Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 11
2.1. Выбор хроматографического метода для количественного определения аминокислот 11
2.2. Выбор условий для разделения АК в тонких слоях силикагеля 17
2.3. Окрашивание хроматограмм 26
2.4. Количественная обработка результатов методом денситометрии 30
2.4.1. Инструментальные способы измерения 34
2.4.2. Количественная оценка результатов измерений 38
2.4.3. Анализ ошибок в тонкослойной хроматографии 41
2.5. Валидация хроматографических методов анализа 43
2.5.1 Предвалидационные тесты в планарной хроматографии 43
2.5.2. Валидация различных типов аналитических (включая фармакопейные) методов 44
2.5.3. GLP в тонкослойной хроматографии 48
3. Техника и методика проведения эксперимента 51
3.1. Приборы и материалы 51
3.2. Реактивы 52
3.3. Приготовление растворов стандартных образцов аминокислот, проб плазмы крови и пробКЖ 53
3.5. Подготовка хроматографических пластинок 54
3.5. Хроматографические системы, используемые в работе и их приготовление 55
3.6. Подготовка хроматографической камеры 55
3.7. Приготовление раствора нингидринового реактива 56
3.8. Нанесение стандартных образцов (Sp S5), проб нативной сыворотки крови (Ni-NN) и проб КЖ (Ui-U\j) на хроматографическую пластинку 56
3.9. Проявление хроматограмм 57
3.10. Обработка хроматограммы нингидриновым реактивом 57
3.11. Количественная обработка хроматограмм 58
3.12. Определение аминокислот методом ВЭЖХ 58
3.13. Выделение неизвестного вещества, имеющего хроматографическую подвижность и УФ-спектр, аналогичные фенилаланину из лейцин-содержащей КЖ с помощью колоночной хроматографии 59
3.14. Регистрация ЯМР^Н спектров 60
4. Обсуждение результатов 61
4.1. Хроматографический комплекс для количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии 61
4.1.1. Разработка состава слоя для пластин тонкослойной хроматографии 61
4.1.2. Оборудование для высокоэффективной тонкослойной хроматографии..64
4.1.3. Компьютерный видеоденситометр «ДенСкан» для количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии: состав прибора, программное обеспечение 70
5. Количественная высокоэффективная тонкослойная хроматография аминокислот 86
5.1. Выбор метода нанесения обнаруживающего реагента на хроматограмму для визуализации пятен аминокислот 88
5.2. Выбор оптимальных условий проведения цветной реакции для визуализации пятен аминокислот на хроматограммах 90
5.3. Прямое разделение многокомпонентных смесей аминокислот сочетанием методов двухмерной и одномерной тонкослойной хроматографии 95
5.4. Анализ аминокислот в биологических жидкостях 98
5.5. Анализ аминокислот в культуральных жидкостях 102
5.5.1. Анализ оксиаминокислот серина, гомосерина и треонина, а также сопутствующих им в КЖ аминокислот 102
5.5.2. Анализ гомосерина и сопутствующих аминокислот в КЖ штамма-продуцента гомосерина 108
5.5.3. Количественное определение треонина и сопутствующих ему в КЖ аминокислот 113
5.6. Количественное определение ароматических аминокислот - триптофана и фенилаланина в образцах КЖ 116
5.6.1. Разработка методов количественного определения триптофана 116
5.6.2. Анализ фенилаланина в культуральных жидкостях 121
5.7. Анализ основных аминокислот - лизина, аргинина и орнитина в промышленных образцах КЖ 125
5.7.1. Применение методов хроматоденситометрии и ВЭЖХ для определения содержания лизина в КЖ ;.., 125
5.7.2. Количественное определение аргинина, орнитина и сопутствующих им аминокислот в КЖ штамма -продуцента аргинина 127
5.8. Количественное определение неполярных аминокислот - валина и лейцина в КЖ штамма-продуцента валина 131
5.8.1. Анализ валина и сопутствующих ему в КЖ аминокислот 131
5.8.2. Количественный анализ лейцина и сопутствующих ему соединений в КЖ штамма-продуцента лейцина 135
5.9. Основания Шиффа - один из возможных источников потерь при биосинтезе промышленных аминокислот 143
5.10. Анализ отходов производства аминокислот 145
6. Выводы 147
7. Литература 149
- Выбор хроматографического метода для количественного определения аминокислот
- Приготовление растворов стандартных образцов аминокислот, проб плазмы крови и пробКЖ
- Хроматографический комплекс для количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии
- Выбор метода нанесения обнаруживающего реагента на хроматограмму для визуализации пятен аминокислот
Введение к работе
Целью настоящей работы была разработка методов определения широкого спектра аминокислот (АК) методом количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).
Аминокислоты1 являются основным строительным материалом для синтеза специфических тканевых белков, ферментов, пептидных гормонов и других физиологически активных соединений. Часть аминокислот (аланин, аспа-рагин, аспарагиновая кислота, глицин, глутамин, глутаминовая кислота, пролий, серии, тирозин и цистеин) синтезируются в организме человека. Это, так называемые, заменимые аминокислоты. Другие, относящиеся к незаменимым аминокислотам (аргинин, валин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фени-лаланин, лейцин, изолейцин и гистидин), организмом не синтезируются и поступают внутрь организма с пищей.
Аминокислотам принадлежит большая роль в современной фармакологии. Они имеют большое функциональное значение не только как структурные элементы белков и других эндогенных соединений. Некоторые из них, выступают в качестве нейромедиаторных веществ (глутаминовая и аспарагиновая кислоты, глицин, таурин, у-аминомасляная кислота и др.). Фенилаланин и тирозин являются предшественниками в биосинтезе дофамина, норадреналина и адреналина; триптофан - предшественником серотонина, а гистидин - предшественником гистамина. Производными аминокислот являются энкифалины, эндорфины, динорфины и другие нейропептиды.
Некоторые аминокислоты (глутаминовая, у-аминомасляная, глицин, метионин, гистидин, цистеин и таурин) нашли самостоятельное применение в качестве лекарственных средств, синтезируемых с помощью аминокислот. Например, даралгин (тирозил-2-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин) применяется в качестве лечебного средства при обострениях язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки; каптоприл - l-[(2S)-3- меркапто-2-метилпропионил]-Ь-пролин используется для лечения гипертонической болезни и застойной сердечной недостаточности; тимоген (глутамил-триптофан)-иммуностимулятор [1].
Специальное значение имеют смеси аминокислот, используемые в качестве средств для парентерального питания. При ряде патологических состояний, таких как непроходимость пищевода, нарушение всасывания из кишечника, острые интоксикации и др., а также операциях на желудке и кишечнике возникает необходимость в парентеральном введении продуктов, обеспечивающих белковое питание организма [1]. Парентеральное введение белков, как правило, приводит к аналфилаксии. Аминокислоты в отличии от белков не обладают ни видовой, ни тканевой специфичностью, и поэтому их растворы в чистом виде вполне обеспечивают потребность организма в белках. Для полноценного белкового питания необходимо, чтобы применяемые препараты содержали набор аминокислот, в том числе незаменимые.
Существующие в настоящее время препараты для парентерального питания содержат необходимые организму аминокислоты. В качестве примера можно привести: полиамин (содержит аланин, аргинин, валин, гистидин, глицин, изолейцин, лейцин, лизин и триптофан), вамин (раствор препарата содержит аланин, аргинин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, цистин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин, таурин и валин), ваминолак - раствор для парентерального питания новорожденных (содержит 18 аминокислот, подобранных в соотношениях, соответствующих аминокислотному составу грудного молока) [1]. Необходимо отметить, что именно эти препараты в настоящее время заменили смеси аминокислот, полученные с помощью глубокого гидролиза белка.
К другим областям применения аминокислот можно отнести использо-
Здееь и далее имеются «виду природные аминокислоты, имеющие L-конфигурацию
7 ванне их в качестве пищевых [2] и кормовых добавок [3]. В настоящее время, как и ранее, чистые аминокислоты получают и получали с помощью микробиологического синтеза [4, 5].
Актуальной задачей для современого здравоохранения является диагностика аминоацидурий, наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена аминокислот. Анализ АК, их количества и качества, ответственных за возникновение различных отклонений в организме, является одним из наиболее информативных подходов в клинической и лабораторной диагностике [197].
При производстве чистых АК разработка процесса микробиологического синтеза включает в себя ряд ступеней, которые можно разделить на четыре группы:
Создание штаммов-продуцентов аминокислот с использованием методов классической генетики и селекции, а также генной инженерии.
Выбор условий их культивирования с учетом физиологических особенностей микроорганизмов, доступности сырья, уменьшения времени процесса ферментации, повышения накопления целевого продукта при одновременном снижении накопления побочных веществ.
Выбор методов выделения и очистки основного продукта, а в некоторых случаях и побочных продуктов, представляющих интерес.
Исследование стоков и выбросов, образующихся в результате не только процесса культивирования, но и очистки.
На всех этих этапах методы аналитического контроля играют первостепенную роль.
Так, на первом этапе, когда селекция направлена на повышение уровня целевого продукта, необходимо контролировать его содержание. Наряду с этим необходимы методы оценки ферментов, обеспечивающих биосинтез аминокислот и их предшественников.
На втором этапе оптимизация условий культивирования предусматрива-
8 ет оценку влияния изменения параметров процесса ферментации (величина рН, уровень аэрации, тип и концентрации субстратов) на накопление основной и побочных аминокислот.
На третьем этапе необходим контроль за степенью извлечения основной аминокислоты из культуральной жидкости (КЖ) и содержанием в ней примесей.
Наконец, на четвертом этапе важной задачей является определение компонентов жидких стоков, пригодных для утилизации.
КЖ штаммов-продуцентов аминокислот представляют собой сложные смеси, содержащие компоненты исходной питательной среды; продукты их модификации, образующиеся в процессе стерилизации; клетки микроорганизмов, их фрагменты; высокомолекулярные соединения (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и т. д.); низкомолекулярные соединения (аминокислоты, олигонуклеотиды, углеводы, окси- и кетокислоты и т. д.); продукты неэнзима-тических процессов, протекающих при ферментации (пигменты, основания Шиффа и т. д.); а также неорганические соединения, главным образом различные соли, входящие в состав питательных сред. Анализ КЖ дополнительно усложняется тем. что на фоне водной матрицы общее содержание органических веществ может достигать 30%.
Вследствие того, что объекты для определения состава АК ( биологические и культуральные жидкости, фармацевтические препараты и т.п.) очень сложны, анализировать их с помощью таких физико-химических методов, как спектрофотометрия,спектрофлуореметрия, ЯМР и др. является практически невозможным. Ферметативные методы анализа также не всегда обеспечивают получение достоверных результатов. Частичное разделение на группы их компонентов с помощью отгонки, экстракции и высаливания приводит к увеличению времени, стоимости анализа и зачастую к малодостоверным результатам. Вследствие этого при анализе аминокислот большое значение приобретают хроматографические методы, которые обеспечивают частичное фракциониро-
9 вание исследуемой пробы непосредственно в процессе анализа. Кроме того, при использовании хроматографических методов, как правило, удается добиться не только отделения аминокислот от сопутствую-щихкомпонентов, обладающих близкими свойствами и характеристиками, но и их количественного определения.
Основными требованиями, предъявляемыми к хроматографическим методам для анализа АК, на наш взгляд, являются следующие: - простота -экспрессность надежность достоверность дешивизна.
Простота и быстрота метода обеспечивают его массовое использование, особенно при клинических и лабораторных исследованиях, а также в условиях производства; неточность и ненадежность метода, вообще не должны подлежать рассмотрению, а дороговизна метода сильно ограничивает возможности. Возвращаясь к вопросу о достоверности и надежности метода, следует отметить, что требования, предъявляемые к аналитической хроматографии, например, в биохимии и биотехнологии существенно различаются. Так, в биохимии подходящим считается метод, обеспечивающий ошибку не более 15% и воспроизводимость 90% [6]. Аналогичные требования предъявляются к хроматографическим методам на стадии создания штаммов-продуцентов амнокислот. Однако, на этапе оптимизации процесса ферментации необходима более высокая точность анализа - ошибка не должна превышать 3%. То же самое требование предъявляется к аналитической хроматографии при разработке стадии выделения и очистки основной аминокислоты, поскольку 10-15 процентная ошибка может привести к выпуску препарата недостаточной чистоты или чрезмерно высоким потерям на этой стадии, что неприемлемо в условиях крупнотоннажного производства. Так, например, на Бердском биохимическом
10 заводе (г. Бердск, Новосибирская область) для производства лизина используются ферментеры емкостью 100 м3.
Хроматографические методы, которые применяются, а также которые мы собираемся использовать для разделения и количественного определения аминокислот, будут рассмотрены в литературном обзоре.
2. Литературный обзор.
Выбор хроматографического метода для количественного определения аминокислот
Как уже отмечалось во введении, основные требования к хроматографи-ческим методам для анализа аминокислот обусловливаются их пригодностью для выполнения массовых анализов, простотой аппаратурного исполнения, экономичностью и обеспечением высокой точности результатов анализа (ошибка определения не более 3%).
К таким методам можно отнести: разделение на ионообменной колонке с послеколоночной обработкой нингидрином и фотометрическим детектированием (аминокислотный анализатор); газо-жидкостную хроматографию; бумажную хроматографию; высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ); высокоэффективную тонкослойную хроматографию (ВЭТСХ).
Аминокислотный анализатор обычно рассматривают как наиболее надежный прибор для анализа аминокислотного состава, однако его массовому применению препятствует длительность анализа (около 1 часа на один образец), высокая стоимость не только самого прибора, но и колонок к нему. Так, например, стоимость специальных ионообменных колонок повышенной емкости, выпускаемых фирмой "Hitachi (Япония), позволяющих вводить пробу без предварительной подготовки, составляет 30 000 дол. США. Тем не менее, крупные зарубежные фирмы-производители аминокислот в своих исследовательских и прикладных работах широко применяют аминокислотные анализаторы [7, 8], что, по нашему мнению, обусловлено возможностью прямого ввода образца, то есть без предварительной пробоподготовки. К сожалению, столь дорогостоящий метод для наших научных и прикладных (особенно в промышленных условиях) работ не доступен, в связи с этим хотелось бы рассмотреть возможности других видов аналитической хроматографии для выполнения поставленных перед нами задач.
Известно, что большинство низкомолекулярных природных соединений, таких как аминокислоты, углеводы, нуклеозиды и некоторые витамины можно перевести в соответствующие летучие производные, пригодные для газохро-матографического анализа. Для анализа аминокислот этот метод использовался в 60-70 годах [9], однако сам анализ при этом существенно усложняется, удлинняется во времени и становится дороже за счет процесса подготовки проб, при этом снижается достоверность результатов. Тем не менее, даже в середине 90і годов был опубликован ряд работ по газохроматографическому определению аминокислот в виде летучих производных [10-13]. Процесс получения этих производных сложен, трудоемок, связан с использованием высокоактивных дериватизирую-щих реагентов, причем далеко не всегда обеспечивается количественный выход. Таким образом, по нашему мнению, газожидкостную хроматографию целесообразно применять для анализа летучих веществ, а не для аминокислот или нуклеозидов.
Бумажная хроматография - недорогой и массовый метод анализа. Необходимо отметить, что в 70 -80 г. г. он широко применялся для анализа аминокислот в отечественной микробиологической промышленности [14, 15]. Однако, для анализа текущей концентрации аминокислот в процессе биосинтеза его использовать было нельзя, так как время анализа составляло 35-40 часов, то есть 50% времени, в среднем затраченного на проведение ферментации [15]. Этот метод использовали только для определения сливных концентраций аминокислот. К другим недостаткам бумажной хроматографии можно отнести большой расход растворителей, раствора нингидринового реактива, содержащего катионы кадмия и обладающего высокой токсичностью и канцерогенно-стью, а также еще и тем, что практически все операции выполнялись вручную.
Высокоэффективная жидкостная (ВЭЖХ) и высокоэффективная тонкое 13 лойная хроматография (ВЭТСХ) нашли широкое применение для определения аминокислот во многих областях исследований (биохимия, медицина, пищевая промышленность и т.д.) [16-17], поэтому на сравнении возможностей этих двух методов хотелось бы остановиться более подробно.
ВЭТСХ представляет собой разновидность жидкостной хроматографии, реализуемой на плоскости сорбента, нанесенного на подложку. Иначе говоря, пластинку можно себе представить как открытую колонку. В ВЭТСХ поток растворителя по поверхности сорбента обусловлен действием капиллярных сил (кроме установок "Хром-Пресс" [18]), в то время, как в случае ВЭЖХ движение элюента обусловлено перепадом давлений на входе и выходе колонки. Между ВЭТСХ и ВЭЖХ существует и много других существенных различий. Так, с помощью метода ВЭТСХ одновременно можно анализировать несколько образцов [72 образца на одной хроматограмме (20x20 см) с применением горизонтальной камеры, например, фирмы "Camag" (Швейца-рия)[19]].
Система разделения в ВЭТСХ, как отмечалось выше, открытая. В случае ВЭЖХ - закрытая. В ВЭТСХ используется статическое обнаружение компо-нентов исследуемой смеси, имеющее более широкие возможности, чем в случае ВЭЖХ, где используется динамическое детектирование, ограниченное до минимума выбором детекторов. Учитывая изложенное, хотелось бы рассмотреть некоторые достоинства и недостатки методов ВЭЖХ и ВЭТСХ. К достоинствам метода ВЭЖ X можно отнести следующие: -обеспечение высокой разрешающей способности, которую в большинстве случаев не удается достичь в ВЭТСХ; - возможность унификации разделения на привитых фазах; - необходимость контроля за меньшим числом параметров; - независимость процесса разделения от относительной влажности воздуха и температуры; - легкость обеспечения градиентного элюирования;
Приготовление растворов стандартных образцов аминокислот, проб плазмы крови и пробКЖ
62,5 мг гомосерина, серина, треонина, лизина, орнитина, аргинина, вали-на, лейцина, изолейцина и гомосерина (точная навеска) и ф.взвешивали в мерной колбе объемом 25,0 мл, растворяли в 30%-ном этиловом спирте, объем доводили до метки и тщательно перемешивали (раствор Sb концентрация 2,5 мг/мл). Из этого раствора готовили растворы с концентрациями 1,25 мг/мл (раствор S4); 0,5 мг/мл (раствор S3); 0,25 мг/мл (раствор S2) и 0,125 мг/мл (раствор Si).
125 мг триптофана и фенилаланина (точная навеска) взвешивали в мерной колбе объемом 25,0 мл, растворяли в 30%-ном этиловом спирте, объем доводили до метки и тщательно перемешивали (раствор S5 , концентрация 5,0 мг/мл). Из этого раствора готовили растворы с концентрациями 3,0 мг/мл (раствор S4); 2,0 мг/мл (раствор S3); 1,0 мг/мл (раствор S2); 0,5 мг/мл (раствор Si). Растворы S4- Si приготовляли в 30%-ном водном этиловом спирте. Стандартные растворы хранили в холодильнике при температуре не выше +5С. Растворы устойчивы в течение 3 недель. Для предотвращения микробного заражения в каждый из растворов добавляли по 10 мкл хлороформа с помощью полуавтоматической пипетки Р-20. Пробы КЖ исследуемых аминокислот тщательно перемешивали, отбирали аликвоты по 1,0 мл, центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15-20 мин. надосадочную жидкость разбавляли 30%-ным водным этиловым спиртом, таким образом, чтобы концентрации исследуемых аминокислот (кроме триптофана и фенилаланина) в подготовленных пробах (UN) находились бы в пределах от 0,125 до 2,5 мг/мл.
Пробы КЖ штаммов-продуцентов триптофана и фенилаланина тщательно перемешивали, отбирали аликвоты по 1,0 мл, центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15-20 мин. Надосадочную жидкость разбавляли 30%-ным водным этиловым спиртом таким образом, чтобы концентрация триптофана и фенилаланина в приготовленных пробах (UN) находилась бы в пределах от 0.5 до 5,0 мг/мл.
Анализ проб (UN) проводили в день приготовления. Приготовление нативной сыворотки крови осуществляли следующим образом. Пробы плазмы крови депротеинезировали , смешивая с метиловым спиртом в соотношении 1:2, тщательно перемешивали и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10-15 мин. Для анализа использовали надосадочную жидкость (водно-спиртовой элюат), которую хранили в холодильнгике при температуре от 0 до 4С.
ТСХ пластинки промывали смесью хлороформ-метанол (1:1, v/v) методом восходящего элюирования (15-20 мин.). Пластинки высушивали в течение 10 мин. (вытяжной шкаф) при комнатной температуре и активировали в течение 30 мин. при 110-115 С в сушильном шкафу. Активирование осуществляли непосредственно перед нанесением. Хранение активированных пластинок допускается только в вакуумных эксикаторах.
В работе использовали следующие подвижные фазы: "А" - пропанол-2 - ацетон - 25%-ный водный аммиак- вода [(19,0-27,0): (20,0-26,0): (3,0-6,5): (6,0-10,0), v/v]; "Б"- хлороформ - 96%-ный этанол - лед. уксусная кислота - вода [(23,0-27,0): (13,5-16,0): (4,5-6,5): (1,3-3,5), v/v]; "В": пропанол-2 - этилацетат - 25%-ный водный аммиак - вода (30 : 10 : 3,5 : 10, v/v); "Г": пропанол-1 - 25% водный аммиак - вода [(3,3-4,1) : (0,9-1,5) : (7,5-9,0), v/v] "Д" хлороформ - 96%-ный этанол - лед. уксусная кислота - вода [(52,5-54,0) : (26,0-27,5): (8,9-9,6): (3,5-4,2), v/v]; "Е" пропанол-2 - ацетон - этилацетат - 25%-ный водный аммиак - вода (20 : 15 :7:9: 5, v/v); "Ж"- пропанол-2 - этилацетат - 25%-ный водный аммиак - вода (20 : 20 : 1,5 : 25,0, v/v); "3"- пропанол-2 - 25%-ный водный аммиак (7 : 3, v/v); "И" - пропанол-2 - 25%-ный водный аммиак (55 : 45, v/v); "Км - трет-амиловый спирт - бутанон-2 - вода (110 : 30 : 25);
Для приготовления этих подвижных фаз точный объем каждого из компонентов индивидуальной элюирующей системы (А -К) добавляли в цилиндр емкостью 100 мл с притертой пробкой и тщательно перемешивали .
Хроматографическую камеру обкладывали по внутренним стенкам фильтровальной бумагой таким образом, чтобы нижняя часть бумаги касалась дн камеры. Затем в зависимости от поставленной задачи в камеру добавляли одну из ситем (А -К) (см. раздел 3.5), смачивая при этом фильтровальную бумагу на стенках камеры. Уровень подвижной фазы на дне камеры должен быть не менее 1,0 мм и не более 5,0 мм. Насыщение камеры от 1,0 до 2,5 часов в зависимости от поставленной задачи (вытяжной шкаф!).
Хроматографический комплекс для количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии
Задачей наших исследований было создание полного хроматографического комплекса оборудования для количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии.
В соавторстве с группой ученых Института высокомолекулярных соединений был разработан состав для получения прочного, однородного, равномерного по толщине, эффективного хроматографического слоя пластин для тонкослойной хроматографии. В состав слоя входят фракционированный си-ликагель КСКГ [(26,7-28,1), масс.%], силиказоль в качестве связующего материала [(2,4-2,8), масс %] и дистиллированная вода (остальное). Для обнаружения соединений, поглощающих в УФ-области спектра, в слой дополнительно вводится люминофор К-35 (как правило, 3-5 % от веса силикагеля), величина размера частиц которого должна быть меньше размера частиц силикагеля. Для исключения расслоения частиц силикагеля и люминофора по толщине слоя добавляли к суспензии с силиказолем полимер-стабилизатор полиакриламид с молекулярной массой от 2x106 до 20x106 . В результате состав слоя с ультрафиолетовой добавкой включает силикагель КСКГ [(26,7-28,1), масс.%], силиказоль [(2,4-2,8), масс %], полиакриламид [(6,2-12,1)х10 3, масс.%], люминофор [(0,8-1,4), масс %] и остальное дистиллированная вода [203]. Влияние состава для получения хроматографического слоя на характеристики пластин представлены в Таблица 4-1. Эффективность рассчитана для красителя "Судан-1", элюент - толуол, по формуле лг Rs Rf N = , где н N - число теоретических тарелок; Rs - высота подъема элюента; Rf - отношение расстояния центра пятна от точки старта к расстоянию фронта растворителя от старта; Н - высота, эквивалентная теоретической тарелке. Чувствительность детектирования определялась по ФТГ-метионину в м кг/пятно.
Достоинства силикагелевых слоев с силиказолевым связующим заключаются в следующем:
Во-первых, силиказоль в процессе получения слоя преврящается в крупнопористый силикагель [204], и тем самым, химическая природа сорбента и связующего становятся одинаковой.
Во-вторых, химическая стойкость силикагеля позволяет применять агрессивные реагенты для детектирования платин, а также регенерировать пластины в горячей хромовой смеси с целью их многократного использования
В-третьих, механическая прочность слоя силикагеля КСКГ с силикатным связующим обеспечивает возможность их многократного использования, но в то же время, в случае необходимости, сорбент с разделенным веществом может быть удален с пластины для элюирования и последующего анализа. Данный состав позволил повысить разделительную способность пластин для ТСХ и был использован в разработке и внедрении технологии получения аналитических и высокоэффективных пластин на стеклянных, полимерных (поли-этилентерефталат) и металлических (алюминиевая фольга) подложках в 1988-1989 гг.
Разработано оборудование, позволяющее провести все этапы современной тонкослойной хроматографии: - дозировка и нанесение проб; - осуществление процесса хроматографии; - УФ-обнаружение; - детектирование (окрашивание) хроматограмм; - количественная обработка хроматограмм.
Сконструированы трафареты из инертных материалов, служащие для разметки стартовых зон на ТСХ-пластинах размером 10x10 и 15x15 сантиметров, соответственно.
Разработаны стеклянные тарированные капилляры, дозирующие растворы наносимых проб способом нанесения полного объема: 1, 2, 3, 5, 10 мкл.
Для достижения полного перенесения объема пробы из капилляра на пластинку создано устройство, названное "Микрокап", которое не только является удобным держателем для капилляров, но и с помощью специальной резиновой "Груши" помогает полностью набирать и полностью переносить содержимое капилляра на хроматографический слой.
Шприцевой дозатор, работающий в комплекте с микрошприцем У=1мкл (аналог РВ-600 фирмы Hamilton), предназначен для многократной дозировки микроколичеств жидкости (рис. 4-2). При помощи шприцевого дозатора обеспечивается пятидесятикратное повторение дозы наносимого вещества (50 шагов). Для микрошприцев с рабочим объемом 1 мкл каждый шаг дозатора отмерит 0,02±0,0005 мкл жидкости. Это приспособление необходимо использовать для нанесения исследуемых растворов веществ, хроматограммы разделения которых в дальнейшем будут подвергаться количественной обработке методом денситометрии.
Для быстрого удаления со слоя пластинок растворителя из зон с нанесенными пробами исследуемых образцов разработан термостатируемый столик с цифровой индикацией температуры (максимальная температура рабочей поверхности - 80 С; точность поддержания температуры рабочей поверхности - ± 2 С; максимально допустимый перепад температур на рабочей поверхности - 5 С; максимальное время установления температуры на рабочей поверхности - 15 мин.; исполнение в соответствии с ГОСТ 15150-69) (рис. 4-3) Использование этого прибора дает возможность получения компактных пятен стартовых зон (1 -3 мм), что небходимо для эффективного разделения многокомпонентных смесей на хроматограммах.
Для процедуры элюирования в условиях полного или частичного насыщения парами растворителя созданы классические стандартные хроматогра-фические камеры с идеально плоским дном и притертой крышкой. Выбран оптимальный размер этих емкостей, что дает возможность использовать минимальный объем (около 10 мл) потребляемых растворителей в процессе работы. Размер камер предназначен для работы со стандартными пластинками размером 10x10 и 15x15 см (рис.4-4).
Для постхроматографической дериватизации созданы следующие приспособления:
Мелкодиспергирующий стеклянный пульверизатор для агрессивных жидкостей. Благодаря конструктивным особенностям, пульверизатор безопасен при работе с агрессивными (н-р, концентрированные кислоты и щелочи, концерогенные вещества) реагентами; Выдавливание окрашивающих реаген тов происходит при помощи сжатого воздуха, либо при использовании небольших компрессоров (рис. 4-5)
Выбор метода нанесения обнаруживающего реагента на хроматограмму для визуализации пятен аминокислот
Повторные обмеры одной и той же пластинки позволят отделить вариации результата, вносимые аппаратурой, от погрешностей хроматографии.
Условия повторных обмеров могут выбираться со смещением пластинки в последующих обмерах относительно ее положения в предыдущих обмерах, либо с фиксированным положением. В первом случае будет добавляться погрешность неравномерности параметров светочувствительного поля.
Порядок обмера пластинки. При оценке погрешности можно производить обмер, беря разные группы в качестве калибровочных значений и в качестве предполагаемой неизвестной. V ср Здесь Vcp- средний объем по группе пятен с одним значением концентрации.
На Рис. 4-16 изображен примерный вид результатов обмера хромато-граммы, содержащей 4 группы пятен (т.е. 4 концентрации), а также возможный вид калибровочных прямых при выборе разных пар точек в качестве калибровочных.
В предлагаемой методике поверки в качестве рабочих калибровочных берутся две точки, наиболее близкие к экспериментальной. Так, например, ее ли 2 - экспериментальная группа (т.е. группа пятен с неизвестной концентрацией), то строится и используется калибровочная прямая 1 - 3. Если 1 - экспериментальная группа, то строится и используется калибровочная прямая 2 - 3, и т.д.
При тестовых обмерах концентрации для всех групп известны, и выбор тон или иной группы в качестве "экспериментальной" позволит получить нужную информацию.
Если в качестве экспериментальной берем самую слабую группу - это позволяет оценить чувствительность.
Если в качестве экспериментальной берем группу 2, а в качестве калибровочных берем сначала 1 - 3, а затем 1-4, то, возможно, удастся оценить наличие (и величину) нелинейности. Методика автоматизированной оценки ошибки обмера в программе обработки видеоденситометра «ДенСкан».
Видеоденситометры серии «ДенСкан» представляют собой системы обработки двумерных изображений, и этим существенно отличаются от щелевых сканирующих денситометров, которые осуществляют одномерное сканирование по прямолинейной траектории, пересекающей хроматографические объекты (пятна). Денситометр с одномерным (линейным) сканированием не в полной мере (или никак не) учитывает распределение вещества в пятне в направлении «поперек» трека, а, поскольку интегрирование оптического сигнала в одномерном сканирующем денситометре происходит только в области, определяемой шириной щели, то оценка «мощности» пятна может существенно зависеть от соотношения ширины щели и ширины пятна. В том случае, если ширина пятна существенно превосходит ширину щели, периферийные области пятна в стороне от трека оказываются «неучтенными». В том случае, если формы разных пятен не являются подобными («хвосты», кольцеобразные пятна и т.п.), одномерное сканирование может давать существенные методические ошибки. Видеоденситометр обеспечивает «растровое» сканирование, при обмере способен учесть все точки объекта, поэтому соответствующая методическая компонента ошибки в этом классе приборов может быть сделана существенно меньшей.
Количественная оценка пятна в видеоденситометрах происходит по двум его характеристикам: по площади пятна и его «объему» в пространстве, в качестве третьей координаты используется яркость (интенсивность окраски) пятна-см. Рис. 4-17
Определение, как объема, так и площади пятна зависит от того, как проведена «базовая поверхность» образующая нижнюю границу оцениваемого объема. Программа обмера в растовых видеоденситометрах «ДенСкан» проводит базовую поверхность, анализируя значения яркостей пластины в некоторой области вокруг (вблизи) пятна.
Для этого она для каждого пятна формирует локальные границы таким образом, чтобы площадь локальной области превышала прогнозируемую площадь пятна не менее чем в 8... 10 раз. По фоновым точкам (т.е. не принадлежащим пятну) производится оценка положения базовой поверхности.
