Введение к работе
Актуальность проблемы. Большой интерес, проявляемый к липо-литическим ферментам, играющим важную роль в процессах жизнедеятельности всех организмов, связан как с фундаментальными аспектами, так и о высокой потребностью многих областей промшленности и медицины в ферментных препаратах липаз.
Поскольку липиды являются одним из важнейших компонентов лгоопротеидных и липополисахаридных комплексов, входящих в состав биомембран, клеточных стенок и многих других ультраструктурных составляющих живых клеток, реакции с участием липаз часто играют ключевую роль во многих внутриклеточных процессах.
Быстрое развитие новых биотехнологий с использованием липаз связано с их широким применением в пищевой, кожевенной, парфюмерной, хлебо-пекарной, клее-желагиновой, текстильной промышленнос-тях, производстве моющих средств, очистке сточных вод и др.
Для изучения механизма катализа с участием липаз, а также при организации различных биотехнологических производств, чрезвычайно важно иметь внсокоочщекные препараты липаз с определенной специфичностью. Для решения этих проблем актуальными являются исследования по выделению и конструированию высокоактивных продуцентов липаз, повышешпо выхода продуктов воздействием на механизмы естественной секреции, отработке методов и схем очистки ферментов до гомогенного состояния, разделению множественных форм фермента и изучению их биогенеза, путей секреции, локализации в клетках и специфичности действия. Успехи в получении высокоочиценных ферментных препаратов в значительной степени связаны с разработкой и внедрением в Сиотехнологическую практику высокоэффективных методов аффинной хроматографии на биоспецифических сорбентах. В отличие от обычных методов выделения и очистки ферментов, основанных на различиях в молекулярной массе, заряде и др., в аффинной хроматографии используется уникальная способность биокатализаторов специфически и обратимо взаимодействовать с некоторыми' соединениями: субстратами, ингибиторами, коферментами и т.д. Это позволяет уст-транить многостадийность и трудоемкость, увеличить выход очищенного фермента.
Важность биохимических и физико-химических исследований лилологических ферментов связана также с особым типом катализируемых ими реакций. Липазы, являясь водорастворимыми белками, катализируют гидролиз или этерификацгда нерастворимых в воде субстратов, функционируя на границе раздела липид-вода.
Вследствие сложности физических условий протекания липолизэ наши знания особенностей регуляции этих реакций существенно отстают от тех. которые известны для гомогенного катализа. Именно эти особенности липолитических ферментов вызывают большой интерес в плане их иммобилизации на нерастворимых носителях.
В последние годы большое внимание уделяется изучению липаз мицелкалышх гриОов, что связано в первую очередь с их ценными и уникальными свойствами при проведении многих реакций. Так, например, из трех липолитических ферментов, у которых на сегодняшний день полностью изучена структура, включая кристаллографический анализ трехмерной структуры методом х-лучевой диффракции, два являются липазами, выделенными из мщелиалышх грибов Geotrychum candidum и Ehlzomucor mlechel.
В настоящее время выделены и сконструированы высокопродуктивные грибтее штаммы. Интенсивно проводятся микробиологические, генетические, молекулярно - биологические, биохимические и физико-химические исследования липаз микроорганизмов. Следует, однако, отметить, что до сих. юр мало уделяется внимания вопросам механизмов биосинтеза и секреции липаз, а также их локализации в клетках мицелиалышх грибов.
Все сказанное свидетельствует об актуальности, научной и практической значимости исследования липаз мицелиалышх грибов.
Цель и задачи исследований.
Целью настоящей работы являлось получение высокоактивных продуцентов липаз и изучение особенностей биосинтеза и секреции этих ферментов, а также разработка высокоэффективных способов их выделения и очистки, изучение физико-химических и каталитических -евейсаалі_щдалежшие в биотехнологии.
В задачи эxотёpймel^rль^шx--и*cлeлJEЗJDXй_^xoда
-
Получение высокоактивных продуцентов липазгрибов! —
-
Изучение особенностей регуляции их биосинтеза;
-
Разработка новых высокоэффективных биоспецифических сорбентов для гидрофобной хроматографии и выделение с их помощью высокоочицешшх препаратов липаз;
4) Всестороннее изучение физико-химических и каталитических
свойств выделенных липаз;
5) Изучение природы множественных молекулярных форм липаз, их
свойств и динамики их накопления у разных штаммов грибов;
6) Получение иммобилизованных препаратов липаз с помощью
разработанных новых биоспецифических сорбентов и изучение особенностей; их ферментативного катализа; ?) Локализация множественных молекулярных форм липаз в клетках . грибов;
-
Изучение закономерностей терминальной стадии секреции липаз у грибов;
-
Решение ряда вопросов, связанных с разработкой липазшх препаратов, в том числе иммобилизованных:, для биотехнологических целей.
Научная новизна.
Выделены высокоактивные штаммы гриба Rhizopus mlcrosporus - продуценты липаз и оптимизированы условия биосинтеза ими этого фермента. Изучена динамика накопления вне- и внутриклеточных форм липаз в лроизссе роста культур.
Из разных штаммов выделены и очицены до гомогенного состояния препараты липаз с помощь» вновь разработанных биоспецифических гидрофобных сорбентов. Изучены физико-химические, каталитические и иммунологические свойства множественных молекулярных форм липаз из разных штаммов грибов.
Разработаны новые биоспецифические сорбенты для эффективной иммобилизации: липаз, повышающие их стабильность в отношении температуры, рН и вызывающие изменение позиционной специфичности, приводящее к появлению у них сгереоспецифячдасти.
Установлены особенности терминальной стадии секреции липаз у исследованных мицелиальных грибов и изучена локализация множественных молекулярных форм этого фермента в клетках. Показана векторная направленность секреции липаз микромицетами в апикальную область гиф.
Впервые в клеточных оболочках микромицетов, относящихся к низшим эукариотам, обнаружены специализированные структуры ("каналы"), участвующие в экспорте липаз во внешнюю среду.
Полученные результаты является физиолого-биохимической основой для эффективного использования растворимых и иммобилизованных препаратов липаз микромицетов для решения ряда практических задач (осветления и хранения соков, в кожевенном, меховом производстве при переэтерификации жиров и масложировой промышленности).
Основные полокения, выносимые на защиту. 1. Путем искусственной селекции исходный штамм Rh. mlcrosporus УзЛТ-I разделен на два новых, морфологически различающихся,
штамма - УзЛТ-5С и УзЛТ-4В, с повышенной липолитической активностью. В ходе длительного последующего анализа морфологических признаков и биохимической активности вновь выделенных штаммов получено подтверждение их генетической стабильности.
-
На основе микрокристаллической и аминоэтилцеллгаозы, путем химической модификации, синтезированы Сиоспецифические сорбенты для гидрофобной хроматографии, с помощью которых проведено одноэтапное разделение липаз из пяти штаммов мицелиальных грибов.
-
При иммобилизации растворимых липаз на биоспецифических сорбентах: "липосорб-4", "липосорб-8" и "липосорб-16", расширяется область оптимального значения рН и температуры, а также значительно повышается стабильность иммобилизованных липаз, не снижающих активности при многократном использовании.
Среди использованных сорбентов наиболее эффективным является "липосорб-16" (ашшоэзилцеллкшоза с пальмитиновым остатком).
-
У иммобилизованных липаз Eh. microsponis изменяется позиционная специфичность. В отличие от растворимых липаз, у которых с одинаковой скоростью гидролизуются триглицерида в I и 3 положениях иммобилизованные липазы преимущественно катализируют отщепление жирных кислот в положении I. Образующиеся в результате реакции 2,3-диглицерида обладают свойствами стереоизомеров. В результате конформационшх изменений, после иммобилизации, у липаз этого гриба появляется свойство стереоспецифичности.
-
Множественные формы липэз кавдого штамма различаются по молекулярной массе, другим физико-химическим свойствам, особенностям катализа и по субстратной специфичности. Поскольку различные молекулярные формы липаз из трех исследуемых штаммов Hhizopus
___mlcrosporus, сходные по молекулярным массам близки и по другим cBoftc^BalTTrpeHnoTmEaaTCHjiaHHrae у них генетического родства.
6. Содержание отдельных форм~^нёкл5точяиЕ—липаз__гоменяется в
динамике роста микромицетов. В середине зкспоненциальной~іазьгу
трех исследуемых штаммов Bh. microsponis в среду выделяется
одна форма - 66 кДа (у штамма УзЛї-5С, а у штаммов УзЛТ-I и
УзЛТ-4В - 69 кДа), а к началу стационарной фазы и все другие
секретируемые формы.
7. Методом иммуноцитохимического анализа вперьые выявлеш в облас
ти клеточных стенок специализированные структуры -"каналы",
участвующие в секреции липаз в окружающую среду. Установлено,
что одной из молекулярных форм, экспортируемых через "каналы'
является форма А. 8. Секреция липаз у мицелиальных грибов имеет векторную направленность в сторону растущего кончика гиф. Большая часть фермента концентрируется в апикальной части (а, (3 - зонах) периплазматического пространства. Среди множественных форм липазы, обнаруживаемых в периплазме, выявляются Б, В и Д-формы. Формы Б и В по-видимому содержатся е клеточных стенках и увлекаются в окружающую среду с потоком постоянно обновляющихся полимеров клеточной стенки в р-зонэх апикальной части гиф.
Практическая ценность работы-.
Разработаны регламенты получения технических и иммобилизованных препаратов липаз- "лишмикроспорина" и "лжіолактияа". Б производственных условиях получены их опытные образцы. Разработан способ получения жирных кислот и глицерина из растительных масел. Препараты использованы для осветлеіпія и хранения соков, в кожевенном, меховом и шелко-могзльном производстве, при переэтерификации жиров, и на других предприятиях масложировой ігромьшіенности. Син-тезированые нами гидрофобные сорбенты лшюсорб-4, липосорб-8 и липосорб-16 используются в различных лабораториях для очистки и иммобилизации липаз.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на II, III и IV конференциях биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Бишкек, 1976; Душанбе, 1981; Ашгабат, 1986); на II Всесоюзном совещании по ферментам микроорганизмов (Минск,1978), на II и III республиканских научно-теоретических конференциях молодых ученых- микробиологов (Ташкент, 1978, 1983), на IV Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Кобулети, 1985), на I региональном совещаний по химическим реактивам рэспублик Средней Азии и Казахстана (Душанбе,1986), на IV Всесоюзной конференции по ферментам микроорганизмов (Ташкент, 1988), на Международном конгрессе бактериологов и микологов (Осака, Япония, 1990), на Российской конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, получено I авторское свидетельство.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 415 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалоз и методов,