусликов и крыс. В состоянии оцепенения у сусликов уменьшалось количество ФХ (на 25%) и ФЭА (на 40%); у крыс в состоянии гипобиоза количество ФХ и ФЭА не менялось. У крыс в состоянии гипобиоза количество ФИ и ЛФХ увеличивалось на 70% по сравнению с контролем, в то время как у гибернирующих сусликов количество ФИ и ЛФХ не изменялись (рис. 6). Для наглядного представления результатов даны рисунки, где эффекты гипобиоза выражены в процентах от контроля.
Нейтральные липиды ядер клеток печени при зимней спячке суслика S. undulatus
Таким образом, состояние оцепенения сопровождалось увеличением количества СМ, ФС, КЛ и снижением ФХ и ФЭА при отсутствии изменений в количестве ФИ и ЛФХ. У активных зимних сусликов количество ОФЛ оставалось повышенным по сравнению с летними животными. Количество СМ, ФС и КЛ снижалось, составляя 30-50% от их содержания у спящих, но превышая уровень летних. Количество ФХ и ФЭА у активных зимних возвращалось к уровню летних животных. Содержание ФИ и ЛФХ в ядрах в ходе гибернации не менялось (табл. 5). Таким образом, переход к нормотермии (активные зимние суслики) осуществлялась на фоне уменьшения количества СМ и ФС и возвращения к летнему уровню ФХ, ФЭА и КЛ.
Важным функциональным критерием изменения фосфолипидного состава ядер клеток печени при гибернации является отношение количества индивидуального фосфолипида к общему количеству фосфолипидов. Таблица 6. Влияние гибернации на фосфолипидный состав ядер клеток печени якутского суслика S. undulatus (моль%).
Примечание: - различие достоверно по сравнению с летними сусликами при p 0,05; # - различие достоверно по сравнению с зимними активными сусликами при p 0,05; (n) - количество экспериментов. Как видно из табл. 6, у летних сусликов в ядрах клеток печени ФХ и ФЭА являются “мажорными” фосфолипидами, а третьим по величине - ФИ. Подобные соотношения наблюдались и при исследовании печёночной ткани и органелл клеток печени и тимуса крыс [Kolomiytseva I.K. et al., 2002]. У спящих сусликов в ядрах клеток печени “мажорными” фосфолипидами были СМ и ФХ, на третьем месте находился ФС, ФЭА выступал как минорный компонент наряду с ФИ. У активных зимних сусликов в качестве третьего по содержанию фосфолипида определялся ФС, а доля ФИ оказалась значительно меньшей. Сниженным был и уровень ФХ. Таким образом, у суслика S. undulatus в ходе гибернации фосфолипидный состав изменялся в зависимости от сезона (летние–гибернирующие) и в цикле оцепенение/активность. Наибольшие функциональные изменения (сравнение “спящие–активные”) в содержании фосфолипидов в ядрах клеток печени были характерны для СМ, ФС и ФЭА (табл. 5). Ранее были зарегистрированы сезонные изменения количества ОФЛ в микросомальной и митохондриальной фракциях клеток печени гибернирующих сусликов S.undulatus: рост в митохондриях на 60% и падение на 20% в микросомах [Коломийцева И.К. и др., 2013]. В цикле оцепенение/активность было найдено небольшое увеличение количества ФС в митохондриях спящих сусликов по сравнению с активными зимними. Таким образом, фосфолипидный состав ядер клеток печени претерпевал сезонные и функциональные изменения в связи с гипобиозом и переходом гипотермия/нормотермия. Как известно, наружная ядерная мембрана является продолжением мембраны ЭР [Baker R.R., Chang H., 1981], однако гибернация вызывала уменьшение количества ОФЛ (без изменений фосфосфолипидного состава) в микросомальной фракции печени сусликов [Перепелкина Н.И., Коломийцева И.К., 2016]. Функциональные изменения ядер печени при гибернации млекопитающих выражаются и в угнетении синтеза белков и дифференциальной экспрессии некоторых генов [Yan J. et al., 2008]. Изменения количества фосфолипидов и фосфолипидного состава в ядрах клеток печени при гибернации могут быть связанны со специфическими изменениями функций ядер. В настоящее время изучают роль липидзависимых транскрипционных факторов - ядерных рецепторов - в изменениях количества фосфолипидов в микродоменах ядерной мембраны при разных воздействиях на клетки [Damaskopoulou E. et al., 2013]. Однако фосфолипиды микродоменов составляют примерно 0.29% от фосфолипидов ядер, и, например, изменение темпа пролиферации гепатоцитов после гепатоэктомии, влияя на количество СМ и ФХ в микродомене, не сопровождается изменением количества липидов ядра [Cascianelli G. et al., 2008].
Роль изменения количества минорных фосфолипидов в ядрах клеток печени у спящих сусликов может быть связана с экспрессией генов, обуславливающих метаболическую перестройку, необходимую для нормального протекания зимней спячки [Yan J. et al., 2008; Yichi Xu et al., 2013]. В пользу этого свидетельствуют данные, полученные в модельных экспериментах на изолированных ядрах печени крыс при обработке их липосомами, содержащими определенные фосфолипиды. Показано, что при инкубации изолированных ядер с липосомами, содержащими КЛ или ФС, увеличивалась активность ДНК-зависимой РНК-полимеразы, что регистрировалось по включению радиоактивномеченого уридинмонофосфата в РНК [Maraldi N.M. et al., 1984]. Это, по-видимому, связано с удалением гистона Н1 из межнуклеосомного пространства [Capitani S. et al., 1984] и уменьшением степени его конденсированности и как следствие доступности для РНК-полимеразы. Кроме того, показано увеличение низкомолекулярных фрагментов хроматина в кислоторастворимой фракции после обработки ядер печени липосомами с ФС и последующей обработке ядер ДНКазой, что также свидетельствует об увеличении доступности ДНК для ферментов [Cocco L. et al., 1984].
Мажорным компонентом нейтральных липидов печени являются ЖК. Количество ЖК в гомогенате печени при гибернации увеличено почти в 3 раза по сравнению с летними. Количество холестерина уменьшено на 15% в гомогенате печени спящих сусликов по сравнению с летними. Количество моноглицеридов и диглицеридов печени уменьшено при гибернации (табл. 7).
Примечание: - различие достоверно по сравнению с летними сусликами при p 0,05; # - различие достоверно по сравнению с зимними активными сусликами при p 0,05; (n) - количество экспериментов. Таким образом, количество нейтральных липидов гомогената при гибернации претерпевает, в основном, сезонные изменения, состоящие в увеличении количества ЖК и в некотором уменьшении глицеридов (табл. 7). ЖК являются основным энергетическим субстратом в период зимней спячки. При перегрузке клеток ЖК развиваются процессы деструкции мембран, активация воспалительных маркеров и апоптоз клеток [Brookheart R.T. et al., 2009]. В то же время зимоспящие млекопитающие обладают способностью длительно существовать при 2-3-кратном увеличение количества ЖК в крови и возвращаться к нормотермии без вреда для клеток сосудов и других тканей [Arinell K., 2012]. Увеличенное количество ЖК в плазме гибернантов уменьшалось, начиная с февраля месяца и далее возвращалось к уровню летних [Yeh I., 1995].