Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы «Биодеградация лигнина грибами белой гнили» 15
II. 1. Лигнин: определение, функции, распространение. 15
II. 1.1. Общие сведения. 15
II. 1.2. Биосинтез лигнина. 16
II. 1.3. Строение лигнина. 18
II. 1.4. Препараты лигнина . 20
II.2. Микробиология разложения лигнина. 24
II.2.1. Анаэробное разложение лигнина. 24
II.2.2. Разложение лигнина бактериями. 24
- Актиномицеты. 25
- Эубактерии. 28
- Туннелирующие бактерии. 29
II.2.3. Разложение лигнина грибами. 30
- Грибы «мягкой» гнили древесины. 30
- Грибы «бурой» гнили древесины. 31
- Грибы «белой» гнили древесины. 33
- Другие грибы. 36
II.2.4. Микробные сообщества. 38
II.3. Физиология разложения лигнина грибами белой гнили. 39
II.3.1. Субстратная адаптация грибов белой гнили. 39
II.3.2. Условия разложения лигнина грибами белой гнили. 40
- Лигнинолитическая активность как функция вторичного метаболизма. 40
- Индуцибельность лигнинолитической системы. 41
- Необходимость косубстрата. 42
- Необходимость аэробных условий. 42
11.4. Энзимология разложения лигнина грибами белой гнили. 43
II.4.1. Лигнинолитические ферментные комплексы. 43
II.4.2. Лигнин пероксидаза. 45
- Определение. 45
- История изучения и распространение. 46
- Строение лигнин пероксидазы. 47
- Каталитические свойства. 50
- Лигнинолитические свойства. 54
- Функции лигнин пероксидазы. 57
- Особенности экспрессии и идентификации. 58
II.4.3. Мп-пероксидаза. 60
- Определение. 60
- История изучения и распространение. 60
- Строение Мп-пероксидазы. 61
- Каталитические свойства. 64
- Лигнинолитические свойства. 67
- Функции Мп-пероксидазы. 69
- Особенности экспрессии и идентификации. 70
II.4.4. Другие пероксидазы. 71
- Mn-зависимая лигнин пероксидаза. 72
- Классическая пероксидаза 72
- «Новые» пероксидазы. 74
II.4.5. Лакказа. 75
- Определение. 75
- История изучения. 76
- Распространение. 76
- Локализация. 78
- Строение лакказы. 78
- Каталитические свойства. 85
- Лигнинолитические свойства. 88
- Функции лакказы. 90
- Особенности экспрессии и идентификации. 92
II.4.6. Перекись-генерирующие ферменты. 93
- Глюкозо-оксидаза. 93
- Метанол-оксидаза. 95
- Глиоксаль-оксидаза. 96
- Арил-алкоголь оксидаза. 97
II.4.7. Редуктазы. 97
- Арил-алкоголь дегидрогеназа. 98
- Хинон-редуктаза. 98
- Целлобиозо-дегидрогеназа. 99
II.5. Неэнзиматические реакции при биодеградации лигнина. 99
II.6. Прикладное значение грибов белой гнили. 101
II.6.1. Обработка природных лигнин-содержащих материалов. 101
II.6.2. Разложение ксенобиотиков. 103
III. Методы и материалы. 106
III.1. Микроорганизмы. 106
III.2. Методы культивирования микроорганизмов. 106
III.3. Методы определения активности ферментов. ПО
III.4. Очистка ферментов. 111
III.5. Электрофорез и изоэлектрофокусировка. 112
III.6. Спектральные методы. 113
III.7. Высокоэффективная жидкостная хроматография. 114
III.8. Лигнинолитические реакции культур грибов и очищенных ферментов. 115
III.9. Биоремедиация почвы. 117
III.10 Идентификация продуктов разложения хлорфенолов. 117
III. 11. Аналитические методы. 117
III. 12. Материалы и реактивы. 118
IV. Результаты. 119
IV.1. Лигнинолитические свойства гриба Pan us tigrinus 8/18 при разных способах культивирования. 119
IV. 1.1. Скрининг лигнинолитических грибов. 119
IV.1.2. Стационарная погруженная культура Panus tigrinus 8/18. 120
IV.1.3. Твердофазная культура/ , tigrinus 8/18. 122
IV. 1.4. Определение ключевого лигнинолитического фермента. 123
IV.2. Новый способ погруженного культивирования Panus tigrinus 8/18. 127
IV.2.1. Индукция лигнинолитических ферментов. 128
IV.2.2. Подбор компонентов культуральной среды. 131
IV.2.3. Новые приемы культивирования. 132
IV.2.4. Варианты нового способа погруженного культивирования. 132
IV.3. Mn-зависимая лигнин пероксидаза Panus tigrinus 8/18. 135
IV.3.1. Физико-химические свойства очищенной МпЛП. 135
IV.3.2. Каталитический цикл. 138
IV.3.3. Лигнинолитические свойства. 142
IV.4. Лакказа Panus tigrinus 8/18 и феномен желтых лакказ. 144
IV.4.1. Общая характеристика. 144
IV.4.2. Спектральные свойства. 145
IV.4.3. Каталитические свойства. 146
IV.4.4. Множественные формы. 148
IV.4.5. Феномен желтых лакказ. 152
IV.4.6. Лигнинолитические свойства голубых и желтых лакказ. 160
IV.5. Прикладное значение лигнинолитических грибов и ферментов. 163
IV.5.1. Обработка лигнин-содержащих материалов. 163
IV.5.2. Разложение хлорфенолов грибами белой гнили. 165
V. Обсуждение результатов. 181
V.l. Лигнинолитические свойства Panus tigrinus 8/18 при разных способах культивирования. 181
V.2. Новый способ погруженного культивирования Panus tigrinus 8/18. 183
V.3. Mn-зависимая лигнин пероксидаза (МпЛП) P. tigrinus. 185
V.4. Лакказа P. tigrinus 8/18 и феномен желтых лакказ. 188
V.5. Прикладное значение лигнинолитических грибов и ферментов . 195
VI. Выводы. 201
VII. Список литературы 203
- Препараты лигнина
- Строение лакказы.
- Индукция лигнинолитических ферментов.
- Прикладное значение лигнинолитических грибов и ферментов
Препараты лигнина
Химия лигнина ведет свою историю с 30-х годов 19 века, поэтому к настоящему времени накопилось множество способов получения различных препаратов лигнина [Чудаков, 1961; Блажей, Шутый, 1977; Buswell and Odier, 1987; Wood and Kellog. 1988].
Общепринятой классификации препаратов лигнина нет, однако различают такие понятия как «протолигнин», «выделенный лигнин» и «синтетический лигнин».
Протолигнин. Протолигнином называют лигнин in situ - лигнин в составе растительной ткани, не претерпевший физических и химических изменений, в отличие от препаратов выделенных лигнинов [Блажей, Шутый, 1977]. Иногда протолигнин называют также природным, натуральным или интактным (например, [Obst and Kirk, 1988]), что вносит некоторую путаницу, т.к. известен препарат модифицированного выделенного лигнина под названием «нативный лигнин Браунса».
Выделенный лигнин. Препараты выделенных лигнинов можно классифицировать по способам извлечения из лигноцеллюлозы, по степени жесткости химического воздействия при выделении, по степени сходства с протолигнином. При любых способах выделения лигнина происходит нарушение его структуры и свойств. Выделенный лигнин имеет значительно меньшую ММ, чем протолигнин (10-80 кДа), часто содержит остатки полисахаридов клеточной стенки. низкомолекулярные фрагменты лигнина и лигнаны. Лигнин в препаратах, выделенных мягкой экстракцией органическими растворителями (диоксаном, этанолом и др.) или с использованием целлюлаз, - повреждается в наименьшей степени. Лигнин в препаратах, выделенных с применением жестких химических методов, обогащен фенольными и спиртовыми гидроксилами, а также карбокси-, карбонил- и метокси- группами. Модифицированные лигнины, образующиеся в качестве отходов производства, называют техническими. Наиболее известные препараты лигнина представлены в таблице 2. Наиболее похожи на протолигнин -MWL и целлюлазный лигнины, однако и они содержат больше фенольных структур, чем протолигнин [Ikeda et al., 2002].
Синтетический лигнин. Получают in vitro полимеризацией синтетических монолигнолов лакказой или пероксидазой. Распространенное название - DHP-лигнин («дегидрополимеризат» от «dehydrogenative polymerizate»). ММ ниже, чем у протолигнина (от 1,5-1,6 до 10 кДа), однако препарат содержит характерные межмономерные связи и не загрязнен полисахаридами или низкомолекулярными фрагментами. Такие препараты удобны тем, что могут быть приготовлены с С-меткой в метокси-группах, боковой пропильной цепи или в ароматическом кольце [Kirk et al., 1975]. Из-за отсутствия стандартизированных протоколов синтеза DHP-лигнина, трудно сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях [Kirk et al., 1975; Buswell and Odier, 1987; Eriksson et al, 1990].
Несмотря на регулярно появляющиеся публикации об анаэробном разложении лигнина бактериями, грибами или сообществами микроорганизмов [Benner et al, 1984; Benner and Hodson, 1985; Colberg and Young, 1985a; Ziomek and Williams, 1989; Bernard-Valhe et al., 1995], следует признать, что незначительные изменения в структуре препаратов лигнина, возникающие за время многомесячных экспериментов, происходят вследствие абиогенных процессов или присутствия в препаратах лигнина нелигниновых соединений [Kirk and Farrell, 1987].
Сообщения об анаэробном разложении лигнина кишечной микрофлорой почвенных беспозвоночных, термитов или травоядных животных [Butler and Buckerfield, 1979; Pasty et al, 1990; McSweeney et al, 1994; Varma et al, 1994], также требуют более надежного изучения.
В других случаях имеет место солюбилизация лигнино-углеводного комплекса, из-за анаэробного разложения полисахаридов лигноцеллюлозы [Joblin and Naylor, 1989; McSweeney et al, 1994], или же речь идет об утилизации сравнительно легко разложимых моно- и олигомерных фрагментов лигнина с ММ 0,3 кДа [Colberg and Young, 1985b; Chen et al, 1985; Kirk and Shimada, 1985; Frazer and Young, 1986].
Устойчивостью лигнина к микробному разложению в анаэробных условиях объясняется формирование угольных депозитов Земли [Kirk and Shimada, 1985].
Строение лакказы.
Общее строение. Общее строение растительных и грибных лакказ сходно. Это внеклеточный гликопротеин; полипептидная цепь содержит около 500 аминокислотных остатков; ММ растительных лакказ 90-140 кДа, грибных 60-80 кДа (разница в ММ растительных и грибных ферментов - из-за разной степени гликозилирования). Одиннадцать аминокислот участвующих в связывании меди (один цистеин и десять гистидинов) консервативны у всех лакказ; консервативны также небольшие последовательности в четырех регионах, определяющих микроокружение атомов меди [Thurston, 1994]. К настоящему времени аминокислотные последовательности определены у единственной растительной лакказы A. pseudoplatanum [LaFayette et al., 1995], четырех лакказ аскомицетов: N. crassa [Germann and Lerch, 1986; Germann el al., 1988], A. nidulans [Aramayo and Timberlake, 1990], Metheliophthora thermophila [Xu, 1996; Berka et al., 1997] и Scytalidium thermophilum [Xu, 1996], дрожжевого гриба С. parasitica [Choi et al., 1992] и девяти лакказ грибов белой гнили: Coriolus hirsutus [Kojima et al., 1990], P. radiata [Saloheimo et al., 1991], С versicolor [limura et al., 1992; Jonsson et al., 1995; Mikuni and Morohoshi, 1997], изолят PM1 [Coll et al., 1993a], A. bisporus [Perry et al, 1993b], Trametes villosa [Yaver et al, 1996], Polyporuspinsitus, Rhisoctonia solani [Xu, 1996], L. edodes [Zhao and Kwan, 1999].
Аминокислотная последовательность растительной лакказы А. pseudoplatanum имела лишь 28% гомологии с лакказами грибов N. crassa и A. bisporus, причем большинство консервативных аминокислот относятся к участкам связывания атомов меди [LaFayette et al., 1995]. Сопоставление аминокислотных последовательностей лакказ грибов разных классов позволило разделить их на разные семейства со столь низким сходством, что это дало основание предполагать отсутствие единого эволюционного предшественника [Coll et al, 1993а, b; Perry et al., 1993b; Thurston, 1994]. Моделирование третичных структур разных лакказ показало, что все они состояли из трех / -спиральных доменов. Это совпадает с кристаллографическими данными для лакказы гриба Coprinus cinereus и субъединицы аскорбат оксидазы. Таким образом, лакказы, аскорбат оксидазы и, видимо, другие голубые оксидазы, при низкой гомологии первичных последовательностей обладают сходной трехмерной архитектурой [Messerschmidt and Huber, 1990; Perry et al., 1993b; Ducros et al, 1998].
Состав и строение углеводных компонентов лакказы. Типичные грибные лакказы содержат 10-25% углеводов, растительные - 25-45% [Mayer and Harel, 1979; Reinhammar, 1984]. Обычно, и у грибных, и у растительных лакказ преобладает TV-тип гликозилирования [Kurtz and Champe, 1982; Sterjiades et al., 1992; Coll el al., 1993a; LaFayette, et al., 1995]; у лакказы базидиомицетаЛ. bisporus было примерно равное количество N- и (9-связанных углеводов [Perry et al., 1993а].
В составе углеводной части лакказ преобладают /У-ацетил-глюкозамин, глюкоза, манноза, галактоза. У растительных лакказ чаще встречаются арабиноза, фукоза, ксилоза [Mayer and Harel, 1979; Sterjiades et al., 1992]. У лакказы гриба Pycnoporus cinnabarinus на долю маннозы приходилось более 70% состава углеводной части [Eggert et al, 1996а]. Единственный пример изучения структуры углеводов известен для лакказы сикоморы [Takanashi etal., 1986]: гликановые компоненты представляли собой набор TV-связанных олигосахаридов би-антенного типа с одинаковой структурной единицей внутреннего кора, обогащенной ксилозой.
Функциональное назначение углеводной части лакказ обсуждается в плане защиты от протеолиза и термоинактивации [Yoshitake etal., 1993; Slomczynski, et al., 1995; Bilal and Thurston, 1996].
Строение активного центра и редокс-потенциал лакказы. В активном центре локализованы четыре атома меди, организованные в металлоцентры трех типов (Т1-3). Все атомы меди имеют степень окисления 2+ и участвуют в каталитическом процессе. Металлоцентры ТІ и Т2 содержат по одному атому меди, ТЗ - два. Т2 и ТЗ-центры стерически сближены и образуют единый кластер, ТІ отстоит от этой структуры на 12-13 А. От поверхности молекулы фермента к ТІ-центру ведет субстратный канал, аминокислотные остатки которого обеспечивают связывание редуцирующих субстратов и перенос электрона на ТІ атом меди. Предполагается, что аминокислотные остатки, ответственные за связывание субстрата, варьируют у разных лакказ, что определяет разнообразие их каталитических свойств [Хи, 1996; Хи et al., 1998]. К Т2/ТЗ кластеру ведут каналы для доступа кислорода и освобождения молекул воды. Металлоцентры определяют характерные спектральные свойства лакказ: максимум в области 600 нм (ТІ) и плечо при 330 нм (ТЗ) в спектрах поглощения и специфический ЭПР-спектр (Т1+Т2) [Malkin and Malmstrom, 1970; Solomon and Lowery, 1993; Malmstrom, 1994; Reinhammar, 1984; Messerschmidt et al., 1992a; Messerschmidt, 1997].
Атом меди ТІ («синий» металлоцентр) связан двумя остатками гистидина и одним - цистеина у всех лакказ. У лакказ растений и аскомицетов, ТІ-сайт включает дополнительно остаток метионина в качестве аксиального лиганда. Этим объясняется разница в редокс-потенциалах (Е ) лакказ растений и аскомицетов (394 mV) и лакказ базидиомицетов (785 mV) [Messerschmidt and Huber, 1990; Thurston, 1994; Call and Miike, 1997; Xu el al., 1999b]. Коэффициент молярной экстинкции Tl-центра (єбю = 4000-6000 М" см" ) на два порядка выше, чем у других комплексов меди. Это объясняется тем, что геометрия лигандной сферы ТІ-центра сильно искажена «давлением» белка. Функциональное назначение ТІ-центра лакказы -захват электрона у окисляемого субстрата и перенос его на Т2/ТЗ сайт восстановления кислорода [Malkin and Malmstrom, 1970; Reinhammar, 1984; Malmstrom, 1994]. Специфическое строение ТІ-центра определяет ярко-синий цвет концентрированного препарата лакказы, наличие «синего» максимума при 595-615 нм в спектре поглощения и необычно низкие константу сверхтонкого расщепления и величину g-фактора в ЭПР-спектре. Кроме лакказ и других голубых оксидаз, Т1-центр имеется у малых голубых белков, - пластоцианинов, азуринов и др., -компонентов электронно-транспортных цепей растений и бактерий, у бактериальных нитрит-редуктаз.
Атом меди Т2 («несиний» или «нормальный» металлоцентр) координирован двумя остатками гистидина у всех лакказ. Тетрагональная структура этого центра не искажена и аналогична низкомолекулярным комплексам Си"+. Такие комплексы имеют значения s не выше 100 М" см" , поэтому Т2-центр не проявляется в спектре поглощения лакказы. Но типичный ЭПР-сигнал Т2-центра вносит свой вклад в формирование ЭПР-спектра лакказы. Характерная особенность Т2 Си + - сильное сродство к анионным ингибиторам - N3", CN", F". Вероятно, это свойство - следствие одной из функций Т2 центра: кроме переноса электрона от ТІ к ТЗ, Т2 Си стабилизирует анионный интермедиат при восстановлении кислорода Т2/ТЗ кластером. Атом меди Т2 центра лакказы относительно легко удаляется, так что может быть потерян при очистке фермента [Thurston, 1994]. При удалении Т2 меди синий цвет ферментного препарата сохраняется, активность лакказы падает на 95% [Malkin et al., 1969; Meadows є/я/.,1991]. Кроме голубых оксидаз, Т2-центры содержат галактозо-оксидаза, супероксид дисмутаза, дофамин /?-монооксигеназы, фенилаланин гидроксилаза [Malkin and Malmstrom, 1970; Solomon and Lowery, 1993].
Два атома меди ТЗ центра («ЭПР-невидимый» металлоцентр) координированы шестью остатками гистидина и связаны между собой гидроксильным мостиком. Отсутствие ЭПР-сигнала у ТЗ объясняют сильным антиферромагнитным сопряжением электронов двух атомов меди. С наличием ТЗ-центра ассоциируют плечо при 330 нм в спектре поглощения лакказ. Назначение ТЗ центра - прием двух электронов от ТІ и Т2 центров и связывание пероксидного интермедиата при восстановлении кислорода. [Malkin and Malmstrom, 1970; Reinhammar, 1984; Solomon and Lowery, 1993]. Кроме лакказ и других голубых оксидаз, ТЗ-центры известны у гемоцианина и тирозиназы.
Формальная организация Т2 и ТЗ центров лакказы аналогична другим медьсодержащим белкам. Но стерическая сближенность отдельных центров в единый кластер привела к изменению их геометрии и электронной структуры. Это определило изменение биологической функции фермента в целом: в отличие от других ТЗ-содержащих белков, также способных связывать СЬ, лакказа (и другие голубые оксидазы) катализирует полное восстановление молекулярного кислорода до воды [Allendorf etal., 1985; Solomon and Lowery, 1993].
Множественные формы. Грибы могут продуцировать одну форму лакказы [Froehner and Eriksson, 1974b; Oda et al., 1991; Eggert el al., 1996a] или семейство изоферментов. Наличие более одного структурного гена лакказы обнаружено у базидиомицетов С. hirsutus [Kojima et al., 1990], Л. bisporus [Репу etal., 19936] и Т. villosa (до пяти разных генов) [Yaver et al., 1996]. Изучение молекулярных свойств и особенностей экспрессии позволило предположить, что продуктами разных генов являются также две формы лакказ Armillaria mellea [Rehman and Thurston, 1992; Bilal and Thurston, 1996], C. parasitica [Rigling and Alfen, 1993] и три формы лакказы Т. versicolor [Yaver et al., 1996].
Для лакказ характерно, также, образование множественных форм вследствие разной степени гликозилирования или пост-трансляционного протеолитического или гликолитического тримминга [Sterjiades etal., 1992; Rigling and Alfen, 1993; Thurston, 1994]. Насчитывают по две-три [Jonsson etal., 1968; Ко et al., 2001], четыре-пять [Lobos et al, 1994], шесть [Элисашвили с сотр. 1992], семь [Mansur el al., 1997], или десять [Sariaslani, 1989] таких форм.
Индукция лигнинолитических ферментов.
Основываясь на сообщениях о способности препаратов полимерного лигнина повышать выход лигнин пероксидазы, конститутивно экспрессирующейся у грибов при вторичном метаболизме, мы проверили их влияние на активность лигнинолитических ферментов P. tigrinus 8/18. Как следует из рисунка 20 и таблицы 10, повышение активности МпЛП было тем больше, чем выше содержание высокополимерной фракции в препаратах лигнина. При этом корреляции выхода лакказы с соотношением высоко- и низкомолекулярных фракций препаратов лигнина не обнаружено.
В качестве потенциальных индукторов были проверены также более 30 низкомолекулярных соединений (Табл. 11). Ни одно из них не индуцировало лигнин пероксидазу. Среди них были обнаружены специфические индукторы для МпЛП (2-, 3- и 4-метилбензиловый спирт, 3-метоксибензальдегид) и для лакказы (2,4- и 2,6-диметоксифенол), а также вызывающие экспрессию обоих ферментов (анисовый спирт, 3,4-диметокси-З-фенилпропеновая кислота). Одновременное внесение индукторов, специфичных для МпЛП и лакказы, повышало выход обоих ферментов. Вопреки общепринятым представлениям, впервые были найдены нефенольные индукторы лакказы: анисовый спирт, вератровая кислота и др. Циклогексимид, в низких концентрациях (1-2 мкМ) индуцирующий лакказу у аскомицетов [Grotewold et al., 1988], был неэффективен в культурах P. tigrinus 8/18, включая нелимитированные по азоту. Сирингальдазин, мальт-экстракт и таниновая кислота, часто используемые для продуцирования лакказы другими грибами [Bilal and Thurston, 1996; Koroljova-Skorobogat ko et al., 1998], были неэффективны или давали незначительную индукцию лакказы и МпЛП.
Повышение концентрации меди до 0,5-2,0 мМ вызывало слабую индукцию лакказы, однако наибольший эффект достигался при одновременном внесении меди и специфического индуктора.
Наиболее эффективные индукторы обеспечивали выход ферментов в погруженной культуре выше, чем в твердофазной (Рис. 21).
Разные индукторы давали разные наборы и соотношения множественных форм МпЛП и лакказы P. tigrinus 8/18. Использование синтетических индукторов, позволяло получать в погруженной культуре большее разнообразие форм ферментов, чем в твердофазной культуре, имитирующей природные условия (Рис. 22).
Эффективность различных компонентов культуральной среды оценивали выходу МпЛП в сравнении с условиями стандартной стационарной погруженной культуры без индукторов.
Источник углерода. В качестве источников углерода сравнивали глюкозу, рамнозу, маннозу, арабинозу, галактозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу, целлобиозу, лактозу и глицерин, все в концентрации 1% (вес/объем). Большинство проверенных соединений давали такой же выход МпЛП как глюкоза (140 усл. Ед.) или ниже. Только манноза и мальтоза увеличивали выход фермента, соответственно, в 2 и 4 раза.
Буфер. При подборе буферной системы в качестве контроля использовали 20 мМ Na-диметилсукцинатный буфер, рН 4,5. Все другие буферные растворы также имели 20 мМ концентрацию и титровались NaOH до рН 4,5-4,8. Цитратный, ацетатный, формиатный и тиобарбитуратный буферы подавляли активность МпЛП в 2-4 раза по сравнению с контролем. Сукцинатный, пиромелатный, барбитуратный, лг-фталатный и полиакрилатный давали выход МпЛП 0,9-1,4 раза от контрольного. Тартратный и о-фталатный буферы увеличивали выход фермента в 2 раза.
Прикладное значение лигнинолитических грибов и ферментов
Для делигнификации растительного волокна мы использовали как грубый ферментный препарат погруженной культуры P. tigrinus, так и очищенные ферменты P. tigrinus и С. versicolor. Преимущество применения грубого ферментного препарата в дешевизне препарата, простоте процедуры и комплексном воздействии на лигноцеллюлозу разных лигнинолитических ферментов. Эффект последнего преимущества, правда, снижен: использование высоких концентраций марганца нежелательно из-за возможного выпадения в осадок двуокиси марганца, поэтому потенциал МпЛП в таких условиях не был полностью реализован. По этой же причине неудобно использовать и очищенные МпП и МпЛП. В литературе описаны примеры практического использования различных пероксидаз в лабораторных условиях [Lobarzewski et al., 1982; Kondo et ah, 1994b; Reid, and Paice, 1998], однако, коммерческие фирмы, разрабатывающие соответствующие технологии, также предпочитают лакказу Mn-пероксидазе: в промышленных условиях обеспечение точной дозировки всех компонентов реакции слишком дорого [Call and Miicke, 1997].
При делигнификации джутового волокна, кроме отбеливания материала, необходимо было сохранить его механическую прочность. Особенность строения лигноцеллюлозы джута, допускала лишь ограниченное удаление лигнина. Микрофибриллы целлюлозы джута значительно короче, чем у целлюлозы обычной древесины, и перемежаются с фрагментами лигнина. Поэтому глубокая делигнификация приводила к потере механической устойчивости волокна. Подобранные нами условия (45% делигнификации) позволили решить обе задачи.
При делигнификации льняного волокна комбинирование обработки материала системой лакказа/медиатор с вымыванием фрагментов разрушенного лигнина слабым раствором щелочи позволило нам в 100 раз снизить расход фермента и одновременно достичь 70% удаления лигнина в суровом волокне и до 75% - в предобработанном (Табл. 24, 25). При отбеливании предобработанной бумажной массы с использованием коммерческой технологии, использующей систему лакказа/медиатор, сотрудники фирмы Wacker (Германия) достигали не более 70% делигнификации при использования медиатора 1-гидрокси-бензотриазола, более эффективного, чем АБТС [Call and Miicke, 1995, 1997; Amann, 1997].
Хлорфенолы - один из наиболее токсичных и широко распространенных классов ксенобиотиков, такие их представители как 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ), 2,4,5- и 2,4,6-трихлорфенолы (ТХФ) и пентахлорфенол (ПХФ) входят в число т.н. «приоритетных» загрязнителей окружающей среды. Основные источники хлорфенолов - промышленное производство биоцидов и сточные воды бумажного производства. Например, 2,4-ДХФ и 2,4,5-ТХФ являются предшественниками при синтезе гербицидов, 2,4,6-ТХФ и ПХФ используются непосредственно как гербициды, а также для антимикробной пропитки древесины [Freiter, 1979; Rappe, 1980; Sittig, 1981].
Биодеградация хлорфенолов бактериями изучена довольно подробно (см., например, [Golovleva eta!., 1993, 1994; Zaitsev etal., 1995]). Возможности грибов в этом отношении изучены значительно хуже, не смотря на то, что лигнинолитические базидиомицеты известны своей способностью разлагать широкий спектр различных ксенобиотиков. Биодеградация отдельных хлорфенолов изучена преимущественно на примере P. chrysosporium. Этот гриб является термофилом (оптимальная температура для роста 37 С), и практическое применение этого микроорганизма для биоремедиации различных сред ограничено соответствующими климатическими зонами. Поэтому, для изучения биодеградации хлорфенолов и разработки подходов для прикладного использования грибов, мы использовали P. tigrinus и С. versicolor, растущие в умеренном климате.
По результатам оценки токсичности 13-ти изомеров хлорфенолов (ХФ) в качестве основного объекта исследования выбрали 2,4,6-ТХФ. Известные закономерности (возрастание токсичности ХФ с увеличением числа хлор-заместителей, большая токсичность л/еяш-замещенных ХФ, чем орто- и пара-изомеров [Dec and Bollag, 1990; Kadhim etal., 1999]) в целом выполнялись для обоих грибов. Правда, для P. tigrinus токсичность 2,3-, 3,4- и 2,4-, 2,5- и 2,6-ДХФ была одинаковой (Рис. 52). Повышенная устойчивость С. versicolor к ПХФ совпадала с данными других авторов [Alleman et ah, 1992]. Результаты оценки токсичности в агаризованных средах соответствовали данным, полученным для погруженных культур грибов: P. tigrinus был более устойчив к 2,4,6-ТХФ в области концентраций 15-25 мг/л.
Разные схемы внесения хлорфенола испытывали для подбора условий, позволяющих использовать возможно более высокие концентрации хлорфенола при возможно меньшем токсическом эффекте. Это давало возможность выделять минорные продукты трансформации ХФ. Подобранная нами схема, - внесение токсиканта на 5-е сутки роста культуры, после накопления основного количества биомассы, была сходной с известными подходами в литературе: внесение токсиканта после формирования мицелиального мата [Mileski et ah, 1988], или выражение эффективной концентрации хлорфенола как отношение массы токсиканта к массе мицелия, вместо концентрации раствора хлорфенола [Alleman et al, 1992].
При разложении различных классов ксенобиотиков, лигнинолитические грибы используют разные ферментные системы, в том числе и не имеющие отношения к разложению лигнина [Cameron et al., 2000]. В наших экспериментах, скорость убыли 2,4,6-ТХФ была выше в азот-лимитированных культурах P. tigrinus и С. versicolor, что означало участие лигнинолитических ферментов (Рис. 53А, Б). Неожиданным результатом оказалось использование разными грибами разных ферментов для разложения хлорфенола: внесение токсиканта подавляло активность лакказы в культуре P. tigrinus и не сказывалось на активности лакказ у С. versicolor. Активность МпЛП P. tigrinus в этих условиях возрастала, а активность МпП С. versicolor - падала (Рис. 54). Следует отметить, что очищенные лакказы и пероксидазы обоих грибов были одинаково способны трансформировать 2,4,6-ТХФ.
Анализ продуктов разложения 2,4,6-ТХФ культурами грибов и очищенными ферментами, включая иммобилизованные лакказы, позволил нам предложить схему превращения этого ксенобиотика изученными грибами (Рис. 55). Первичными продуктами окисления 2,4,6-ТХФ (I) МпЛП (в культуре P. tigrinus) или лакказой (в культуре С. versicolor) были 2,6-дихлорбензохинон (II), 2,6-дихлоргидрохинон (III) и 3,5-дихлоркатехол (IV). 3,5-Дихлоркатехол при окислении 2,4,6-ТХФ был обнаружен нами впервые. Такой набор продуктов свидетельствовал о прохождении как пара-, так и о/?то-дегалогенирования. Этот факт подтверждался, также, обнаружением в олигомерном продукте (V) менее двух атомов хлора на каждое ароматическое кольцо. 2,6-Дихлорбензохинон окислялся далее до тригидрокси-производного (VII). Метилированные производные продуктов (III) и (VII) находили только в культурах грибов, и никогда- в реакционных смесях очищенных ферментов. Это предполагает участие в трансформации 2,4,6-ТХФ грибами также и метилтрансфераз. Эти ферменты могут регулировать направление процесса трансформации хлорфенолов в сторону полимеризации, или в сторону минерализации: метилирование реакционно-способных фенолов блокирует возможность их полимеризации [Joshi and Gold, 1993].
Разложение 2,4,6-ТХФ было изучено ранее на примере P. chrysosporium [Reddy et al., 1998]. В культуре этого гриба внеклеточные лигнин пероксидаза и Мп-пероксидаза окисляли 2,4,6-ТХФ до продуктов (II) и (III). Дальнейшее дехлорирование в ортяо-положениях происходило при восстановительном дегалогенировании внутриклеточно. Обнаружение нами внеклеточного 3,5-дихлоркатехола (IV) показало возможность по меньшей мере одного окислительного о/шо-дегалогенирования 2,4,6-ТХФ внеклеточными оксидоредуктазами. А формирование ароматического полимера, не содержащего хлора, при разложении 2,4,6-ТХФ адаптированной культурой P. tigrinus, свидетельствовало о возможности полного дегалогенирования трихлорфенола до раскрытия ароматического кольца.
Анализ литературных источников показал, что при использовании грибов для разложения различных хлорфенолов, их концентрация обычно не превышала 50 мг/л [Alleman et al, 1992; Joshi and Gold, 1993; Armenante et al., 1994; Reddy et al. 1998; Kadhim et al., 1999; Ullah et al, 2000]. Между тем, при разложении хлорфенолов бактериями, использовали значительно более высокие концентрации даже наиболее токсичных полихлорфенолов, таких как 2,4,6-ТХФ (400 мг/л, Streptomyces rochei [Golovleva et al., 1993]) или ПХФ (300 мг/л, Flavobacterium sp., [O Reilly and Crawford 1989]). Применение бактерий для таких целей основано на предварительной подготовке штаммов, повышающей их устойчивость к высоким концентрациям ксенобиотиков: долговременное культивирование при селективном давлении ксенобиотика, иммобилизация клеток, генетические манипуляции и т.п. [O Reilly and Crawford 1989; Gorlatov et al, 1989; Golovleva et al, 1993; Zaitsev et al. 1995]. Применение же грибов использует только высокий окислительный потенциал и неспецифичность лигнинолитических ферментов [Field et а1,\99Ъ; Cameron et al, 2000; Pointing, 2001]. Это было причиной для проверки возможности адаптации грибной культуры к высоким концентрациям хлорфенолов. Как видно из представленных данных, нам удалось адаптировать культуру P. tigrinus к высоким концентрациям хлорфенолов (до 2000 мг/л 2,4,6-ТХФ), включая смесь трех разных изомеров (Рис. 56, 57). У P. chrysosporium периферический путь катаболизма 2,4-ДХФ отличался от пути разложения 2,4,6-ТХФ и ПХФ [Valli and Gold, 1991; Reddy et al, 1998; Reddy and Gold, 2000]. Использование смеси таких хлорфенолов должно было усложнить условия их разложения грибом, т.к. кроме обеспечения резистентности к высоким концентрациям токсикантов, необходимо было активизировать разные метаболические пути. Разложение высоких концентраций хлорфенолов P. tigrinus имело свои особенности. В качестве защитной меры гриб продуцировал значительное количество внеклеточных полисахаридов, связывающих хлорфенолы. Вероятно, это было направлено на снижение концентрации растворенного токсиканта. Кроме того, при концентрациях хлорфенолов выше 300 мг/л, активность МпЛП, ответственной за первичное окисление, подавлялась (Рис. 60), а продукция внеклеточной Н2Ог возрастала. Так как среда содержала соли переходных металлов, в присутствие Н2О2 должны были продуцироваться активированные формы кислорода в ходе незнзиматических реакций типа реакций Фентона или Хабера-Вайсса. Мы предполагаем, что в присутствии предельных концентраций токсикантов, грибная культура включает особый защитный механизм: продуцирование жесткого и неспецифичного оксиданта, например, гидроксильного радикала ОН.
Адаптация гриба к разложению высоких концентраций хлорфенолов была проведена нами впервые. Максимальная концентрация ПХФ, при которой выживала культура P. chrysosporium, была 500 мг/л, при выращивании на богатой среде. При использовании N-лимитированной среды, как в наших условиях, эта концентрация была летальной [Mileski et al., 1988]. Разложение высоких концентраций хлорфенолов адаптированной культурой P. tigrinus было масштабировано в 72-л биореакторе. Это делает возможным применение метода для биоремедиации водных сред, загрязненный хлорфенолами.