Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Общая характеристика микромицетов рода Rhizoctonia 11
1.1.1. Характеристика Rhizoctonia solani 11
1.1.2. Способность грибов рода Rhizoctonia к синтезу биологически
активных веществ 13
1.2. Лектины микроскопических грибов 15
1.2.1. Структурная характеристика и классификация 17
1.2.2. Физико-химические свойства 22
1.2.3. Биологические функции 27
1.2.4. Биологическая активность 30
1.3. Заключение 34
Экспериментальная часть 36
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1. Объекты исследования 36
2.2. Состав сред для культивирования микроорганизмов 36
2.3. Культивирование и идентификация микромицетов 37
2.4. Молекулярно-генетический анализ микромицетов: выделение ДНК,
ПЦР-амплификация 37
2.5. Определение содержания лектинов в микроорганизмах 38
2.6. Определение содержания белка 39
2.7. Определение активности лектинов 39
2.8. Получение нативных и модифицированных эритроцитов 40
2.9. Хроматографическая очистка лектина 40
2.10. Определение молекулярной массы лектина 41
2.11. Определение первичной структуры лектина 43
2.12. Определение значений рН и температуры (активность и стабильность) лектина 43
2.13. Определение влияния ионов металлов и ЭДТА на активность лектина 44
2.14. Определение углеводной специфичности лектинов 45
2.15. Определение мутагенной активности лектинов (тест Эймса) 45
2.16. Влияние лектина на рост и развитие различных микроорганизмов 46
2.17. Влияние лектина на рост и развитие культур клеток в условиях in vitro 47
2.18. Определение трансмембранного потенциала митохондрий культур клеток в условиях in vitro 48
2.19. Статистическая обработка данных 49
ГЛАВА 3. Результаты исследований 50
3.1. Скрининг микромицетов по способности к синтезу лектинов 50
3.2. Молекулярно-генетическая характеристика изолята микромицета,
синтезирующего наиболее активные лектины. ПЦР-амплификация и секвенирование области ITS1-5.8SrDNA-ITS2 52
3.3. Динамика образования лектинов в зависимости от роста микромицета Rhizoctonia solani 53
3.4. Подбор оптимальной среды культивирования микромицета для повышения процесса образования лектинов 55
3.5. Выделение и очистка лектина микромицета Rhizoctonia solani 60
3.6. Определение степени чистоты и структуры лектина 65
3.7. Исследование некоторых физико-химических и мутагенных свойств лектина Rhizoctonia solani
3.7.1. Специфичность лектина относительно взаимодействия с различными сахарами 71
3.7.2. Температурный оптимум и диапазон стабильности лектина 73
3.7.3. рН-оптимум и диапазон стабильности лектина 74
3.7.4. Влияние ионов металлов на активность лектина 76
3.7.5. Мутагенная активность лектина 78
3.8. Влияние лектина R. solani на рост и развитие условно-патогенных и патогенных бактерий 81
3.9. Влияние лектина R. solani на различные линии опухолевых и нормальных клеток в условиях in vitro 90
3.9.1. Влияние лектина R. solani на индукцию апоптоза в клеточных линиях рака человека 95
Обсуждение результатов 99
Выводы 110
Список литературы 1
- Характеристика Rhizoctonia solani
- Состав сред для культивирования микроорганизмов
- Определение мутагенной активности лектинов (тест Эймса)
- Специфичность лектина относительно взаимодействия с различными сахарами
Характеристика Rhizoctonia solani
Лектины - это группа белков, обладающих способностью к избирательному и обратимому связыванию сахаров, не изменяя их химической структуры [Boyd, Shapleigh, 1954]. Однако, в последние годы, наиболее приемлемой формулировкой лектинов, отражающей их особенности, является формулировка Коцоурека и Хордкейши [Kocourek, Horejsi, 1983]: Лeктины - это бeлки нeиммуноглобулинового происхождения, обладающие способностью к высокоспецифическому распознаванию и обратимому связыванию с гликозильными остатками сахаров различной природы, не вызывая изменения их ковалентной структуры. К таким углевод - связывающим белкам относят некоторые токсические моновалентные, поливалентные протеины, гликозилтрансферазы, гликозидазы (ферменты углеводного обмена, имеющие независимые от каталитического центра участки связывания углеводов), отдельные гормоны, которые обладают способностью к агглютинации клеток и/или преципитации полисахаридов или гликоконъюгатов.
Лектины широко распространены в различных организмах. Они найдены в растениях, животных, бактериях, грибах, вирусах. Обнаружены лектины и в составе микромицетов. Лектины присутствуют в мицелии таких микроскопических грибов, как Penicillium corylophilum, Penicillium purpurogenum, Penicillium expansum [Singh et al., 2013], Penicillium griseofulvum, Penicillium thomii [Singh et al., 2009], Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, Aspergillus nidulans [Singh et al., 2008], Aspergillus fumigates [Houser et al., 2013], Rhizoctonia crocorum, Athelia rolfsii [Kellens et al., 1989], Trichoderma harzianum, Trichoderma viride [Neethling, Nevalainen, 1996], Fusarium solani [Khan et al., 2007], Rhizoctonia bataticola [Nagre et al., 2007]. Кроме мицелия, лектины микромицетов были выделены также из конидий [Khan, Khan, 2011], а также из склероций некоторых штаммов Rhizoctonia solani [Kellens, Peumans, 1990; Hamshou et al., 2007]. Причем количество лектина в склероциях у данных штаммов было выше, чем в мицелии [Hamshou et al., 2007].
Некоторые штаммы микромицетов способны к синтезу внеклеточных лектинов. Способность выделять лектины в культуральную жидкость показана для таких микромицетов, как Phytophthora parasitica [Larroque et al., 2011], Trichoderma viride [Neethling, Nevalainen, 1996], Sclerotium rolfsii [Inbar, Chet, 1994], Macrophomina phaseolina [Bhowal et al., 2005] и Arthrobotrys oligospora [Rosen, 1992]. Однако для большинства микромицетов характерно присутствие наиболее активных лектинов в их мицелии.
Большинство лектинов микромицетов, полученных в настоящее время, являются классическими лектинами, содержащими различные углевод-связывающие модули (СВМ, carbohydrate binding module) и структуры «-трилистник», «-сэндвич» (галектин и Ig типы лектинов) или LysM домены [Varrot et al., 2013; Gallegos et al., 2014].
В связи с этим лектины микромицетов были дополнительно разделены на несколько структурных семейств с учетом их функций [Gallegos et al., 2014]:
1. Семейство -propeller - подобных лектинов. Бета-пропеллер - это структура с тороидальными складками (тороидально расположенными бета-листами) в форме «лезвий», в которых повторяется четыре закрученных -меандры, расположенные по кругу и в слегка наклоненном положении. Примером такого белка является лектин гриба Aleuria aurantiа (AAL) [Wimmerova et al., 2003]. Почти аналогичную структуру белка имеет лектин AFL из микромицета Aspergillus fumigatus [Varrot et al., 2013; Houser, 2014]. Оба лектина, как AAL, так и AFL являются димерными, фукозо-связывающими лектинами, однако AFL имеет шесть функциональных потенциальных фукозо-специфических сайтов, расположенных между двумя листами, а AAL - только пять. Потенциальными белками этого семейства являются лектины Aspergillus oryzae, Penicillium chrysogenum, Trichoderma spp., Metarhizium anisopliae, а также лектин микромицета Trichoderma atroviride, имеющий 7--propeller складчатую структуру [Houser, 2014].
2. Семейство актино-подобных лектинов. Актинопорины являются сильнодействующими эукариотическими токсинами с молекулярной массой около 20 кДа, которые специфично распознают и оказывают мембранотропное действие на сфингомиелинсодержащие мембраны, образуя в них ионные поры. Они структурно похожи на представителей семейства лектинов грибов, которые связывают клеточную поверхность и имеющих на поверхности Thomsen -Friedenreich антиген (Т-антиген). Примером таких углевод-связывающих белков являются лектины грибов Sclerotium rolfsii (SRL), Agaricus bisporus (ABL), Boletus edulis (BEL), Xerocomus chrysenteron (XCL). Потенциальным членом данного семейства является агглютинин микромицета Arthrobotrys oligospora [Houser, 2014]. Структурно лектины грибов Sclerotium rolfsii (SRL) и Agaricus bisporus (ABL), как представители актино-подобных белков, представляют собой «-сэндвич» из двух бета-листов, состоящих из шести или четырех -витков, соединенные между собой с помощью мотива «спираль-петля-спираль» (HLH). Эти лектины имеют димерное или тетрамерное структуру белка с двумя различными сайтами связывания [Carrizo et al., 2005; Leonidas et al., 2007].
3. Семейство циановирин-подобных лектинов. Несколько лектинов грибов гомологичны небольшому углевод-связывающему белку под названием циановирин-N (CVNH). Данный белок является лектином цианобактерии Nostoc ellipsosporum с молекулярной массой 11 кДа (имеет всего 101 аминокислоту в своей молекуле), обладающим противовирусным действием. Лектины данного семейства являются мономерными белками и в основном относятся к типу 1 CVNH с одной копией циановерина-N, однако, например, лектин GzCVNH из гриба Gibberella zeae (аноморф микромицета Fusarium graminearum), последовательность которого имеет 30% идентичность с CVNH, состоит из двух тандемных CVNH повторов, связанных через двухкратную псевдосимметрию доменов А и В [Matei et al., 2011]. Связывание углевода может происходить в обоих доменах, но часто только один сайт связывания является функциональным в структуре данных белков. К данному семейству также относятся лектины грибов Tuber borchii (TbCVNH) и Neurospora crassa (NcCVNH). Потенциальными членами данного семейства является лектины микромицетов Trichoderma spp., Aspergillus niger, Metarhizium anisopliae, Byssochlamis spectabilis [Houser, 2014].
4. Семейство лектинов, содержащие «-трилистник» (trefoil) - подобные домены. Это семейство белков с гантель-подобной структурой, в которой отсутствуют альфа-спирали или бета-листы и где отдельные лепестки содержат субдомены (их три- a, b, g), способные связывать олигосахариды. К ним относятся лектины различных грибов, таких как Laetiporus sulphureus (LSL), Marasmius oreades (MOA), Polyporus squamosus (PSL), Clitocybe nebularis (CNL), Coprinopsis cinerea (CCL2), Boletus edulis (BEL), Sclerotinia sclerotiorum (SSA). Потенциальным членом этого семейства является лектин микромицета Rhizoctonia solani [Houser, 2014]. При этом лектины грибов Sclerotinia sclerotiorum и Coprinopsis cinerea имеет мономерное строение белка, тогда как агглютинины Rhizoctonia solani, Boletus edulis являются димерными белками.
5. Семейство галектин - подобных белков. Галектины - это семейство галактозид-связывающих протеинов, которые экспрессируются внутриклеточно и внеклеточно многими типами клеток позвоночных, беспозвоночных и грибов. Галектины регулируют многие важнейшие клеточные процессы, включая дифференциацию, созревание, активацию, миграцию и апоптоз. К таким углевод связывающим белкам относятся лектины высших грибов Agrocybe cylindracea (ACG), Agrocybe аegerita (AAL) и Coprinopsis psiscinerea (CGL2, CGL3). Потенциальными членами данного семейства являются лектины микромицетов Rhizoctonia solani, Penicilium chrysogenum [Houser, 2014].
6. Семейство адгезин-подобных белков. Несколько лектинов микромицетов подобны белкам адгезинам дрожжей. Лектин-подобные адгезины дрожжей участвуют в процессе флокуляции как, например, флокулин Flo5 из Saccharomyces cerevisiae [Veelders et al., 2010] или в эпителиальной адгезии как, например, адгезин Epa1p человеческого патогена Candida glabrata [Ielasi et al., 2012]. У данных белков N-конец домена лектина представляет собой «-сэндвич», анологичный домену PA14 из токсина сибирской язвы, содержащий защитный антиген. Кальций-зависимый углевод - связывающий сайт находится напротив N и С-концов, которые связаны дисульфидными мостиками. Ион кальция связан через мотив DcisD на поверхности петли. Белок Flo5 представляет собой также и вторичный сайт связывания, субдомен которого, стабилизированный двумя дисульфидными мостиками и состоящий из пяти коротких -нитей, помогает распознавать олигоманнозиды [Veelders et al., 2010]. Потенциальными белками данного семейства являются лектины микроскопических грибов Ashbya gossipii, Eremothecium cymbalariae, Fonsecaea pedrosoi [Houser, 2014].
Состав сред для культивирования микроорганизмов
Подготовка суммарной фракции лектинов для хроматографии проводилась с помощью концентрирования белков водной фазы экстрактов мицелий микромицетов в 20 мМ Tris-HCl буфере (рН 7,8) кристаллическим сульфатом аммония в течение 12 ч при 4 С [Сова, Кусайкин, 2006]. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием при 10000g в течение 15 мин (4С) и растворяли в минимальном количестве буфера.
Диализ концентрированного белка проводили с помощью мембран с размером пор 12-14 кДа (производства «Orange Scientific», Бельгия) против 20 мМ Tris-HCl буферного раствора (рН 7,8) при перемешивании в течение 48 часов, при температуре 4С. Полученную фракцию суммарных лектинов использовали для хроматографической очистки лектина с помощью хроматографической системы низкого давления BioLogic LP производства компании Bio-Rad, на колонках Bio-Scale Mini Macro-Prep High Q, DEAE-Sepharose и Sephadex G-50.
Концентрат белка после фильтрования через одноразовые стерильные мембранные насадки Millex (d 33мм, d пор 0,45 мкм, полиэтилсульфон, Millipore) наносили на ионообменную колонку Bio-Scale Mini Macro-Prep High Q («Bio-Rad», США), предварительно уравновешенную 20 мМ Tris-HCl буфером (рН 7,8), которую многократно промывали буферным раствором. Связанный лектин элюировали с колонки линейным градиентом концентрации NaCl 01М при скорости потока 3 мл/мин. Выход белковых фракций регистрировали по оптической плотности при 280 нм. Затем лектиновые фракции собирали и концентрировали на роторном испарителе. Удаление соли и получение очищенной фракции лектина осуществляли методом гель – фильтрации на колонке Bio-Scale Mini Bio-Gel P-6 («Bio-Rad», США), уравновешенной 20 мМ Tris-HCl буфером (рН 7,8). Скорость элюирующего потока 1 мл/мин.
Второй этап очистки лектина проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонках (1,5 50 см), заполненных диэтиламиноэтилсефарозой (DEAE-Sepharose, «Pharmacia», Швеция). Элюция проводилась также 20 мМ Tris-HCl буферным раствором (рН 7,8). Фракции, обладающие гемагглютинирующий активностью, объединяли и фракционировали на колонке с Sephadex G-50 («Sigma», Швеция), уравновешенной Tris-HCl буфером (рН 7,8). Элюцию белка осуществляли Tris-HCl буфером (рН 7,8) при скорости потока 0,5 мл/мин. Полученные гемагглютинирующие фракции собирали, концентрировали и использовали для дальнейших экспериментов. На каждом этапе очистки лектина определяли содержание белков во фракциях и их гемагглютинирующую активность. Чистоту получаемых фракций лектина контролировали методом SDS-электрофореза в 12,5 % полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.
Определение молекулярной массы лектина проводили методом гель-фильтрации на Sephadex G-100 и SDS-электрофореза в 12,5 % полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE).
Молекулярную массу нативного лектина определяли гель-фильтрацией на колонке Econo - Column (1,5 50 см, «Bio-Rad», США), заполненной Sephadex G 42 100 (средний, диаметр частиц 40-120 мкм) и уравновешенной Tris-HCl буферным раствором (рН 7,8).
В качестве белков маркеров использовали лизоцим (14 кДа), -химотрипсин (26 кДа), пероксидаза (34 кДа), бычий сывороточный альбумин (70 кДа). Образцы наносили на колонку в объеме 1 мл (2 мг/мл) и элюировали 20 мМ Tris-HCl буферным раствором (рН 7,8) при скорости потока 0,5 мл/мин.
Калибровочная кривая по определению молекулярной массы лектина была построена с помощью линейной зависимости логарифма молекулярной массы белка (lg M) и объема элюанта с колонки (Vе).
Одномерное электрофоретическое разделение белка осуществляли сначала в концентрирующем 6% SDS-полиакриламидном геле, потом в разделяющем 12,5% SDS-полиакриламидном геле в соответствии с методом Лэммли [Laemmli, 1970]. Электрофорез проводили в камере для вертикального электрофореза Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell (Bio-Rad, США).
Перед нанесением на гель образцы кипятили на водяной бане при температуре 95С в течение 5 мин, охлаждали до комнатной температуры и наносили на гель. Образцы наносили на гель в объеме 20 мкл при концентрации 5-10 мкг белка на одну лунку.
В качестве маркеров использовали коммерческий набор PageRuler Unstained Protein Ladder фирмы Fermentas из 14 неокрашенных, гомогенных, рекомбинантных белков с известной молекулярной массой в диапазоне от 10 до 200 kDa.
Электрофорез проводили при комнатной температуре в течение 30 мин при напряжении тока 80 вольт для концентрирующего геля и 1.5-2 ч при напряжении тока 120 вольт для разделяющегося геля.
Окрашивание белков осуществляли с помощью 0,25 % красителя Coomassie Brilliant Blue R-250 или 0,4% раствора нитрата серебра.
Сканирование, визуализацию и анализ белковых полос гелей проводили с использованием прибора ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad, США) и пакета программ Image Lab Software. Молекулярную массу белка определяли по калибровочной кривой для каждого геля при помощи программы Image Lab Software.
Для определения первичной структуры лектина проводилась предварительная подготовка образцов на 600/384 TM AnchorChip MALDI пластинах (Bruker Daltonik, Германия) путем смешивания 0,5 мкл раствора 2,5 дигидроксибензойной кислоты (Sigma-Aldrich, 20 мг/мл) с 2 мкл раствора пептидов лектина, после чего указаннную смесь высушивали на воздухе. Получение пептидных фрагментов осуществлялось трипсином по методике, изложенной на сайте (http://www.bioc.uzh.ch). Аминокислотные последовательности пептидов исследуемого лектина были исследованы на масс-спектрометре ultrafleXtreme MALDIOF/TOF фирмы Bruker Daltonik (Германия) и обработаны при помощи программного обеспечения FlexAnalysis 2,4 (Bruker Daltonik GmbH). Поиск идентичных белков среди белков всех организмов осуществляли с помощью пакета программ Mascot (http://www.matrixscience.com) в базе данных SwisProt и NCBI. Статистически достоверными считали белки, имеющие параметр score 80 (p 0.05).
Определение мутагенной активности лектинов (тест Эймса)
В результате гель-фильтрации были получены гемагглютинирующие фракции (17 и 18), которые собирали, концентрировали и использовали для дальнейших экспериментов. На данном этапе очистки лектина R. solani получилось полностью избавиться от сопутствующих белков и увеличить его активность в 107,5 раз по сравнению с активностью в сыром экстракте микромицета (табл. 12). Таблица 12. Выделение и очистка лектина из сырого экстракта мицелия Rhizoctonia solani
Очистка Объем, мл Белок, мг/мл Общий белок, мг Титр ГА Общая ГА1, U Удельная ГА2, U/мг Степень очистки Выход, % Сырой экстракт 5,8 17,2 99,8 16384 95027 0,9510 3 1 100 Фракционирование(NH4)2SO4 и диализ 3 23,4 70,2 32768 98304 1,410 3 1,47 103,5 Bio-Scale Mini Macro-Prep High Q 3 0,22 0,66 8192 24576 3,710 4 39,1 25,9 DEAE-Sepharose 3 0,14 0,42 8192 24576 5,910 4 61,45 25,9 Sephadex G-50 1 0,16 0,16 16384 16384 1,010 5 107,54 17,2 Общая гемагглютинирующая активность = ГА объем (мл). 2 Удельная гемагглютинирующая активность = U / белок (мг). Полученный лектин обладал удельной активностью на два порядка выше (1,010 5 ± 144,2 U/мг), чем исходный образец.
Таким образом, для получения очищенной фракции лектина микромицета R. solani необходимо использовать колонки с Bio-Scale Mini Macro-Prep High Q, диэтиламиноэтилсефарозой и Sephadex G-50. Общая схема включает шесть этапов, начиная с получения экстракта белка, его высаливанием сульфатом аммония, последующим диализом и фильтрацией с применением шприцевых фильтров Millex, ионообменную хроматографию на колонках Bio-Scale Mini Macro-Prep High Q, DEAE-Sepharose и гель-фильтрацию на колонке с Sephadex G-50.
Степень очистки, гомогенность полученного лектина микромицета R. solani и его молекулярную массу определяли методом электрофореза в 12,5 % полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (рис. 10). Для получения более достоверных результатов окраску белков проводили двумя красителями (Кумасси R - 250 и раствором нитрата серебра).
Электрофореграмма очищенного лектина Rhizoctonia solani, проявленная с использованием красителя Кумасси R – 250 (слева) и нитратом серебра (справа): М - маркерные белки PageRuler Unstained Protein Ladder (Fermentas) с молекулярной массой от 10 до 200 kDa; 1 - лектин после ионообменных хроматографии (колонки Bio-Scale Mini Macro-Prep High Q и DEAE-Sepharose) и гель – фильтрации на Sephadex G-50; 2 - лектин после ионообменной хроматографии (колонка Bio-Scale Mini Macro-Prep High Q). Стрелкой показан лектин Rhizoctonia solani
Результаты экспериментов показали, что по мере очистки лектина на электрофореграммах наблюдалось постепенное уменьшение количества белковых полос. После двух ионообменных хроматографий на колонках Bio-Scale Mini Macro-Prep High Q, DEAE-Sepharose и гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-50 на электрофорегамме остается одна яркая полоса, свидетельствующая о гомогенности лектина R. solani (рис. 10, слева). Окрашивание белка с помощью раствора нитрата серебра также не выявило в образце дополнительных сопутствующих белков, что характерно для белка высокой степени очистки (рис. 10, справа).
Использование при электрофорезе стандартных маркерных белков с молекулярной 15-200 kDa позволило установить, что полученный лектин микромицета R. solani имеет молекулярную массу 18 ± 1,5 кДа. Однако определение молекулярной массы нативного лектина методом гель-фильтрацией на колонке Econo - Column (1,5 50 см) с Sephadex G-100 показало, что молекулярная масса лектина R. solani находится в пределах 36 ± 2 кДа (рис. 11). 12 14 16 18 20 22 Ve, CM3
Определение молекулярной массы лектина Rhizoctonia solani: 1-бычий сывороточный альбумин (70 кДа), 2 - овальбумин (45 кДа), 3 - -химотрипсин (26 кДа), 4 - лизоцим (14 кДа). Калибровочная кривая была построена с помощью линейной зависимости логарифма молекулярной массы белка (lg M) от объема элюирования его с колонки (Vе)
Сравнение результатов, полученных с помощью электрофореза в денатурирующих условиях и гель-фильтрации нативного белка, свидетельствует о том, что лектин R. solani имеет димерное строение и состоит из двух идентичных субъединиц. Определение первичной структуры лектина Rhizoctonia solani, очищенного из экстракта мицелия микромицета и поиск гомологичных белков среди белков всех организмов проводили методом MALDIOF-масс-спектрометрии. Обнаружено, что отдельные аминокислотные последовательности пептидов лектина Rhizoctonia solani имели сходство с некоторыми последовательностями белков других организмов. Тем не менее, параметр score для данных пептидов составлял меньше 80, что свидетельствует об отсутствии достоверного сходства между ними. Сравнительный анализ первичной структуры исследуемого лектина Rhizoctonia solani со структурой агглютинина Rhizoctonia solani AG3, доступной на сервере NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html?showseq=1&mmdbid=110672 &buidx=0) показал, что аминокислотная последовательность лектина имела лишь 32 % сходства с лектином Rhizoctonia solani из анастомозной группы 3 (AG3) (рис. 12, 13).
Специфичность лектина относительно взаимодействия с различными сахарами
Результаты исследований показали, что концентрация, при которой происходило 50%-ное ингибирование роста различных линий опухолевых и нормальных клеток соответствовала значениям 3-10 мкг/мл. 90%-ная ингибирующая концентрация лектина наблюдалась при концентрации 6-22 мкг/мл. Определение сравнительного действия на различные клеточные линии показало, что наибольшую чувствительность к лектину проявляла культура клеток MCF-7 (рак молочной железы), для которой значения IС50 и IС90 соответствовали концентрациям 3,22 ± 0,1 мкг/мл и 6,8 ± 0,2 мкг/мл, соответственно. Данные концентрации лектина были в 2,5-3,2 раза ниже значений IC50 и IC90 лектина, которые оказывали влияние на нормальные клетки. Значения IC50 и IC90 для нормальных клеток составили 8-10 мкг/мл и 19-22 мкг/мл, соответственно. Величина IС90 для клеточных линий опухоли простаты (PC-3) и шейки матки (Hela) наблюдалась, когда в реакционную смесь были внесены концентрации лектина в больших количествах (20,4 ± 0,7 мкг/мл и 13,9 ± 0,4 мкг/мл), соответственно.
Влияние лектина R. solani в отношении клеточных линий опухоли рака молочной железы (MCF-7) и нормальных клеток (НЕК-293) хорошо прослеживается на микрофотографиях (рис. 30, 31).
Микрофотографии цитотоксической активности лектина Rhizoctonia solani в отношении нормальных клеток почек эмбриона HEK-293. Слева направо: HEK-293 (контроль), HEK-293 + лектин R. solani (3,125 мкг/мл), HEK-293 + лектин R. solani (6,25 мкг/мл) Инкубирование клеток MCF-7 с лектином R. solani в концентрации 3,125 мкг/мл приводило к гибели практически 50% клеток, тогда как процент погибших нормальных клеток HEK-293 при такой концентрации лектина составлял лишь 9%.
Более низкие концентрации лектина, при взаимодействии с исследуемыми линиями клеток, приводили к изменениям их морфологии: клетки в основном уменьшались в размерах, приобретали более округлую форму, наблюдалась потеря межклеточного взаимодействия и клетки начинали приобретать обособленную структуру. При более высоких концентрациях лектина количество погибших опухолевых и нормальных клеток увеличивалось, наблюдалась деградация клеточных мембран, клетки начинали лизироваться.
Исследование цитотоксичности лектина R. solani с помощью окраски трипановым синим, способного свободно проникать в цитоплазму через поврежденную мембрану мертвой клетки и окрашивать ее внутриклеточные компоненты в синий цвет показало, что данные по цитотоксичности лектина в отношении опухолевых и нормальных клеток, полученные с применением данного красителя, практически полностью совпадают с результатами, полученными с помощью метода МТТ- теста (табл. 19). Однако значения IC50 и IC90 лектина по отношению к исследуемым линиям клеток были несколько выше по сравнению с величинами, определенными методом МТТ-теста и составляли 3-10 мкг/мл и 7-22 мкг/мл, соответственно. Тем не менее, наиболее чувствительной к лектину оставалась клеточная линия опухоли молочной железы MCF-7. Значения IС50 и IС90 для данной линии культуры клеток составили 3,71 ± 0,1 мкг/мл и 7,5 ± 0,3 мкг/мл, соответственно. Таблица 19. Показатели IС50 и IC90 лектина Rhizoctonia solani к тест-культурам
Использование метода окрашивания трипановым синим показало менее выраженную цитотоксичность лектина по отношению к нормальным клеткам человека HEK-293, HSF и клеткам опухоли РС-3 по сравнению к опухолевым клеткам MCF-7 и Hela, что подтверждается данными, полученными методом МТТ- теста.
Таким образом, исследование цитотоксической активности лектина R. solani методами МТТ-теста и окрашиванием трипановым синим показало, что лектин R. solani проявляет дозозависимое токсическое действие в отношении большинства исследуемых клеточных, опухолевых линий. Наибольшее ингибирующее влияние лектина на рост и размножение клеток наблюдалось по отношению к культуре MCF-7 (рак молочной железы). 3.9.1. Влияние лектина R. solani на индукцию апоптоза в клеточных линиях рака человека
Апоптоз играет важную роль в поддержании нормального тканевого гомеостаза и участвует в устранении ненужных и потенциально опасных клеток, включая и предшественников опухолевых клеток [Evan, Vousden, 2001]. Поскольку одним из основных показателей апоптоза является снижение трансмембранного потенциала митохондрий клеток [Войткова, 2010], нами проводилось изучение действия лектина R. solani в концентрациях 3,21-6,25 мкг/мл на данный потенциал в опухолевых и нормальных клетках. В качестве опухолевых клеток использовали линии клеток рака молочной железы (MCF-7) и шейки матки (Hela), а также нормальные клетки почек эмбриона (HEK-293). Уровень трансмембранного потенциала митохондрий клеток после совместного инкубирования с лектином оценивали методом проточной цитометрии по интенсивности флуоресценции митохондрий, окрашенных этиловым эфиром тетраметилродамина (TMRE).
Результаты исследований показали, что после совместной инкубации лектина в различных концентрациях с нормальными и опухолевыми клетками происходит уменьшение интенсивности флуоресценции TMRE в клетках, смещение пика TMRE влево вдоль оси абсцисс по сравнению с контрольными необработанными клетками, что свидетельствует о снижении трансмембранного потенциала и возможном апоптотическом типе гибели клеток (рис. 37-41).
Наиболее сильное снижение интенсивности флуоресценции TMRE происходило после совместной инкубации лектина с опухолевыми клетками молочной железы MCF-7 (рис. 37, 40). Культивирование клеток MCF-7 с лектином в концентрации 3,21 мкг/мл приводило к уменьшению интенсивности флуоресценции TMRE на 90-95% в митохондриях опухолевых клеток по сравнению с контролем, вследствие снижения их трансмембранного потенциала (рис. 37 Б). При концентрации 6,25 мкг/мл лектина происходит практически полное падение трансмембранного потенциала в митохондриях клеток MCF-7, что свидетельствует о гибели данных клеток (рис. 37 В).