ЛИПИД-ЗАВИСИМЫЙ ТОПОГЕНЕЗ ТРАНСПОРТЕРА ЛАКТОЗЫ ESCHERICHIA COLI Рябичко Сергей Сергеевич

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 11

Глава 1.1 Внутриклеточная локализация интегральных мембранных белков 11

Глава 1.2 Топология мембранных белков 16

Глава 1.3 Топогенные сигналы и правила топологии 20

Глава 1.4 Правило положительных зарядов внутри 22

Глава 1.5 Роль липидов в топогенезе 25

Глава 1.6 Липид-зависимое формирование третичной структуры мембранных белков 28

Глава 1.7 Участие липидов в определении топологии мембранных белков 32

Глава 1.8 Изменение ориентации трансмембранных доменов после сборки 34

Глава 1.9 Свойства липидов, влияющих на топологию и функцию мембранных белков 39

Глава 1.10 Гипотеза баланса зарядов 41

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 46

Глава 2.1 Оборудование и реагенты 46

Объекты исследования 48

Глава 2.2 Использованные микроорганизмы и плазмиды 48

Методы, использованные в работе 50

Глава 2.3 Культивирование микроорганизмов 50

Глава 2.4 Мечение фосфолипидов и экстракция 51

Глава 2.5 Одномерная тонкослойная хроматография фосфолипидов 51

Глава 2.6 Двумерная тонкослойная хроматография фосфолипидов 52

Глава 2.7 Выделение и солюбилизация внутренних и внешних мембран E.coli 52

Глава 2.8 Выделение и солюбилизация внутренних мембран E.coli в инвертированной ориентации 52

Глава 2.9 Определение КДО в мембранах 53

Глава 2.10 Денатурирующий электрофорез мембранных белков в ПААГ и Вестерн-блоттинг 54

Глава 2.11 Истерн-Вестерн блоттинг 55

Глава 2.12 Определение топологии мембранных белков методом анализа доступности замещенных цистеинов 55

Глава 2.13 Определение скорости транспорта субстрата транспортера лактозы через внутреннюю мембрану 57

Глава 2.14 Трансформация клеток E.coli плазмидами 58

Глава 2.15 Статистическая обработка данных и вычисления 58

ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 59

Глава 3.1 Влияние лизофосфатидной кислоты на формирование третичной структуры и встраивание в мембрану транспортера лактозы 59

Глава 3.2 Влияние лизилфосфатидилглицерина на топологию транспортера лактозы 68

Глава 3.3 Внутримолекулярное взаимодействие транспортера лактозы LacY при встраивании в мембрану 72

Глава 3.4 Распределение фосфолипидов в бислое мембраны Escherichia coli 77

Глава 3.5 Анализ распределения заряженных аминокислот гомологов транспортера лактозы бактерий

с различным липидным составом мембраны 80

Заключение 89

Список использованных источников

• Топология мембранных белков
• Культивирование микроорганизмов
• Определение топологии мембранных белков методом анализа доступности замещенных цистеинов
• Внутримолекулярное взаимодействие транспортера лактозы LacY при встраивании в мембрану

Введение к работе

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

Биогенез белков в сопряжении с топографией данных процессов образует понятие топогенеза. Проблема топогенеза мембранных белков имеет ряд открытых вопросов, таких как механизмы маршрутизации мембранных белков к месту их субклеточной локализации, а также приобретение определенной третичной структуры и топологии - ориентации доменов относительно плоскости мембраны. Принято считать, что первичная маршрутизация мембранных белков определяется сигнальными аминокислотными последовательностями, входящими в состав самих белков, однако липиды, являясь растворителем для гидрофобных сегментов мембранных белков, оказывают воздействие на различные аспекты их биогенеза, включая транспорт и локализацию. Следует отметить, что принцип маршрутизации мембранных белков бактерий отличается от сортинга мембранных белков эукариот, так как у бактерий отсутствуют соответствующие органеллы и структуры. Было выдвинуто несколько гипотез механизма внутриклеточной миграции мембранных белков в бактериях. Кроме классической гипотезы дрейфующих рафтов в мембране, одним из возможных путей может являться внутриклеточная маршрутизация с помощью новосинтезированной мембраны и мезосом — инвагинаций мембраны (Aboulwafa et al., 2013; Saier, 2016).

Другой возможный путь передвижения гидрофобных мембранных белков в клетке – либо с помощью бислойных везикул, при этом белок может встраиваться с участием транслоконовой системы уже после формирования везикул, или быть встроенным при образовании везикулы из мембраны; либо с помощью однослойных мицелл, состоящих из фосфолипидов с одной жирной кислотой, которые, вероятно, оказывают возмущающее/дестабилизирующее действие на бислойную структуру мембраны и, как следствие, высвобождение мицелл с мембранным белком внутри (Bogdanov et al., 2013; Luckey, 2014; Reading et al., 2015).

Формирование мицелл напрямую связано с липидным составом мембраны, который в свою очередь может зависеть от изменений условий окружающей среды. Количество насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, а также распределение и количество зарядов в мембране формирует степень ее текучести, что может быть критично при стрессовых условиях, таких как температурное нагревание (Zhang and Rock, 2008). Показано, что лизофосфатидная кислота присутствует в составе мембраны E.coli в количестве 0,1-0,5% от общего содержания глицерофосфолипидов (Kooijman et al., 2005). При этом малое содержание лизофосфатидной кислоты способно оказывать важное воздействие на бислойную структуру мембраны, внося дестабилизирующее действие за счет наличия одной жирной кислоты вместо двух. Вероятно, увеличение количества лизофосфатидной кислоты в мембране при таких стрессовых ситуациях, как повышение температуры окружающей среды, может быть необходимо бактериальной клетке для солюбилизации мембранных белков с целью сохранения их нативной конформации или для транспортировки.

Пространственная ориентация мембранных белков в мембране может изменяться в зависимости от различных факторов, в том числе, и не в последнюю очередь, благодаря взаимодействию с липидами. Следует отметить, что топология

мембранных белков и формирование третичной структуры для политопных
интегральных мембранных белков неразрывно связаны, так как встраивание в
мембрану данных белков и их сворачивание и ориентация происходят сопряженно
во время трансляции. При этом липиды не только оказывают влияние на степень
встраивания белков в мембрану, но и могут изменять топологию уже после
полного сворачивания. Так было показано, что отсутствие

фосфатидилэтаноламина в мембране E.coli приводит к инверсии ориентации
относительно плоскости мембраны первых шести трансмембранных доменов
транспортера лактозы LacY и полной потере функции белка (Bogdanov et al., 2002).
Было предположено, что при удалении цвиттерионных молекул

фосфатидилэтаноламина происходит замещение данного липида двумя другими отрицательно заряженными фосфолипидами - фосфатидилглицерином и кардиолипином, в результате чего мембрана «разбавляется» отрицательными зарядами, что, в конечном счете, способствует изменению топологии транспортера лактозы (Bogdanov et al., 2009; Dowhan et al., 2015). Таким образом, предполагается, что влияние липидов на топологию белков связано в первую очередь с изменением баланса зарядов на поверхности мембраны.

Топология мембранных белков в настоящее время предсказывается благодаря работам von Heijne и Elofsson, в основе которых лежит наличие «правила положительных зарядов внутри» (Peters et al., 2016). Согласно данному правилу положительно заряженные аминокислотные остатки мембранных белков чаще располагаются на цитоплазматической стороне (von Heijne, 1992; Nilsson et al., 2005; Bernsel et al., 2008). Однако не принимается во внимание липидный фактор, то есть влияние липидного состава мембраны на топологию мембранных белков. Исходя из полученных сведений о влиянии липидов на топологию белков правило положительных зарядов внутри было расширено до правила баланса зарядов (Bogdanov et al., 2012). Было предположено, что наличие цвиттерионных молекул фосфатидилэтаноламина в мембране критично для удерживания положительно заряженных цитоплазматических участков мембранных белков на внутренней стороне.

Для тестирования правомерности гипотезы важной роли баланса зарядов в ориентации белка LacY можно заменить фосфатидилэтаноламин на фосфолипид с равноценным суммарным зарядом (например, лизилфосфатидилглицерин), что может способствовать восстановлению баланса зарядов и возвращению нативной топологии LacY, либо приводить к неожиданным другим изменениям в случае влияния других факторов. Баланс зарядов представляет собой динамичную систему, поэтому при оценке баланса в мембране интерес также представляет не только липидный состав, но и процентное распределение различных фосфолипидов в бислое.

Транспортер лактозы LacY является белком со внутренней симметрией трансмембранных доменов (Abramson et al., 2003). Большая чувствительность первых шести доменов (N6 блока) к липидному составу может характеризоваться относительной независимой ориентацией симметричных блоков белка. В контексте различного фосфолипидного состава полное их разделение может способствовать иной топологии, что даст дополнительные сведения о влиянии липидов на топологию мембранных белков.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является оценка влияния фосфолипидов на топогенез транспортера лактозы во внутренней мембране Escherichia coli.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Оценить влияние лизофосфатидной кислоты на формирование третичной структуры транспортера лактозы LacY E.coli.

2. Оценить влияние лизилфосфатидилглицерина на топологию транспортера лактозы в мембране E.coli.

3. Определить топологию отдельно экспрессируемых фрагментов
транспортера лактозы N6 и C6 в мембране E.coli.

4. Проанализировать распределение лизилфосфатидилглицерина и
фосфатидилэтаноламина в бислое внутренней мембраны E.coli.

Научная новизна. Обнаружено, что при увеличении лизофосфатидной
кислоты в мембране Escherichia coli повышается содержание мембранных белков в
цитоплазматической фракции, вероятно, в результате активного образования
мицелл, что может быть связано с дестабилизирующим влиянием

лизофосфатидной кислоты на бислойную структуру мембраны. Увеличение гидрофильности мембранных белков путем их солюбилизации в мицеллах может быть одним из путей их транспорта в клетке.

Впервые показано, что увеличение содержания лизилфосфатидилглицерина в мембране E.coli, лишенной фосфатидилэтаноламина, приводит к восстановлению нативной мембраны. Инвертированная ориентация транспортера лактозы приобретает исходное нативное положение в мембране, что подтверждает гипотезу баланса зарядов между заряженными гидрофильными группами фосфолипидов и аминокислотными остатками мембранных белков для детерминирования топологии последних.

Показано, что внутримолекулярные взаимодействия в мембранных белках имеют важное значение для топологии: отдельно экспрессируемые фрагменты N6 и C6 транспортера лактозы димеризуются в мембране, осуществляют транспорт при правильной конформации и взаимно влияют на ориентацию друг друга.

Определено наличие асимметрии в распределении

лизилфосфатидилглицерина и фосфатидилэтаноламина в бислое внутренней мембраны E.coli, что может быть связано с необходимостью создавать полюса зарядов в мембране в соответствии с правилом положительных зарядов внутри для мембранных белков.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для поиска способов влияния на фосфолипидный состав мембраны микроорганизмов с целью увеличения их нежизнеспособности, в качестве нового подхода к лечению и дезинфекции. Воздействие на липидный состав клеток с целью изменения топологии и функции мембранных белков может быть использовано в фармакологии для модуляции активности клеточных рецепторов. Внутриклеточная солюбилизация мембранных белков в мицеллах может найти применение в биотехнологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение количества лизофосфатидной кислоты в мембране E.coli
способствует повышению содержания мембранных белков OmpF и LacY в
цитоплазматической фракции.

2. Увеличение лизилфосфатидилглицерина в клетках E.coli, не способных
синтезировать фосфатидилэтаноламин, приводит к восстановлению нативной
ориентации транспортера лактозы, нарушенной вследствие преобладания в
мембране отрицательно заряженных фосфолипидов.

3. Лизилфосфатидилглицерин и фосфатидилэтаноламин
преимущественно располагаются на внешней стороне бислоя внутренней
мембраны Escherichia coli.

Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается большим объемом многократных лабораторных экспериментов, выполненных и анализированных на современных высокоточных приборах; опубликованием полученных данных в отечественных и зарубежных журналах, с рецензированием ведущими учеными в данной области.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на международных и региональных конференциях: на ежегодных конференциях Казанского федерального университета - III научно-практической интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, Россия, 2011), и IV научно-практической интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, Россия, 2013), на 17-й школе-конференции в г. Пущино «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2013), на I международной интернет-конференции «Липидология – наука XXI века» (Казань, Россия, 2013), на международном симпозиуме «Биохимия - основа наук о жизни» (Казань, Россия, 2013).

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно–исследовательских центров. Исследования выполнены при поддержке грантов: гранта Министерства образования и науки Республики Татарстан «Алгарыш» (2012г.), частично за счет средств гранта NIH 5R37 GM020478 (2014г.). Личный вклад автора заключается в разработке основной проблемы исследования, планировании, организации и реализации ее экспериментального решения, интерпретации полученных результатов.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 2 научные работы в реферируемых журналах, рекомендуемых ВАК.

Общая структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и списка литературы. Работа изложена на 105

страницах машинописного текста, включает 21 рисунок, 2 таблицы. Библиография включает 135 наименований.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям д.б.н., профессору кафедры биохимии и биотехнологии Ф.К. Алимовой и к.б.н., доценту кафедры молекулярной биологии и биохимии Центра наук о здоровье, Университет Техас-Хьюстон (США) М.В. Богданову за постановку проблемы, внимательное отношение к работе, обсуждение результатов и чуткое руководство; ассистенту кафедры молекулярной биологии и биохимии Центра наук о здоровье (США) Хайди Витрак за помощь в постановке экспериментов и ценные рекомендации, к.б.н., доценту кафедры биохимии и биотехнологии, с.н.с. Н.И. Акберовой и к.б.н., доценту М.Я. Ибрагимовой за постоянные консультации и обсуждение полученных результатов; к.б.н., доценту кафедры биохимии и биотехнологии Д.А. Темникову и д.б.н., профессору З.И. Абрамовой за анализ работы и ценные советы по оформлению диссертации, аспиранту, ассистенту Р.Х. Аюпову и студенту Г.А. Андрианову за помощь в проведении вычислений распределения зарядов. Автор выражает искреннюю благодарность всем сотрудникам кафедры за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу, в особенности В.С. Гаврилову и Г.В. Гиниатуллиной.

Объекты исследования

1. Использованные микроорганизмы и плазмиды

В работе были использованы следующие штаммы E. coli:

1) JF618

2) SM2-1 plsC^ts (инактивирован ген 1-ацил-sn-глицерол-3-фосфат
ацилтрансферазы)

3. AD931 pssA::kan (инактивирован ген фосфатидилсеринсинтазы А)

4. AL95

5. AL95 pssA::kan (инактивирован ген фосфатидилсеринсинтазы А) В работе использовались следующие плазмиды:

1. pGP1-2 T7 polymerase tetR (ген T7 полимеразы)

2. pT7-5 LacY ampR (ген транспортера лактозы LacY)

3. pPACc mprF camR (ген фактора множественной устойчивости к пептидам mprF Staphylococcus aureus)

4. pT7-5 LacY 205C ampR (ген транспортера лактозы LacY с заменой на цистеин в положении 205)

5. pT7-5 LacY 13C ampR (ген транспортера лактозы LacY с заменой на цистеин в положении 13)

6. pDD72ts pssA (ген фосфатидилсеринсинтазы А pssA)

7. pT7-5 LacY N6 ampR (ген моноцистеинового белка LacY с 6 доменами)

8) pT7-5 LacY N6C6 ampR (гены транспортера лактозы LacY с первыми и
последними 6 доменами, разделенными).

Плазмиды были сконструированы ранее в лаборатории W. Dowhan и
Михаила Богданова в Центре Наук о Здоровье Университета Хьюстон-Техас, США
и упоминались в публикациях, либо получены от других исследователей.
Плазмиды pT7-5 LacY N6 ampR, pT7-5 LacY N6С6 ampR, pT7-5 LacY NT 13C
ampR, pT7-5 LacY NT 205C ampR несут гены транспортера лактозы LacY под
промотором Т7 полимеразы, содержащие последовательность для

моноцистеинового белка (с единственным цистеином) в положении 13 или 205 аминокислоты, либо для белка LacY с блоком N6 с концевым додекапептидом (эпитоп моноклональных антител), или для транспортера лактозы с разделенными первыми и последними 6 трансмембранными доменами (N6C6). Все перечисленные плазмиды несут устойчивость к антибиотику ампициллину.

В работе был использован штамм AL95, делетированный по гену pssA, растущий на питательной среде только в присутствии 50мМ хлорида магния. Данный штамм был трансформирован термочувствительной плазмидой pDD72, несущей ген pssA для регуляции синтеза фосфатидилэтаноламина и плазмидами pT7-5 LacY N6 ampR и pT7-5 LacY N6C6 ampR, формируя таким образом штаммы AL95 pssA::kan/pDD72/pT7-5 LacY N6 и AL95 pssA::kan/pDD72/pT7-5 LacY N6C6, сравниваемые с AL95 pssA::kan/pT7-5 LacY N6 и AL95 pssA::kan/pT7-5 LacY N6C6 соответственно, не синтезирующих фосфатидилэтаноламин.

Плазмида pPACc mprF camR содержит ген фактора устойчивости ко многим
пептидам и несет устойчивость к хлорамфениколу. Реципиентом плазмид pPACc
mprF camR и pT7-5 LacY NT 13C ampR, pT7-5 LacY NT 205C ampR послужил
штамм AD931 с делетированным геном фосфатидилсеринсинтазы pssA,
ответственным за синтез фосфатидилсерина, предшественника

фосфатидилэтаноламина. Делеция по данному гену несла маркер устойчивости к антибиотику канамицину. Наличие плазмиды с геном mprF позволяло данным штаммам синтезировать лизилфосфатидилглицерин.

Штамм SM2-1 нес делецию гена plsC, ответственного за синтез фосфатидной кислоты из лизофосфатидной кислоты и маркер термочувствительности. Трансформация данного штамма плазмидами pGP1-2 T7 polymerase tetR и pT7-5 LacY AmpR позволила создать сверхпродуцента транспортера лактозы за счет внедрения гена белка LacY под промотором T7 полимеразы и внедрения плазмиды pGP1-2, несущей дополнительный ген T7 полимеразы. Штамм JF618 использовался в экспериментах в паре с SM2-1 в качестве контроля и также был трансформирован плазмидами pGP1-2 и pT7-5 LacY. Данный штамм жизнеспособен на среде, содержащей 200 мкМ цитидина, так как несет мутацию в гене pyrG, ответственном за синтез ЦТФ-синтазы.

Методы, использованные в работе

2. Культивирование микроорганизмов

Стоки штаммов E. coli хранились в 40% глицерине при -80С. Для экспериментов инокуляцию проводили частичным размораживанием культуры с использованием сухого льда. Инокулят переносили на свежую LB-среду с агаром (Sambrook and Russel, 2001).

Для экспериментов по определению фосфолипидного состава культуры растили на жидкой среде LB с добавлением радиоактивного ³²P фосфата натрия в течение ночи до стационарной фазы при 30С или 37С и 250 об/мин. Либо

растили без метки в течение ночи для получения свежей ночной культуры и вносили инокулят в рассчитанном объеме до конечной оптической плотности OD₆₀₀ равной 0,05. Также вносили метку и растили до середины log-фазы (OD₆₀₀=0,6). Антибиотики добавлялись в среду в соответствии с необходимостью выращивать культуры согласно устойчивости до конечной концентрации: ампициллин 100 мкг/мл, канамицин 40 мкг/мл, тетрациклин 10 мкг/мл, хлорамфеникол 12,5 мкг/мл. Штаммы, дефектные по гену pssA растили с добавлением 50 мМ хлорида магния, дефектные по pyrG – 200 мкМ цитидина.

Штаммы JF618/pGP1-2/pT7-5 LacY и SM2-1 plsC^ts/pGP1-2/pT7-5 LacY растили в 1л колбах по 200 мл при 30С, 250 об/мин до середины log-фазы (OD₆₀₀=0,5), далее резко увеличивали температуру до 42С и инкубировали в течение 20 минут для увеличения синтеза лизофосфатидной кислоты и транспортера лактозы. Вносили рифампицин до конечной концентрации 100 мкг/мл для ингибирования транскрипции клеточной полимеразы и продолжали инкубацию в течение 10 минут. Затем продолжали рост при 37С в течение 1 часа.

3. Мечение фосфолипидов и экстракция

Культуры E.coli растили в присутствии радиоактивного фосфора ³²Р до 10
мкКи/мл до оптической плотности OD₆₀₀=0,6 при выделении на середине log-фазы
или OD₆₀₀=3,0 при выделении на стационарной. Далее клетки осаждали
центрифугированием и отмывали буфером с трисом (pH 7,5). Экстракцию
фосфолипидов из осадка производили ресуспендированием его в 0,1 мл 0,5 Н
хлорида натрия в 0,1 Н соляной кислоте. Затем добавляли 0,3 мл смеси хлороформ-
метанол (1:2) и встряхивали в течение 30 минут. Затем добавляли 0,1 мл 0,5 Н NaCl
в 0,1 Н HCl дополнительно для разделения фаз и дополнительного удаления
водорастворимых радиоактивных фосфатов. Встряхивали 10 минут и

центрифугировали 5 минут 13000 об/мин. Аккуратно собирали нижний слой. Далее просчитывали радиоактивность, используя 5 мкл экстракта. Экстракт хранили при -20С несколько недель.

4. Одномерная тонкослойная хроматография фосфолипидов

Для разделения фосфолипидов использовали систему растворителей хлороформ-метанол-вода-аммоний (60:37,5:3:1). Смесь готовили непосредственно перед использованием. Силикагелевые пластинки выдерживали 1 минуту в 1,2% борной кислоте в 48% этаноле до линии концентрирующей зоны. Высушивали 15 минут на воздухе и прокаливали при 190С в течение 60 минут. Затем охлаждали в потоке сухого воздуха и образцы, нормированные по радиоактивности, наносили на пластинку. После проведения ТСХ проводили визуализация фосфолипидов.

5. Двумерная тонкослойная хроматография фосфолипидов

Для двумерной ТСХ использовали щелочную (аммониевую) или нейтральную (водную) систему растворителей для первого вертикального направления и кислую (ацетатную) для второго горизонтального разделения. В случае использования щелочной системы для первого разделения состав содержал хлороформ-метанол-аммоний (65:30:4) и для второго кислого хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода (85:12,5:12,5:3). При использовании водной системы состав включал хлороформ-метанол-вода (65:25:4) для первого направления и

хлороформ-метанол-уксусная кислота (65:25:10) для второго. Для двумерной ТСХ использовали пластинки 10х10 см. В целом процедура идентична одномерной ТСХ.

6. Выделение и солюбилизация внутренних и внешних мембран E.coli

Клетки E.coli выращивали на LB-среде до OD₆₀₀=0,6 (так как исследовалась культура на середине log-фазы). Затем клетки осаждали центрифугированием 5000 об/мин 5 минут. Отмывали 0,1М трис-HCl, pH=8,0, содержащим 10 мМ хлорид магния. Разрушали клетки, используя гомогенизатор при давлении 70,3 кг/см² (1000 psi). Далее клетки осаждали 45 000 об/мин 45 минут, используя ротор Beckman SW-41. Осадок растворяли в использованном ранее буфере. При солюбилизации мембран детергентами добавляли ДДМ или дигитонин до конечной концентрации 1% или 2% соответственно.

7. Выделение и солюбилизация внутренних мембран E.coli в
инвертиртированной ориентации

Культивирование и осаждение клеток E.coli производили по стандартной процедуре. Разрушали клетки, используя гомогенизатор при давлении 35,15 кг/см² (500 psi). Разрушенные клетки осаждали по описанной схеме. Для градиентного разделения готовили растворы сахарозы от 25% до 55% (м/м). Сахарозу готовили на 0,1М трис-HCl, pH=8,0, содержащим 1мМ ЭДТА. Осадок мембран растворяли в 25% сахарозе и наслаивали последним слоем. Далее центрифугировали при 36 000 об/мин 5 часов 4С, используя ротор Beckman SW-41.

8. Определение КДО в мембранах

КДО – сокращенное название 3-дезокси-D-маннооктулозонового сахара, внешнего ядра липополисахаридов (ЛПС), который содержится во внешней мембране бактерий и является ее маркером. Для определения КДО в образцах добавляли 20% ТХУ к равному объему выделенных мембран и выдерживали 10 минут на льду. Центрифугировали 5000 об/мин 10 минут. Далее добавляли 0,3 мл 0,2Н серной кислоты. Выдерживали на кипящей водяной бане 30 минут. К 250 мкл образца добавляли 250 мкл периодовой кислоты (приготовленной 25 мМ в 1Н H₂SO₄). Встряхивали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 2% арсенита натрия. Встряхивали и инкубировали 2 минуты. Добавляли 2 мл 0,3% тиобарбитурата. Выдерживали на кипящей водяной бане 10 минут. Измеряли оптическую плотность при 549 нм. Нормировали количество КДО по следующей формуле:

OD₅₄₉ = 0,035 мкМ КДО/мг белка (1).

Значения нормировали на концентрацию белка.

9. Денатурирующий электрофорез мембранных белков в ПААГ и
вестерн-блоттинг

Образцы мембранных белков солюбилизировали дополнительно перед внесением в гель процедурой попеременного и инкубации по 15 минут. Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили согласно инструкциям поставщика реагентов и оборудования (Bio-Rad, США). В работе использовалось 2 типа переноса белков на мембрану при вестерн-блоттинге:

полусухая и водная системы. При полусухом переносе использовали методику Богданова и коллег (Bogdanov et al., 2006). При жидком использовали инструкцию поставщика (Bio-Rad, США). После переноса белков на мембрану, блокировали неспецифическое взаимодействие антител инкубацией в течение 16 часов в 5% бычьем сывороточном альбумине, приготовленном на трис-солевом буфере (10 мМ трис-HCl, 0,9% NaCl, pH=7,4) при температуре 4С.

Иммуноокрашивание проводили, используя в качестве первичных поликлональные кроличьи антитела к транспортеру лактозы (разведение 1:10 000), моноклональные мышиные антитела к транспортеру лактозы (1:10 000) и моноклональные мышиные антитела к порину OmpF (1:5000). Инкубация длилась 1-3 часа при комнатной температуре. После отмывки использовали вторичные козлиные анти-кроличьи или козлиные анти-мышиные антитела и инкубировали 1-2 часа. Проявляли реакцию коммерческим набором для хемилюминисцентной реакции.

10. Истерн-Вестерн блоттинг

На силикагелевую пластинку размером 10х10 см наносили в определенном
положении раствор фосфолипида (0,01% лизофосфатидная кислота в смеси
хлороформ-метанол-вода-30% гидроксид аммония, 120:75:6:2, о/о). Данную

область отмечали карандашом и далее осуществляли Истерн-блоттинг, заключающийся в термопереносе липидов с пластины для ТСХ на нитроцеллюлозную или поливинилиденфторидную мембрану. Высушенную в потоке сухого воздуха пластину помещали в смесь растворителей для переноса (изопропанол-0,2% водный хлорид кальция-метанол, 40:20:7, о/о) на 20-30 секунд. Далее помещали смоченную мембрану и 3 мм стекловолоконный фильтровальный лист на пластину и подвергали нагреванию с помощью термоблоттера фирмы ATTO при 180С в течение 60 секунд и нагревательного блока, толщиной 3 см. Далее мембрану сушили на воздухе и использовали для обычного вестерн-блоттинга исследуемых белков. Сравнивали ренатурацию в разных областях мембраны и оценивали влияние фосфолипида на данный процесс.

11. Определение топологии мембранных белков методом анализа
доступности замещенных цистеинов

Принцип и основные этапы мечения цистеинов мембранных белков N-малеимидпропионил биоцитином описаны в работе Богданова с коллегами (Bogdanov et al., 2006). Для анализа используются конструкции, имеющие только единственный цистеин, доступный для мечения.

12. Определение скорости транспорта субстрата транспортера
лактозы через внутреннюю мембрану

Скорость транспорта оценивали путем инкубации клеток с ¹⁴С-лактозой в течение периода времени по методике Богданова с коллегами (Bogdanov et al., 2006). Смешивали для анализа 1:1 по объему лактозу с 14С радиоактивно-меченой лактозой до получения 40 мМ лактозы, содержащей 50 мкКи/мл. Клетки были нормированы по плотности и полученные результаты соотносили с концентрацией белка.

13. Трансформация клеток E.coli плазмидами

Трансформацию бактерий плазмидами осуществляли по стандартной
методике (Sambrook and Russel, 2001). Клетки, не имеющие

фосфатидилэтаноламин, выращивались на среде с добавлением 50 мМ хлорида магния.

14. Статистическая обработка данных

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Исследования проводили в трех-пяти повторах. Для анализа данных и построения графиков использовали программы Excel, Quantity One и Slide Write Plus SWW6.

Топология мембранных белков

В клетках эукариот существует механизм сортировки мембранных белков, который определяет дальнейшую их маршрутизацию и последующую локализацию. Сортировка мембранных белков зависит от сигналов, кодируемых аминокислотной последовательностью белков. Большинство подобных сигнальных последовательностей находятся в N-концевой области, хотя для белков, направляемых в пероксисомы, характерно их расположение в C-терминальном участке. В первую очередь, маршрутизация определяется типом организации третичной структуры синтезируемого мембранного белка, который зависит от сигнальных последовательностей: ко-трансляционный (то есть образование третичной структуры осуществляется уже в процессе синтеза полипептидной цепи) или пост-трансляционный (осуществляется только после завершения синтеза белка). Как правило, пост-трансляционный путь характерен для мембранных белков, которых необходимо транслоцировать через мембрану, например, в митохондриях (Mellman and Nelson, 2008).

Некоторые черты между механизмом маршрутизации мембранных белков у прокариот и эукариот могут быть общими. Например, мембранный белок взаимодействует с транслоконом SecYEG в бактериях, в эндоплазматическом ретикулуме эукариот имеется соответствующий гомолог Sec61. Однако маршрутизация бактерий не может осуществляться идентичным механизмом хотя бы потому, что в прокариотических клетках нет эндоплазматического ретикулума и других органелл эукариот.

Бактерии содержат одну или две клеточные мембраны, а также различные мембранные органеллы и образования, которые располагаются внутри или снаружи клетки, например, такие как хроматофоры (в фотосинтезирующих бактериях), магнетосомы (в железо окисляющих или восстанавливающих бактериях), анаммоксосомы (в аммоний окисляющих), ацидокальцисомы (в кальций-фосфат утилизирующих) и различные везикулы, используемые для внутриклеточного и экстраклеточного транспорта (Saier and Bogdanov, 2013).

Было показано, что при гиперпродукции мембранных белков активно образуется внутриклеточная мембрана и везикулы, что может указывать на наличие определенного соотношения мембранный белок/липид в клетке (Arechaga et al., 2000; Arechaga et al., 2003). Вероятно, при избыточном синтезе мембранных белков возникает необходимость их солюбилизации, что заставляет клеточный гомеостаз использовать регуляцию генов синтаз липидов и активировать или супрессировать их экспрессию в зависимости от сигналов. Возможно, что существует и обратный процесс, при котором увеличенный синтез липидов сопряжен с повышенной продукцией мембранных белков. Гиперпродукция мембранных белков может приводить к их частичному нарушению формирования третичной структуры. Так как встраивание мембранных белков в мембрану происходит не самостоятельно, а задействует работу транслоконовой системы, вероятно, ошибки в третичной структуре являются следствием недостаточно эффективного функционирования системы встраивания, возникающего из-за повышенной нагрузки. Другой возможной причиной является влияние липидов на сворачивание и топологию мембранных белков: нарушение отношения количества мембранных белков к липидам ведет к неправильной структурной организации (Bogdanov et al., 2013).

Избыточно продуцируемые белки включаются в различные мембранные клеточные образования - цитоплазматические мицеллы и внутриклеточные везикулы (Aboulwafa and Saier, 2011). Внутриклеточные образования плазматической мембраны - мезосомы, были обнаружены как у грам-положительных, так и у грам-отрицательных бактерий, хотя для последних они наиболее характерны, так как участвуют во внеклеточном расщеплении (Li et al., 2008). У грам-положительных бактерий мезосомы образуются путем инвагинации плазматической мембраны, которая у E.coli также используется для внутриклеточных мицелл и везикул (Arechaga et al., 2000). Возможно, что внутриклеточные мембраны E.coli имеют схожую структуру и функцию, как и мезосомы у других бактерий (Bogdanov and Dowhan, 2012), а также идентичный механизм биогенеза. Такие белковые комплексы, как светособирающий реакционный центр RC-LH1, периферическая антенна белка LH2 и две фракции сопутствующих белков были выделены из внутриклеточных мембран фотосинтезирующих бактерий Rhodobacter sphaeroides, которые являются типичными компонентами плазматической мембраны клеток данных бактерий, что доказывает происхождение внутриклеточной мембраны от плазматической (Woronowicz et al., 2013).

В отличие от мембранных хроматофор, магнетосомы содержат уникальный состав мембранных белков, то есть не все белки магнетосом содержатся в плазматической мембране (Murat et al., 2010), но, несмотря на это, по ряду признаков считается, что мембрана магнетосом имеет схожий с плазматической мембраной биогенез.

Однако неизвестно, у всех ли прокариот биогенез внутриклеточных мембран и плазматической мембраны носит схожий характер. Например, цитоплазматическая мембрана бактерий, относящихся к типу Planctomycetes, имеет характерные для внешней мембраны грам-отрицательных бактерий свойства. У некоторых представителей этого рода имеются анаммоксосомы, органеллы, в которых осуществляется окисление аммония для использования в качестве энергетического источника. Данные органеллы содержат ладдераны, липиды с жесткой структурой, которые не встречаются нигде более (van Teeseling et al., 2013). Имеет ли мембрана анаммоксосом схожую структуру, а главное, механизм биогенеза с клеточной мембраной этих бактерий - не выяснено.

Культивирование микроорганизмов

Независимость результата от контаминации выявили путем повторения экспериментов (3 повтора). Цитоплазматическая фракция клеток штамма с увеличенным содержанием ЛФК всегда содержит значительное количество мембранного белка транспортера лактозы LacY, в то время как контрольный штамм - почти не содержит. Очевидно, что ЛФК напрямую или опосредованно способствует уменьшению содержания транспортера лактозы в мембране при сверхпродукции данного белка и одновременно увеличивает в цитоплазме. Интересно отметить, что белок, остающийся в мембране, находится преимущественно в нативной конформации.

По всей вероятности, повышение содержания лизофосфатидной кислоты как бислой-дестабилизирующего фосфолипида приводит к интенсивному образованию мицелл. Данная гипотеза подтверждается результатами исследований влияния стрессовых условий, при которых увеличение температуры инкубации при росте клеток E.coli влекло за собой образование мицелл и увеличение лизофосфатидной и фосфатидной кислот (Kooijman et al., 2005). Вероятно, при образовании мицелл, формируемых в большом количестве при повышении температуры и лизофосфатидной кислоты, происходит солюбилизация мембранных белков, что дает им возможность находится в цитоплазме. Неизвестно, является ли повышение уровня ЛФК необходимостью клетки сформировать мицеллы при температурном стрессе, либо данный процесс происходит как следствие увеличения бислой-дестабилизирующего фосфолипида и не имеет важной биологической роли для клетки. Одной из причин образования мицелл может быть необходимость сохранить мембранные белки от денатурации при температурном или ином стрессе с последующим использованием вместо утилизации. Такого рода удаление белка из мембраны с сохранением его свойств может являться функцией хранения белка, перевода его в более водорастворимую форму. Однако следует отметить, что клетки контрольного штамма не содержали большое количество мембранных белков в цитоплазме, несмотря на температурный стресс, которому они так же подвергались. Кроме того, не было отмечено значительное увеличение содержания ЛФК в мембране контрольных клеток. Вероятно, ЛФК способствует образованию мицелл и солюбилизации мембранных белков, однако данный процесс не связан с температурным стрессом. Подобным образом оценили распределение белка порина OmpF, для которого также наблюдается увеличение содержания в цитоплазматической фракции (рисунок 7). Следует отметить, что транспортер лактозы находится во внутренней мембране, в то время как порин OmpF располагается на внешней. Очевидно, что увеличение лизофосфатидной кислоты должно приводить к интенсивному образованию мицелл и солюбилизации различного рода мембранных белков: не только из различных мембран, но и с различной третичной структурой - -спиральные белки и -бочонки.

При этом остается неясным механизм солюбилизации мембранных белков в мицеллах: происходит ли формирование фосфолипидных мицелл с последующим встраиванием мембранных белков и участвует ли при этом транслокон или мицеллы образуются путем инвагинации мембраны, состоят ли они исключительно из фосфолипидов с одной жирной кислотой и имеют однослойную структуру по типу мицелл, образуемых детергентами, или происходит формирование мицелл с бислойной структурой и различным фосфолипидным составом.

Участие транслоконовой системы во встраивании мембранных белков в мицеллы могло способствовать увеличению содержания данных белков, то есть усилению также и их синтеза для выполнения функции. Однако количество компонента транслоконовой системы белка SecY приблизительно равное количество в клетках опытного и контрольного штаммов, как в мембране, так и в цитоплазматической фракции (рисунок 8). Предположительно, для белка SecY нахождение как в гидрофильной, так и в гидрофобной среде является нормальным состоянием вследствие ряда факторов. Компонент транслокона белок SecA, выполняющий АТФазную функцию, локализуется исключительно в мембранной фракции, количество в опыте и контроле также не имеет видимых отличий (рисунок 9). Рисунок 9 - Количество SecA во фракциях. Ц - цитоплазматическая фракция, М - мембранная фракция.

Данный факт может указывать на отсутствие дополнительного увеличения работы транслоконовой системы SecYEG. По всей видимости, солюбилизация белков в мицеллах происходит без участия транслокона, наиболее вероятен процесс инвагинации мембраны, при котором белки уже являются частью будущих мицелл. Но следует учитывать, что количество компонентов транслокона в мембране не является доказательством или опровержением участия транслокона, так как существует вероятность наличия высокой эффективности его функционирования, не требующего увеличения количества белка для производства данных процессов.

Таким образом, солюбилизация мембранных белков в мицеллах может иметь цель сохранения нативной структуры при их избыточном содержании для быстрого использования при возникающей потребности без утилизации и длительного и энергозатратного процесса повторного синтеза. "Упаковка" мембранных белков может также являться средством для транспортировки белков в пределах цитоплазмы без использования каких-либо специализированных органелл и структур.

Определение топологии мембранных белков методом анализа доступности замещенных цистеинов

Возможно, что наличие фосфатидилэтаноламина в составе мембраны удерживает положительные заряды, имеющиеся на цитоплазматических экстрамембранных доменах транспортера лактозы C2, C4 и C6, от ориентации на внешней стороне мембраны, поддерживая определенный баланс зарядов между аминокислотными остатками мембранных белков и заряженными группировками фосфолипидов. При удалении фосфатидилэтаноламина происходит «разбавление» мембраны отрицательно заряженными фосфатидилглицерином и кардиолипином, что, возможно, приводит к «неправильной» ориентации, в результате которой белок теряет способность осуществлять активный транспорт. Однако N6 фрагмент, не связанный ковалентно с С6 фрагментом, может иметь большую подвижность и взаимодействовать с липидным слоем иначе, что в результате приводит к изменению ориентации кардинальным образом. При этом остается неясно, почему наблюдается транспорт в клетках, содержащих фосфатидилэтаноламин и N6C6 димер. Если N-участок N6 фрагмента в данном димере ориентирован наружу, то активный транспорт был бы невозможен. Может быть, в димере N6C6 участок N6 располагается как в нативном белке, а в клетках, содержащих только N6 участки, их ориентация осуществляется указанным способом (наоборот) в зависимости от липидного состава. В таком случае, очевидно, что С6 фрагмент транспортера лактозы также оказывает некоторое влияние на топологию при димеризации.

Топология мембранных белков может определяться рядом факторов, таких как работа транслоконовой системы, наличие определенных аминокислотных последовательностей в синтезируемой полипептидной цепи, воспринимаемых в качестве топогенных сигналов, определенное распределение зарядов, взаимодействие между доменами белка, образование солевых мостиков, гликозилирование и липидный состав (Bogdanov et al., 2012). Считается, что липидный состав принимает участие на последней стадии фолдинга белка, определяя конечный вариант его топологии. Существует гипотеза баланса зарядов, согласно которой при формировании топологии мембранных белков важное значение имеет определенный баланс между зарядами аминокислотных остатков белков и фосфолипидами. Таким образом, фосфолипидный состав мембраны оказывает непосредственное влияние на топологию мембранных белков. Однако данное влияние становится более сложным и неоднозначным, если принять во внимание, что распределение фосфолипидов в бислое мембраны может быть асимметричным.

Для исследования распределения фосфолипидов во внутренней мембране E.coli, были использованы штаммы с нормальным фенотипом (ФЭ+), клетки, не содержащие фосфатидилэтаноламин (ФЭ-) в качестве контроля, и клетки, содержащие лизилфосфатидилглицерин (ЛФГ+). Тринитробензосульфоновая кислота не проникает сквозь мембрану, специфично связывается с аминогруппами фосфолипидов и таким образом тринитрофенил-производные фосфолипидов затем можно легко детектировать как отдельные пятна на тонкослойной хроматограмме. Как видно на рисунке 17, в контрольном варианте 9 не наблюдается ТНФ-фосфатидилэтаноламин и количество фосфатидилэтаноламина составляет 74% от общего содержания фосфолипидов. В вариантах 10-12 происходит смещение содержания фосфатидилэтаноламина в сторону ТНФ меченого производного. В варианте 12 ТНФ-ФЭ достигает максимального количества, при этом количество ФЭ пропорционально снизилось. Количество доступного для мечения фосфатидилэтаноламина составило приблизительно 78% от общего его количества. Таким образом, распределение фосфатидилэтаноламина в бислое мембраны E.coli осуществляется по принципу 78% и 22% на внешней и внутренней стороне соответственно, что свидетельствует о наличии четко выраженной асимметрии распределения (почти 4/5 находится на внешней стороне).

Схожая картина наблюдается для лизилфосфатидилглицерина относительно смещения количества в вариантах 5-8 в сторону увеличения ТНФ-меченого ЛФГ. Было обнаружено, что лизилфосфатидилглицерин полностью доступен для мечения, так как пятно, соответствующее ЛФГ в варианте 8 исчезает. Следовательно, 100% ЛФГ находится на внешней стороне бислоя. Рисунок 17 - Анализ распределения фосфолипидов в пределах бислоя внутренней мембраны E.coli. Цифрами обозначено процентное содержание от общего количества фосфолипидов. Варианты 1-4, 5-8 и 9-12 – 4 типа инкубации, где 1,5 и 9 – отрицательные контроли; 4,8 и 12 – максимальное время инкубации и температуры.

Фосфатидилэтаноламин и лизилфосфатидилглицерин имеют положительно заряженные группировки. Возможно, асимметрия их распределения в бислое внутренней мембраны E.coli диктуется необходимостью расположения положительных зарядов снаружи, а внутренняя часть бислоя организована в основном отрицательно заряженными фосфолипидами – фосфатидилглицерином и кардиолипином для поддержания баланса с положительными зарядами цитоплазматических экстрамембранных доменов белков. Возможно, именно асимметрия распределения данных фосфолипидов является критичным фактором для топологии мембранных белков: удаление фосфатидилэтаноламина из мембраны приводит к исчезновению асимметрии в распределении зарядов фосфолипидов, что в свою очередь влечет за собой изменение топологии транспортера лактозы LacY.

Анализ распределения заряженных аминокислот гомологов транспортера лактозы бактерий с различным липидным составом мембраны Выдвинутая гипотеза баланса зарядов на поверхности мембраны предполагает влияние зарядов фосфолипидов на топологию мембранных белков и на распределение заряженных аминокислот в данных белках. Известно, что положительно заряженные аминокислоты располагаются преимущественно на цитоплазматической стороне мембраны, что, вероятно, происходит благодаря взаимодействию их с отрицательно заряженными группировками фосфолипидов. Продемонстрированные ранее и в данном исследовании сведения об асимметрии фосфолипидов способствуют укреплению гипотезы баланса зарядов. Таким образом, следует предположить, что близкородственные бактерии, у которых имеются некоторые различия в процентном соотношении фосфолипидов с разными зарядами, должны иметь также отличия в распределении заряженных аминокислот. Выявление возможной связи липидного состава с топологией мембранных белков не только бы дополнило имеющуюся гипотезу, но и способствовало появлению нового представления об эволюции бактерий на молекулярном уровне.

В качестве модельного белка выбран транспортер лактозы LacY E.coli, который является хорошо изученным белком и для которого имеется много экспериментальных данных по топологии в различном липидном окружении. Для анализа возможной зависимости были выбраны 6 относительно близкородственных бактерий. Для адекватности полученных результатов необходимо сформировать выборку именно из близкородственных бактерий, так как белок LacY присутствует не у всех бактерий, а также возможно влияние непредвиденных факторов на распределение. Выбранные виды, принадлежащие одному семейству энтеробактериевых грам-отрицательных бактерий, к которому относится и E.coli, а также их фосфолипидный состав представлены в таблице 1. Данные по липидному составу взяты из литературных источников (Ratledge and Wilkinson, 1988; Bay and Turner, 2013).

Внутримолекулярное взаимодействие транспортера лактозы LacY при встраивании в мембрану

Выходные данные алгоритма SCAMPI представляют последовательности вида iiiMMMooo, где iii соответствует внутреннему сегменту, MMM – мембранному, ooo – внешнему. Для подсчета количества положительно заряженных аминокислот аргинина и лизина, и отрицательно заряженных аспарагиновой и глутаминовой кислот в различных участках последовательностей, была разработана программа, написанная на языке Python. Для оценки влияния липидного состава на распределение аминокислот в белках LacY необходимо было разработать показатель распределения. Таким показателем является отношение суммы всех зарядов, обнаруженных на внутренней стороне мембраны к сумме внешних зарядов (IN/OUT). Данный показатель не отражает возможной зависимости распределения от местонахождения участка. Так известно, что у ряда мембранных белков, имеющих N-терминальный участок, ориентированный в цитоплазму, данный сегмент имеет большее количество положительно заряженных аминокислот относительно остальных внутренних участков. У транспортеров сахаров, как правило, наибольшее количество положительных зарядов несут первые три цитоплазматических участка (Bogdanov et al., 2008). Однако для выявления подобного рода зависимости необходимо оперировать большой выборкой различных белков, что может являться более глубоким анализом после выявления первичной зависимости. Для выявления зависимости в целом критерий IN/OUT является наиболее подходящим.

Выбранные критерии липидного состава бактерий и распределения заряженных аминокислот в белках LacY имеют прямую корреляцию (0,90), что говорит о наличии зависимости. Увеличение в мембране липидов, несущих отрицательный заряд, приводит к увеличению количества положительно заряженных аминокислот на цитоплазматической стороне (рисунок 21), либо к снижению их на периплазматической стороне (увеличение числителя в показателе IN/OUT, либо снижение знаменателя). Рисунок 21 – Зависимость распределения заряженных аминокислот в белках LacY от липидного состава бактерий

Полученные сведения о влиянии липидного состава на распределение зарядов в мембранных белках на примере транспортера лактозы согласуются с выдвинутой гипотезой баланса зарядов. Расчеты подтверждают данные Кломпенбурга по транслокации пептидного участка через мембрану в зависимости от количества положительно заряженных аргининов: увеличение отрицательно заряженных фосфолипидов в составе мембраны приводит к удержанию положительно заряженных участков белков на внутренней стороне (Klompenburg et al., 1997), при этом чем больше положительных зарядов несет участок, тем сложнее его транслоцировать.

Аналогичные выводы можно сделать из данных по определению влияния липидного состава на количество положительно заряженных аминокислот в белках с двойной топологией (Bay and Turner, 2013). В исследовании данных авторов также учитывался вклад отдельных участков, но, несмотря на выявленные корреляции, глобальное влияние оказывает количество зарядов и их расположение относительно мембраны, а не позиция в белке, как упоминалось ранее. Примечательно, что для грам-положительных бактерий был получен совершенно противоположный результат, тогда как количество отрицательно заряженных фосфолипидов в мембране у них содержится больше, чем в грам-отрицательных (в особенности, принадлежащих семейству бациллярных). Следует отметить, что правило положительных зарядов внутри распространяется не только на клетки бактерий, но и эукариот, что было продемонстрировано на 107 организмах (Nilsson et al., 2005). Таким образом, положительно заряженные аминокислоты располагаются преимущественно на цитоплазматической стороне в экстрамембранных участках интегральных мембранных белков, однако взаимосвязь липидного состава и распределения аминокислот в белках оказывается более сложной и, по всей видимости, зависит не только от зарядов липидов, но и ряда других факторов. Топология белков зависит от работы транслокона, белок-белковых взаимодействий и совокупности топогенных сигналов, которые несет последовательность белка (описано в обзоре литературы), однако и липидный фактор не однороден, что делает полногеномное сравнение по зарядам более сложным.