Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
Глава 1. Анализ литературы и постановка задач
исследования 17
Иммунохимические методы в биохимической и микробиологической практике 17
Коллоидное золото и его конъюгаты с биомакромолекулами: основные свойства и аспекты возможного использования 31
Адъюванты и носители антигенов, используемые для получения антител и производства вакцин 47
Адъюванты 47
Носители 55
1.4. Постановка задач исследования 63
Глава 2. Разработка технологии синтеза биоспецифических
маркеров - конъюгатов коллоидного золота 66
2.1. Синтез коллоидных золотых частиц с использованием
низкомолекулярных восстановителей 66
Обзор распространенных методик синтеза золотых наночастиц 66
Получение коллоидного золота с требуемым размером частиц по методу Френса 71
Разработка нового метода синтеза коллоидного золота со средним диаметром частиц 5 нм 75
Определение среднего диаметра получаемых золотых наночастиц 76
2.2. Конъюгация коллоидного золота с биоспецифическими
макромолекулами 79
Общие принципы конъюгации наночастиц с биомолекулами 79
Процедура получения конъюгатов коллоидного золота с биоспецифическими макромолекулами 86
Получение и использование новых биоспецифических маркеров 91
2.3. Синтез золотых коллоидных частиц с использованием
высокомолекулярных восстановителей 99
Глава 3. Развитие методологии твердофазного
иммуноанализа с использованием конъюгатов
коллоидного золота и ее применение в
микробиологических и биохимических исследованиях 108
3.1 Краткий обзор современных методик твердофазного иммуноанализа с использованием мембранных носителей... 108
Дот-блот анализ: принципы и применение 108
Коллоидное золото в твердофазных методах анализа...! 13
Методика проведения дот- и блот-анализов с использованием конъюгатов коллоидного золота. Cell-gold immunoblotting 119
Повышение чувствительности выявления результатов биоспецифических реакций с использованием солей серебра 122
3.2. Изучение поверхностных структур почвенных бактерий с
использованием биоспецифических маркеров - конъюгатов
коллоидного золота 125
Краткая характеристика бактерий родов Azospirillum и Agrobacterium 125
Использованные микробные штаммы, методы и условия выращивания бактерий 128
Применение методов дот- и блот-анализа для серотипирования азоспирилл 131
Исследование влияния R-S диссоциации штамма А. brasilense Sp 7 на физико-химические свойства клеточной поверхности 139
Цитохимический анализ углеводных структур клеточной поверхности штамма Л. гаdiobacter 5D-1 и его мутантов 149
3.3. Применение дот-анализа и иммунозолотых маркеров в
разработке иммунохимических тест-систем 154
Использование коллоидного золота в современной диагностике инфекционных заболеваний человека и животных 154
Использование конъюгатов коллоидного золота для идентификации антигена стеблевых меристем пшеницы 158
Иммунохимическое исследование возбудителя головневой инфекции пшеницы 163
Глава 4. Использование коллоидного золота для
количественного определения белков 171
Оптимизация метода SPIA для количественного иммуноанализа 171
Разработка метода количественного определения белков с использованием конъюгата трипсин - коллоидное золото 180
Использование конъюгатов золотых наночастиц с биологическими макромолекулами в методах колебательной спектроскопии 185
Глава 5. Применение коллоидного золота для получения
антител in vivo и in vitro 200
Адъговантные свойства золотых наночастиц 200
Получение, селекция и иммунодетекция миниантител с использованием конъюгатов коллоидного золота и комбинаторных фаговых библиотек л 225
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 237
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 243
ПРИЛОЖЕНИЕ 322
Введение к работе
Одной из основополагающих черт современной науки является взаимное проникновение фундаментальных знаний и экспериментальных методик из одной отрасли науки в другую. Так, в иммунологии применяется целый ряд методов из других областей биологии: выделение антигенов и антител производят с помощью биохимических методов фракционирования белков, гены иммунологически важных молекул ' секвенируют молекулярно-генетическими методами и т.п. В свою очередь, в иммунологии разработаны свои специальные методы исследования разнообразных химических соединений, основанные на взаимодействии антиген-антитело. Эти иммунологические подходы нашли широчайшее применение в различных областях биологии, медицины и аналитической химии [1, 2].
В частности, иммунологические методы весьма эффективны в исследованиях структуры и функций компонентов клеточной поверхности микроорганизмов. Иммунохимический анализ поверхностных структур микробных и растительных клеток, ответственных за осуществление контактных взаимодействий почвенных микроорганизмов с растениями, занимает одно из центральных мест в проблеме микробнего симбиоза, паразитизма и иммунитета растений [3,4].
Высокоспецифичное и высокоаффинное взаимодействие антител с антигенами создает благоприятную препаративную и аналитическую основу для идентификации разнообразных биологических соединений, для изучения их физико-химических и биохимических свойств. Причем, какие бы новые методы пммуноанализа не разрабатывались, в них решающую роль играют антитела. Антитела, являясь уникальными молекулярными детекторами, остаются базисом любого пммуноанализа, независимо от систем регистрации или применяемых реагентов. Однако, известные технологии получения поли- и моноклональных антител обладают рядом недостатков. К наиболее
существенным из них следует, вероятно, отнести проблемы получения антител к низкомолекулярным и низкоиммуногенным антигенам, принципиальную невозможность применения моноклональных антител в широком спектре традиционных методов иммуноапалпза с использованием эффекта преципитации и т.д. В связи с этим особую актуальность приобретает развитие новых иммунотехнологических методов получения антител как in vivo, так и in vitro, позволяющих преодолеть в той или иной степени отмеченные выше ограничения.
Одним из важнейших компонентов современных иммунохимических тест-систем, обычно используемым в качестве метки, являются наночастпцы коллоидного золота. Несмотря на то, что само коллоидное золото имеет более чем тысячелетнюю историю, «революция в цитохимии», связанная с использованием частиц золота в биологических исследованиях, произошла в 1971 г., когда сотрудники факультета зоологии и биохимии университета Северного Уэльса В.П. Фолк и Г.М. Тейлор опубликовали статью «Иммуноколлоидный метод для электронной микроскопии» [5]. В ней они описали способ конъюгации антител с коллоидным золотом и использование полученных комплексов для прямой электронно-микроскопической визуализации поверхностных антигенов сальмонелл.
За более чем 30 лет, прошедших с момента выхода этой статьи, было предложено огромное количество вариантов использования иммунозолотого метода в биохимических, микробиологических, молекулярно-генетических и др, исследованиях. Причем до последнего времени коллоидно-золотые препараты использовались, в основном, в микроскопических методах анализа.
Однако в 2000 г. секция «Медицинская диагностика и химический анализ с использованием наносснсоров» в рамках крупнейшего мирового научного форума по биомедицинской оптике «B1OS-2000» открылась докладом профессора Пенсильванского университета М. Натана «Коллоидное золото в биологии: теперь не только для электронной микроскопии». В докладе
констатировалось, что в последние годы расширились области применения металлических панокластеров как датчиков биоаффинных взаимодействий в разнообразных бносенсорных системах. Большинство подобных систем основано на уникальных оптических свойствах наночастиц коллоидного золота, в частности, на явлении поверхностного плазмонного резонанса. При этом для регистрации изменений, осуществляющихся в процессе реакции антиген-антитело, когда один из участников реакции адсорбирован на частицах коллоидного золота, используют методы светорассеяния, колебательной спектроскопии и др.
Анализ литературных данных позволяет признать актуальной тему данной диссертации и кчшстатировать, что ко времени начала наших исследований в этой области эффективность использования коллоидного золота в биохимических и микробиологических исследованиях ограничивалась дефицитом сведений по: а) вопросам синтеза золей золота с требуемым размером частиц и получения на их основе маркеров с широким спектром биоспецифических зондов, б) вариантам их использования в твердофазном иммуноанализе и иммуноанализе на частицах золя, в) применению биомаркеров на основе коллоидного золота в исследованиях поверхностных структур клеток и в диагностических тест-системах, г) проблемам использования коллоидного золота в качестве носителя для получения антител к слабо иммуногенным антигенам in vivo и in vitro.
Целью нашей работы было развитие теоретических и экспериментальных основ ряда иммунохимических, биохимических и физико-химических методов исследования биомолекул и клеток, расширяющих границы применения конъюгатов коллоидного золота с биоспецифическими молекулами в различных вариантах иммуноанализа с применением современных регистрирующих средств и методик получения антител.
В ходе реализации этой цели были получены результаты, научная новизна которых заключается в следующем:
разработан оригинальный метод синтеза золей золота с диаметром частиц 5 им;
впервые предложены методики получения и варианты использования новых биомаркеров на основе перспективных зондов;
впервые с помощью метода иммунозолотого дот-анализа проведено исследование физико-химических свойств клеточной поверхности почвенных микроорганизмов родов Azospirillum и Agrobacterium и разработаны тест-системы для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, головневой инфекции пшеницы, определения пролиферативного антигена ее инициалей;
разработан вариант метода иммуноанализа на частицах золя с использованием микротитровальпых планшетов и фотометрического ридера и предложен новый метод биохимического анализа с использованием конъгагатов протеолитических ферментов с коллоидным золотом для быстрого и чувствительного количественного определения белков;
впервые продемонстрирована возможность применения метода ИК-Фурье спектроскопии сухих пленок золотых биоконъюгатов для определения взаимодействия белковых молекул с поверхностью золотых частиц, а также для регистрации биоспецифических реакций;
получены достоверные данные, позволяющие констатировать наличие у золотых наночастиц адъювантных свойств;
разработан метод селекции антител из комбинаторных фаговых библиотек с использованием конъюгатов антигенов (в том числе и гаптенов) с частицами коллоидного золота.
Кроме того, полученные результаты имеют определенную практическую значимость. В частности, на основе разработанного и защищенного патентом РФ способа получения биоспецифических маркеров - копыогатов коллоидного золота в рамках Госзаказа Министерства науки и технической политики РФ
создан Лабораторный технологический регламент и наработаны образцы 138 препаратоп (см. приложение). Синтезированные бпомаркеры и разработанные новые методологические приемы используются в ряде лабораторий ИБФРМ РАН. Кроме того, часть образцов передана по заказам более чем 40 организациям, включая академические и прикладные научно-исследовательские институты, вузы, лечебные учреждения России, ближнего и дальнего зарубежья для проведения работ, связанных с решением широкого круга научных и прикладных задач в области биологии, биотехнологии и медицины.
Результаты работы были представлены на МеждународЕюй выставке «Достижения российской биотехнологии» (ФРГ, 1996 г.), 3-м Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Россия, ВВЦ, 2003 г.), ряде российских и региональных выставках.
Представленные в диссертации разработки используются в учебном процессе в Саратовском госуниверситете, Саратовском аграрном университете и др., включены в методическое пособие (Карпунина Л.В., Мелышкова У.10., Дыкман Л.А., Иващенко СВ., Хапцев ЗЛО., Щербаков А.А. Методические рекомендации по изучению взаимодействия лектинов бацилл с некоторыми бактериями рода Yersinia. - Саратов: СГАУ, 2000. - 12 с).
На защиту выносится следующие основные положении; 1. Полученные сведения о механизмах и усовершенствованные методы синтеза коллоидного золота с требуемым размером частиц и их конъюгации с биоспецифическими зондами позволяют разработать эффективные технологии получения и варианты аналитического использования новых иммунохимических маркеров — конъюгатов коллоидного золота на основе универсальных зондов: фаллоидина, целлюлазы, фетуина, полиэтиленимина, трипсина, миниантптел.
Дот-блот анализ целых бактериальных клеток с применением комъюгата коллоидного золота с полиэтиленимином обеспечивает оценку относительной гидрофобности клеточной поверхности.
Методы твердофазного иммуноанализа с разработанными препаратами коллоидного золота, примененными в нммуноцитохимических исследованиях ряда представителей почвенных диазотрофов, пригодны для серотипирования бактерий, позволяют зарегистрировать изменения поверхностных структур при R-S диссоциации типового штамма азоспирилл и мутациях штамма агробактериП, затрагивающих синтез их углеводных структур.
Использование конъюгатов коллоидного золота с соответствующими биоспецифическими зондами (в том числе, полученных на образцах стандартных антисывороток) в варианте дот-анализа позволяет разработать эффективные тест-системы экспресс-диагностики острых кишечных инфекций у человека, а также диагностики головневой инфекции и количественного определения пролиферативного антигена инициален пшеницы,
Конъюгаты трипсина с коллоидным золотом могут быть использованы для быстрого и чувствительного спектрофотомстрического определения белков.
Метод ИК-Фурье спектроскопии обеспечивает надежную регистрацию иммунохимических взаимодействии, реализуемых на поверхности частиц коллоидного золота.
У частиц коллоидного золота обнаружены выраженные адыовантные свойства.
Использование конъюгатов антигенов с золотыми наночастпцами позволяет оптимизировать метод селекции миниантител из комбинаторных фаговых библиотек.
Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Разработка эффективных ' тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" научный руководитель темы д.х.н. профессор СЛО. Щеголев, № гос. регистрации 01890017743; "Развитие методов светорассеяния и электрооптики применительно к анализу природных и синтетических дисперсных систем", научный руководитель темы д.ф.-м.н. профессор НJT. Хлебцов, № гос. регистрации 01912022281.
Работа была поддержана Министерством науки и технической политики РФ (распоряжение № 1508ф). Частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (ЖМЬ проектов 94-03-09286, 96-03-32504, 98-03-32664, 01-03-33130, 01-04-48736, 04-04-48224), Международного научного фонда (фонда Сороса) (№ RNR00O), фонда INCAS-S (J& 99-4-04), фонда CRDF (Л'« REC-006), UNESCO Short-term Fellowship in biotechnology (N» 875,687.1), NATO Expert Visit Grant (№ LST.EV.979787).
Личный вклад соискатели. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с к.б.н. В.А. Богатыревым. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору данной диссертации и в получении которых роль автора была определяющей.
В иммунохимических экспериментах использовали антитела, полученные к.х.н. Шварцбурдом Б.И. и к.бл. Матора ЛЛО. (ЛФХКС ИБФРМ РАМ); измерения колебательных спектров проводили совместно с д.х.н. Камневым А.А. (ИБФРМ РАН) и Dr. Tarantilis Р. (Афинский аграрный университет, Греция), работа с фаговым дисплеем антител стала возможной благодаря к.м.н. Сумарока М.В. (ЛФХКС ИБФРМ РАН) и к.х.н. Ламану А.Г., к.б.н. Шепеляковскоп А.О. (ФИБХ РАН). В исследованиях также принимали участие
сотрудники группы иммуіютехіюлогни ЛФХКС ИБФРМ РАН к.в.н. Староверов С.Л., аспиранты Зайцева М.С. и Прпстенский Д.В. Всем им автор выражает глубокую благодарность.
Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы д.х.н. профессора СЮ. Щеголева и д.ф.-м.н. профессора ІІ.Г. Хлебцова (ИБФРМ РАН) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.
Апробации работы. Основные результаты диссертационной работы представлялись, докладывались и обсуждались на: 5-th Int. Symp. "Nitrogen Fixation with Non-Legumes", Florence, Italy, Sept. 10-14, 1990; 15-th Int. Congr. of Biochemistry, Jerusalem, Israel, Aug. 4-8, 1991; 8-th Eastern Eur. Symp. on Biological Nitrogen Fixation, Saratov, Russia, Sept. 22-26, 1992; 1-st Int. Conf. on Polysaccharide Engineering, Trondheim, Norway, June 6-8, 1994; 1-st Eur. Nitrogen Fixation Conf., Szeged, Hungary, Aug. 28 - Sept. 2, 1994; NATO Advanced Research Workshop on Azosp'irillum and Related Microorganisms, Sarvar, Hungary, Sept. 4-6, 1994; Int. Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with Plants, Saratov, Russia, June 5-8, 1995; Int. Symp. on Biomedical Optics, Barcelona, Spain, Sept. 12-16, 1995; Beijerinck Centennial Conf. "Microbial Physiology and Gene Regulation: Emergings Principles and Applications", Hague, The Netherlands, Dec. 16-21, 1995; 4-th World Congr. on Biosensors, Bangkok, Thailand, May 29-31, 1996; 9-th, 10-th and 11-th Int. Conf. of Surface and Colloid Science, Sofia, Bulgaria, July 6-12, 1997, Bristol, UK, July 23-28, 2000, Iguassu Falls, Brazil, Sept. 15-19, 2003; 12-th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, Parana, Brazil, Sept. 12-17, 1999; школе-конф. "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, Россия, 28 мая - 2 июня 2000; 5-th and 6-th John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology, Pushchino, Russia, Sept. 15-21, 2000, Sept. 15-22, 2002; 5-ой и 7-ой Путинской школе-конф. молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, Россия, 16-20 апреля 2001, 14-18 апреля 2003; Int. Symp. "Biological motility: New trends in research", Pushchino, Russia, Aug. 20-26, 2001; межд. научи, конф. "Биотехнология на
рубеже двух тысячелетии", Саранск, Россия, 12-15 сент., 2001; 1-ой per. конф, молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, Россия, 26-27 марта, 2002; XXVI Eur. Congr. on Molecular Spectroscopy, Villeneuve d'Ascq, France, Sept. 1-6, 2002; 1-ом межд. конгр, "Биотехнология - состояние и перспективы развития", Москва, Россия, 14-18 октября, 2002; Donostia Int. Physics Center Workshop "Optical Properties of Complex Materials over Different Length Scales", San Sebastian, Spain, July 7-11, 2003; VIII Int. Conf. "The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology", Saratov, Russia, Sept. 9-13, 2003; V съезде физиологов растений России, Пенза, Россия, 15-21 сентября 2003; NATO Advanced Study Institute on Photopolarimetry in Remote Sensing, Yalta, Ukraine, Sept. 20 - Oct, 3, 2003; Saratov Fall Meeting, Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine, Saratov, Russia, Oct. 7-10, 2003; а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ и других институтов РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 98 печатных работ, в том числе 2 патента и 50 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 19 статей в журналах из списка ВАК, 8 статей в иностранных рецензируемых журналах, 22 статьи в отечественных и зарубежных сборниках научных трудов и 1 главу в книге).