Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение первичной структури ДНК и ізработка систем экспрессии генов in vitro существенно расширили шия в области структурно-функциональной организации ґкариотичєских генов. Эти исследования способствовали решение южества вопросов, связанных с регуляцией экспрессия генов, с зсттранскирвдиониой а поеттраноляционной модификацией генных зодуктов, а также связанных с созданием и получением различных энно-инхенерных препаратов, необходимых для диагностики и рофилактики инфекционных болезней человека и животных, ущественную роль в этих исследованиях играет рекомбинантные энструкции на основе эукариотических вирусов, которые кспрессирувт гены, кодирующие различные антьгены возбудителей нфекций, и являются жквьш вакцинам.
В этом отношении вирус осповакцинн СВОВ) представляет олыюй научно-практический интерес. Он имеет такие отличительные войства, как способность включать значительное количество кзогенной ДНК, правильная транскрипция экзогенных генов и равильная трансляция мРНК с образованием белка сходного с ативньш по структуре, функции и расположении, цигоплазматическая окализация репликации вируса и наличие безопасных вакцинних ташов СMoss, !991). Все это позволяет рассматривать вирус сповакцшш в качестве перспективного вектора для клонирования ухеродных генов различных антигенов, в качестве живой екомбинантаой вакцины против возбудителей инфекций человека и явотных (Brody et al., 1992; Riviere et al., 1992).
На данный моыент получен целый ряд рекомбинактак вирусов сповакцины, экспрессируювдх различные чужеродные гены, в іольшинстве случаев на основе вирулентных штаммов СWilliamson, 938).
В настоящей работе т показали использование вируса юповакщшы штамма ЛИШ, широко апробированного как вакцина для мквидации и профилактики натуральной оспа в СНГ, в качестве актора экспрессии. Провели изучение рехомбинантаых штаммов ВОВ, ікспрессирршда как репортерше гены, »ак и гыы антигенов вируса епатита В СВГВЗ и бешенства. Созданные наш рекомбинантные іирусн могут рассматриваться как кандидаты на живые 'еяно-инженерюе вакцины против гепатита В и бешенства. Все это и шределяег актуальность данной темы.
рель и задачи исследования. Цэдьв работы было . создание и изучение свойств рекомбинантных штампов вируса осповахцшш, экспрессирувда гетерологичные гены. В .соответствии с этим были определены следующие задачи:
сконструировать бактериальные вектори иксерцки, содержащие гены р-галактозйдазы E.coll, яхциферазы светлячка Photlnus pyralls, НВ Ag вируса гепатита В;
изучить транэиентную экспрессию репортерных генов;
получить стабильные рекомбинантные вирусы осповакцины штамма ЛИВП. экспрессирущке гетерологичіше гены;
изучить экспрессию репортерных генов в процессе репродукции рекомбинантных вирусов;
- провести иммунологический анализ экспрессии KBeAg и ШаЩ
вируса гепатита В и гяжопротеина вируса бешенатва
рекомбинантньш вирусами осповакщкш.
Научная ровизна. Результаты по клонировании гетерологичных генов в ДНК вируса осповакциш штамма ЛИВП носят приоритетный характер. Впервые получены рекомбинантные ВОВ штамма ЛИВП, содержащие в НїдаіІІ-N- и НА-областях чужеродные гены. Впервые создан тривалентний рекомбикантный вирус осповакцшш штамма ЛИВП, экспрессируоздй три чужеродных гена: 0-галачтозидазу E.coll, HBoAg и HBcAg вируса гепатита В. Впервые получен рехомбинантнай вирус осповакциш штамма ЛШІ, который зкспрессирует гликопротеин вируса бешенства штамма. "Внуково-32". Впервые сконструирован иктегративный вектор инаерции чужеродных генов в iiindllI-N-область генома вируса осповакцины.
Научно-практическая значимость результатов. Основный итогом работы явилось создание серии рекомбикактных вирусов осповакцины, экспрессирувдих гетерологичные гени в различных несущественных областях генома.
Сконструированные рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирувдю антигены вируса гепатита В к бешенства является кандидатами на живые геняо-инжеиерше вакцины против этих инфекций. Рекомбшштшй вирус, зкепрессируодий гликопротеин вируса беиенства, проверен на лабораторных хивотных и получены положительные -результата. В настоящее время оформляется патент на этот рекомбинантный штате, как на живут вакцину против бешенства.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение и выводы. Работа изложена на НВ страницах, содержит 8 таблиц и