Введение к работе
Актуальность проблем». Цитохромы Р450 - надсемейство гемопротеинов, являющиеся ключевыми ферментами метаболизма ксенобиотиков в живых системах (Archakov and Bachaanova, 1990). Надсемейство включает в себя множественные формы цитохромов Р450, в значительной степени различающихся по аминокислотному составу, субстратной специфичности, однако имеющие близкие спектральные характеристики и одинаковый механизм катализа. Данные о структуре, расположении и свойствах как общих, так и специфичных функционально-активных участков цитохромов Р450 вахнн для изучения механизма действия этих ферментов. Большинство цитохромов Р450 представляют собой мембранные белки, что затрудняет изучение их структуры методом кристаллографии. Структурно-функциональное картирование цитохpomod Р450 путем пептидного сканирования линейных антигенных детерминант в случае этих белков может бить использовано для изучения их структуры.
Антигенными детерминантами нативного белка являются участки, на которые вырабатываются и с которыми связываются при иммунном ответе специфические антитела. Эти участки располагаются главным образом на поверхности белка (Green et al., 1982). Следовательно, выявление антигенных детерминант дает представление о структуре поверхности исследуемых белков. Данные антигенного картирования позволяют получать антипептидные антитела, которые могут использоваться в структурно-функциональных исследованиях Зелковых молекул (Atassi, 1984; Arnon, 1388; Milich, 1989). Определение антигенных детерминант одного и того же белка в разных конформационных состояниях дает возможность выяснить іокализацию участков, чья ангигенностъ зависит от іространствєнной конформации белка.
В настоящее время определение антигенных детерминант іозможно осуществлять с помощью метода пептидного сканирования PEPSCAN (Geysen et al . , 1987), использующего
последние достижения белковой инженерии в области пептидно синтеза на твердофазных носителях, а также мет иммуноферментного сорбционного анализа.
Цедь и задачи исследования.. Целью настоящг
исследования явилось полное антигенное картирован зукариотическия микросомальных цитохромов Р450 1А2, 2В4 апо-цитсхрома Р450 2В4 методом пептидного сканирования последующим соотнесением локализации найденный ливей» антигенных детерминант с известными структур* Функциональными областями исследуемых цитохромов, а таи сравнением антигенных структур холо- и апо-форм Р450 меэ собой. В связи с поставленной целью необходимо бь решить следующие задачи:
1.Методом пиновой технологии синтезировать гексапепэт для антигенного картирования цитохрома Р450 1А2.
2.Получить и охарактеризовать мышиную и кури» антисыворотки к цитохрому Р450 1А2, а также антисыворо1! курицы к нативному цитохрому Р450 2В4 и его апо-форме.
3.Методом ELISA гексапептидов цитохрома Р450 1А2 ранее синтезированный в НИИ биомедицинской хи* гексапептидов цитохрома Р450 2В4 определить линей» антигенные детерминанты исследуемых белков, испольг полученные поликлональные антисыворотки.
4.С помощью поиска пептидных мотивов в базе данных < выявить индивидуальные и группоспецифичеекие антиген» детерминанты цитохромов Р450 1А2 и 2В4.
5.Сопоставить расположение антигенных детерминант известными структурно-функциональными элементами иселедуен белков.
8.Сравнить экспериментально найденные антигена детерминанты цитохромов Р450 1А2 и 2В4 с детерминанта* предсказанными с помощью различных алгоритмов.
Научная новизна и практическая значимость—eaoj
Научная новизна данной работы состоит в установлен антигенных детерминант цитохрома Р450 1А2 и апо-фо? цитохрома Р450 2В4 методом пептидного сканирования, а таї
в сопоставлении антигенных карт холо- и апо-цитохрома Р450 2В4 и оценки возможности использования результатов антигенного картирования для исследования динамики пространственной структуры белков. Впервые сравниваются антигенные карты одного и того же белка, полученные с использованием антисывороток от животных различных видов.
Полученные данные могут быть использованы для: 1) получения моно- и группоспецифических антипептидных антител к цигохромам Р450; 2) получения антипептидных антител, взаимодействующих с определенными участками цитохромов Р450 1А2 и 2Б4 с целью поиска и исследования функционально важных участков этих белков; 3) моделирования пространственной структуры Р450 1А2 и 2В4; 4) изучения конформационных изменений цитохрома Р450, отражающихся на структуре его поверхности; 5) разработки новых методов предсказания антигенных детерминант.
йпробапия работы, Основные результаты работы были
представлены на 10-м и 11-м Международных симпозиумах по микросомам и окислению лекарств (Канада, Торонто, 1994 и США, Лос Анджелес, 1996), на 9-й Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома P45G (Цюрих, Швейцария, 1995) и на 3-й Международной конференции по молекулярному узнаванию (Сингапур, 1995). апробация диссертации состоялась на научной конференции лабораторий НИИ биомедицинской химии Pftffii.
ПхбДЖЗіШЬ. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах маамнописного текста, включая 20 таблиц и 22 рисунка, и состоит из следующих основных разделов; "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список литературы".