Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1 Боковой амиотрофический склероз (БАС)
1.1.1Клеточная терапия бокового амиотрофического склероза
1.1.2 Генная терапия бокового амиотрофического склероза 24
1.2 Вирусные векторы для доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот 32
1.2.1 Аденовирусы 33
1.2.2. Адено-ассоциированные вирусы 37
1.2.3. Векторы на основе вируса простого герпеса (Herpes Simplex) 39
1.2.4 Лентивирусы 40
1.3Плазмидные векторы для переноса рекомбинантных нуклеиновых кислот
1.4 Стратегии ко-экспрессии генов 44
1.4.1. Сайты внутреннего встраивания в рибосому (IRES) 45
1.4.2. Двунаправленные промоторы 48
1.4.3. 2А-пептидные последовательности пикорновирусов 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 58
2.1 Получение рекомбинантного аденовируса с использованием технологии клонирования Gateway 59
2.1.1. ПЦР-амплификация 59
2.1.2 Клонирование продукта амплификации VEGF-FuP2A-FGF2 в плазмидный вектор pDONR221 (Invitrogen) 59
2.1.3. Получение экспрессионной конструкции pAd/CMV/V5-Dest 64
2.1.4 Получение рекомбинантного аденовируса ко-экспрессирующего гены vegf165 и fgf2 65
2.2 Получение мультицистронной конструкции на основе плазмиды pEGFP N2, ко-экспрессирующей гены vegf165 и fgf2 69
2.2.1 Клонирование ПЦР-продуктов в плазмидные векторы pJET1.2/blunt и pEGFP-N2 70
2.3 Исследование ко-экспрессии генов vegf, fgf2 в составе экспрессионных плазмидных конструкций in vitro 73
2.3.1 Генетическая модификация культуры клеток HEK293T рекомбинантной плазмидной ДНК pAd-VEGF165-FuP2A-FGF2 и pVEGF165-FuP2A-FGF2 P2A-EGFP 74
2.3.2. Иммунофлуоресцентный анализ генетически модифицированных клеток 74
2.3.3. Оценка биосинтеза белка in vitro методом иммуноблоттинга 75
2.4 Исследование иммуногенности 2А-пептидных препаратов 77
2.4.1.Получение антител к 2А-пептиду 78
2.4.2 Иммуноферментный анализ 79
2.5 Исследование ко-экспрессии генов vegf165 и fgf2 на экспериментальной модели животных, моделирующих фенотип бокового амиотрофического склероза 80
2.5.1 Выделение и генетическая модификация мононуклеарных клеток из пуповинной крови человека 81
2.5.2 82 Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток трансгенным мышам, модулирующих фенотип бокового амиотрофического склероза 82
2.5.3 Иммуногистохимический анализ экспрессии белков VEGF и FGF2 in vivo 83
ГЛАВА 3. Результаты исследований 85
3.1 Создание мультицистронной аденовирусной конструкции, содержащей кДНК генов vegf165 и fgf2 85
3.1.2. Получение рекомбинантного аденовируса Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2
3.1.3 Создание мультицистронной плазмидной конструкции, содержащей кДНК генов vegf165 и fgf2 92
3.2 Исследование ко-экспрессии, биосинтеза и ко-трансляционного расщепление рекомбинантных белков VEGF165 и FGF2 в первичных и иммортализованных культурах клеток человека 94
3.2.1 Исследование ко-экспрессии генов VEGF165 и FGF2 в генетически модифицированных первичных и перевиваемых клеточных культурах 94
3.2.2 Количественный анализ уровня экспрессии мРНК генов vegf165 и fgf2 101
3.3.1 Исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков в составе мультицистронной аденовирусной конструкции 104
3.3.2 Исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков VEGF165 и FGF2 в составе плазмидной конструкции in vivo 106
3.4 Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток из пуповинной крови человека трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза 108
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 112
Заключение 124
Выводы 126
Список литературы 127
- Векторы на основе вируса простого герпеса (Herpes Simplex)
- Клонирование продукта амплификации VEGF-FuP2A-FGF2 в плазмидный вектор pDONR221 (Invitrogen)
- Получение рекомбинантного аденовируса Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2
- Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток из пуповинной крови человека трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Развитие методов генодиагностики, энзимодиагностики и научных принципов генной терапии открывают перспективы разработки альтернативных подходов и внедрения в практическую медицину технологий генной и клеточной терапии различных дегенеративых заболеваний человека, приводящих к ранней инвалидизации. Ряд нейродегенеративных заболеваний, в частности, боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, обусловлены нарушением различных биохимических процессов, требующих более детального изучения. Существующие методы лечения вышеуказанных патологий носят паллиативный характер и не способствуют функциональному восстановлению больного, что обусловливает необходимость разработки альтернативных подходов, а также анализа и синтеза биологически активных веществ с дальнейшим выяснением их физиологического действия на организм.
На современном этапе генная терапия предполагает лечение с помощью терапевтических (рекомбинантных) генов человека, обеспечивающих синтез белков взамен собственных дефектных для коррекции биохимических процессов в организме, или, например, синтез дополнительных белков для стимулирования регенерации.
Плазмидные векторы ввиду их биобезопасности активно применяют для
доставки экзогенной ДНК в клетки человека (Pichon et al. // Curr Opin Biotechnol.2010.
Vol. 21, №5). Стандартные и наиболее распространенные техники введения
плазмидных векторов в эукариотические клетки включают электропорацию или
химическую трансфекцию с помощью катионных и/или липофильных
надмолекулярных комплексов. Для лечения некоторых заболеваний наибольший терапевтический эффект может быть достигнут путем экспрессии нескольких терапевтических генов. Однако одновременное введение нескольких плазмид, кодирующих разные гены человека, не гарантирует стабильной ко-экспрессии трансгенов и, соответственно, биосинтеза каждого из белков в клетках-мишенях. В то же время, скоординированный совместный биосинтез рекомбинантных белков важен для создания оптимального тканевого микроокружения при паракринном механизме стимуляции регенерации или аутокринном механизме модуляции фенотипа клеток-мишеней.
Метод генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови
человека двухкассетными плазмидными конструкциями (патент на изобретение РФ
№2431669) оказался эффективным для обеспечения экспрессии мРНК клонированных
генов с последующим биосинтезом рекомбинантных белков in vitro и in vivo.
Трансфекция мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП) плазмидой pBud-Sox2-
Oct4, кодирующей транскрипционные факторы октамер связывающего белка 4 (Oct4)
и Sox2 существенно повышала дифференцировочный потенциал клеток в различные
типы: в эндотелиальные, микроглиальные и, что немаловажно, нейрональные.
Модифицированные мононуклеарные клетки из пуповинной крови,
сверхэкспрессирующие фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и основной фактор роста фибробластов 2 типа (FGF2) при трансфекции плазмидой pBud-VEGF-FGF2, дифференцировались в астроцитоподобные клетки, которые морфологически имели звездчатую форму и экспрессировали характерный маркер астроцитов S100 (HNA+S100+) (Rizvanov et al. // Exp Biol. 2011. Vol.236, №1).
Несмотря на биобезопасность плазмидных векторов, они обладают низкой эффективностью трансфекции in vivo и недолговременной экспрессией трансгенов. Вирусный метод доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот обеспечивает долговременную экспрессию трансгена и стабильную продукцию белковых макромолекул. По данным (февраль 2016 года) интернет-ресурса восемь клинических испытаний с использованием адено-ассоциированных и одно — с использованием лентивирусного векторы для терапии заболеваний ЦНС ведутся в настоящее время или находятся на стадии завершения.
Репликационно-дефектные аденовирусы обладают рядом особенностей,
оптимальных для применения в генной терапии: они способны легко трансдуцировать
различные клеточные типы нервной ткани, в том числе пост-митотические нейроны
мозга; обладают низкой патогенностью и высокой эффективностью экспрессии
рекомбинантных генов; обеспечивают долговременную (2-7 лет) экспрессию
трансгенов (Appaiahgari et al. // Expert Opin Biol Ther. 2015. Vol.15, №3). Для
достижения ко-экспрессии различных трансгенов для терапии бокового
амиотрофического склероза (БАС) ранее нами были разработаны различные
комбинации аденовирусов, кодирующих кДНК генов ncam1, vegf165, gdnf для
модификации МККП и последующей трансплантации трансгенным мышам с
фенотипом БАС. Однако, как и в случае плазмидных векторов, ко-трансдукция клеток
разными вирусными векторами не гарантирует одновременный синтез
рекомбинантных белков в каждой инфицированной клетке. Таким образом, помимо
поиска оптимального вектора-переносчика генетической информации, актуальной
остается проблема выбора эффективной стратегии ко-экспрессии генов. 2А-пептидные
последовательности пикорновирусов широко применяются для обеспечения ко-
экспрессии нескольких генов. Преимущества данной стратегии заключаются в
независимой от типа клеток ко-экспрессии белков, соединенных 2А-пептидной
последовательностью. Несколько полипептидов синтезируется в равном количестве с
одной мРНК под контролем общего промотора, а малый размер 2А-пептида (54-174
п.н.) позволяет значительно экономить генетическую информацию, что важно при
применении векторов с ограниченной пакующей способностью. Однако наличие
дополнительных аминокислотных остатков на С-конце пептида может оказывать
существенное влияние на формирование вторичной и третичной структуры белка, а
также иммуногенные свойства, что является одним из лимитирующих факторов для
клинического применения (de Felipe // Curr Gene Ther. 2002. Vol.2, №3) . Решение
данных проблем откроет дорогу к созданию аденовирусных конструкций, ко-
экспрессирующих различные терапевтические белки посредством 2А-
аминокислотных последовательностей вируса ящура, для генетической модификации
стволовых клеток и разработке новых перспективных методов лечения
нейродегенеративных заболеваний.
Цель работы — определение ко-экспрессии и выявление иммуногенных свойств белков фактора роста эндотелия сосудов и основного фактора роста фибробластов в клетках человека, модифицированных генетическими конструкциями, содержащих 2А-пептидные последовательности пикорновирусов.
В рамках цели диссертационного исследования были поставлены следующие задачи:
1. Создать экспрессионные 2А-пептидные мультицистронные плазмидные и
аденовирусные конструкции, кодирующие белки генов vegf165 и fgf2;
-
Исследовать ко-экспрессию генов, биосинтез и ко-трансляционное расщепление рекомбинантных белков в первичных и иммортализованных культурах клеток человека (эмбриональной линии почки человека, содержащей Т-антиген вируса SV40 (HEK293T); стволовых клетках из жировой ткани человека (СК-ЖТ), фибробластах из кожи человека, в мононуклеарных клетках крови пуповины человека), трансфицированных полученными плазмидными векторами или трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами.
-
Провести анализ иммуногенных свойств рекомбинантных белков в составе мультицистронных плазмидных и аденовирусных векторов на модели лабораторных животных in vivo.
-
Трансдуцировать мононуклеарные клетки крови пуповины человека аденовирусом, ко-экспрессирующим гены vegf и fgf2, соединенные 2А-пептидной последовательностью пикорновирусов, и исследовать биосинтез рекомбинантных белков, выживаемость, миграцию и дифференцировку генетически модифицированных клеток после трансплантации трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза.
Научная новизна. В работе впервые созданы мультицистронные генетические
конструкции с применением 2А-пептидных последовательностей пикорновирусов.
Впервые показано, что разработанные генетические конструкции на основе
плазмидного и аденовирусного векторов обеспечивают одновременную экспрессию
генов и последующий биосинтез фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и основного
фактора роста фибробластов (FGF2). Несомненной новизной обладают данные,
полученные методом иммуноферментного анализа, свидетельствующие об отсутствии
иммунного ответа на 2А-пептидный антиген у лабораторных животных при введении
рекомбинантного аденовируса in vivo. Также впервые получены данные,
свидетельствующие о ко-транскрипции клонированных генов, биосинтезе и ко-
трансляционном расщеплении рекомбинантных белков в генетически
модифицированных клетках, трансфицированных рекомбинантными плазмидными и
аденовирусными генетическими конструкциями.
Принципиально новыми являются данные о способности МККП к трансдукции
полученной конструкцией, о том, что генетически модифицированные клетки
пуповинной крови человека, трансплантированные трансгенным мышам с фенотипом
бокового амиотрофического склероза, выживают, мигрируют в спинной мозг, ко-
экспрессируют рекомбинантные белки и дифференцируются в клетки,
экспрессирующие маркеры астроцитов и шванновских клеток.
Научно-практическая ценность работы. Настоящее исследование
закладывает научные принципы генотерапии с применением 2А-пептидных последовательностей пикорновирусов для обеспечения ко-экспрессии генов и биосинтеза рекомбинантных белков. Данные, полученные в рамках диссертационной работы, имеют практическую ценность для разработки методов генной и генно-клеточной терапии наследственных и приобретенных заболеваний человека.
Исследование иммуногенности 2А-пептидных плазмидных и вирусных векторов демонстрирует биобезопасность и возможность биомедицинского применения разработанных генетических конструкций.
Апробированный метод генетической модификации мононуклеарных клеток крови пуповины человека 2А-пептидными вирусными конструкциями может быть использован для разработки эффективных методов терапии нейродегенеративных заболеваний человека.
Положения выносимые на защиту
-
Рекомбинантный аденовирус, ко-экспрессирующий гены сосудистого эндотелиального фактора роста и основного фактора роста фибробластов, соединенные в одной открытой рамке считывания через фурин-содержащую 2А-пептидную последовательность, обеспечивает биосинтез и ко-трансляционное расщепление рекомбинантных белков в клетках человека in vitro и in vivo.
-
Фурин-содержащие 2А-пептидные плазмидные и аденовирусные векторы не вызывают иммунный ответ на антиген вируса ящура.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на следующих всероссийских и международных симпозиумах, конгрессах и конференциях: Всероссийская студенческая научная конференция памяти академика АН РТ проф. Д.М. Зубаирова (Казань, 2011); XV международная Пущинская школа – конференция молодых ученых (Пущино, 2011); XVI международная Пущинская школа–конференция молодых ученых (Пущино, 2012); V ежегодный симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий (Москва, 2012); международная научная конференция студентов и молодых ученых «Современные теоретические и практические аспекты клинической медицины» (Одесса, 2012); XVII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2012); III международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2013); I научно-практическая конференция студентов и молодых ученых Института фундаментальной медицины и биологии «Современные проблемы фундаментальной медицины и биологии» (Казань, 2013); VI ежегодный международный симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (Москва, 2013); международная научно-практическая конференция «Современные проблемы науки и образования» (Сочи, 2013); международная конференция «Scientific research and their practical application. Modern state and ways of development» (Киев, 2013); международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2014); IV международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и практической медицине» (Казань, 2014); XIX международная Пущинская школа – конференция молодых ученых (Пущино, 2015).
Публикация результатов исследования
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских диссертаций, и 21 тезис докладов на международных и всероссийских конференциях и конгрессах.
Структура и объем диссертационной работы
Материалы диссертационной работы изложены на 157 страницах
машинописного текста. В работе приведено 32 рисунка и 14 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, заключения и списка литературы (263 наименования).
Векторы на основе вируса простого герпеса (Herpes Simplex)
Боковой амиотрофический склероз–нейродегенеративное заболевание, проявляющееся в зрелом возрасте, которое сопровождается гибелью нейронов. На сегодняшний день эффективные методы лечения БАС неизвестны. БАС—многофакторное заболевание, характеризующееся вариабельностью клинических проявлений и гетерогенностью этиологии; сопровождается избирательной дегенерацией мотонейронов, начинается в зрелом возрасте, протекает в течение 1-5 лет с прогрессирующим параличом и заканчивается смертью. (D.W. Cleveland, 1999; M.C. Kiernan et al., 2011).
Наиболее частой формой БАС является спорадическая, которая составляет около 90% случаев. В остальных случаях наблюдается семейная форма. Частота встречаемости заболевания 2-3 случая на 100000 населения (A. Alonso et al., 2009; A. Chio et al., 2009).
Симптомы заболевания включают мышечную слабость и атрофию, совмещенную с прогрессирующим параличом, неминуемо приводящим к смерти, обычно спустя 5 лет после постановки диагноза. Преимущественно встречается спорадическая форма БАС, и лишь 5-10% случаев заболевания генетически обусловлены. (S.H. Appel et al., 2001; J.S. Henkel et al., 2009)
Однако несмотря на значимый прогресс в развитии теории, объясняющей генетическую природу бокового амиотрофического склероза, механизм, обуславливающий развитие БАС в случае спорадической формы, остается неизвестным (P.M. Andersen et al., 2011). Патогенетические механизмы, способствующие развитию болезни, включают эксайтотоксичность, окислительный стресс, образование белковых агрегатов, разобщенную функцию митохондрий и метаболизма РНК, а также нарушения аксонного транспорта (L. Ferraiuolo et al., 2011). Эти процессы зачастую строго компартментализованы и отличаются своей активностью в перикарионе, нервных отростках и нервных окончаниях. Примечательно, что при БАС и других нейродегенеративных заболеваниях чаще всего первыми поражаются аксоны и синапсы (L.M. Murray et al., 2010). Таким образом, ввиду избирательной уязвимости аксонов и синапсов изучение генетических механизмов развития БАС обещает предоставить не только ценную информацию о механизмах патогенеза, но и об арсенале терапевтических мишеней при раннем вмешательстве. По результатам растущего количества исследований в области генетики решающую роль в патогенезе БАС играют белки, связанные с РНК, например, TDP-43 и FUS (fused in sarcoma) (T.J. Kwiatkowski, Jr. et al., 2009; J. Sreedharan et al., 2008; C. Vance et al., 2009). FUS преимущественно локализуется в ядре и мигрирует между ядром и цитоплазмой (H. Zinszner et al., 1997). Данный белок участвует в сплайсинге мРНК и транспорте (C. Lagierourenne et al., 2010). Наибольшее количество FUS-мутаций, приводящих к развитию БАС, случается в N-концевом участке, отвечающего за сигнальную последовательность и ядерную локализацию. Эти мутации приводят к аберрантной локализации белка в цитозоле. (D. Dormann et al., 2010; D. Ito et al., 2011). Хотя механизмы заболевания, в основе которых лежат FUS-мутации, в основном, остаются неясными, было показано, что мутантная форма белка приводит к цитотоксичности у дрожжей и индуцирует формирование гранул стресса в клетках Danio rerio (S. Ju et al., 2011; Z. Sun et al., 2011). Такие важные вопросы как состав мутантных FUS-агрегатов и патогенетическая роль, а также влияние мутаций на физиологические функции, остаются открытыми. Интересная взаимосвязь между метаболизмом РНК и БАС также наблюдается и у других белков, связанных с РНК, в частности, у белка, обеспечивающего выживание двигательных нейронов (survival motor neuron protein – SMN). Мутации гена SMN вызывают другое заболевание двигательных нейронов—спинальную мышечную атрофию (spinal muscular atrophy – SMA, СМА). Пониженное количество SMN-белка у пациентов со СМА, а также в экспериментальных моделях in vitro и in vivo, приводит к различным дефектам аксонов и синапсов. Примечательно, что и генетика человека, и данные экспериментов свидетельствуют о вовлечении SMN 19 белка в патогенез БАС (E.J. Groen et al., 2013; T. Yamazaki et al., 2012), что предполагает частичное совпадение в механизмах БАС и СМА.
Белок SMN напрямую взаимодействует с FUS-белком, причем мутантные FUS-агрегаты ко-локализуются с белком SMN в перикарионах нейронов. Перераспределение SMN в сторону к FUS- агрегатам приводит к снижению количества белка SMN в аксонах. Поразительно, экспрессия мутантных форм FUS-белка и снижение уровня синтеза белка SMN в аксонах формирует схожие фенотипы у аксонов. Гиперэкспрессия полномерной формы SMN или С-терминального фрагмента SMN, опосредующего функционирование SMN-белка в аксонах, нивелирует дефекты аксонов, вызванные мутантной формой FUS-белка, тем самым демонстрируя функциональную взаимосвязь между мутантной формой FUS и SMN-белков.
Наиболее распространённая семейная форма БАС вызвана мутациями в конститутивном гене супероксид дисмутазы 1 (SOD1). Было обнаружено более 115 мутаций, являющихся причиной заболевания; они затрагивают все участки гена. При изучении моделей БАС у грызунов некоторых из мутаций в SOD1 было выявлено следующее – SOD1-опосредованная форма заболевания связана не с потерей активности дисмутазы, а с появлением токсических особенностей (L.I. Bruijn et al., 1998; A.G. Reaume et al., 1996). Первые указания на то, что митохондрии могут способствовать развитию заболевания, появились исходя из данных гистологического анализа, свидетельствующих о нарушении ультраструктуры митохондрий в мотонейронах при спорадической и наследственной форме БАС (A. Hirano et al., 1984; S. Sasaki et al., 2007; S. Sasaki et al., 1996). Аналогичные данные об измении морфологии были позднее получены при изучении митохондрий у животных с мутацией в гене sod1(M. Salehi et al., 2015).
Хотя SOD1—высоко экспрессирующийся цитозольный белок, часть SOD1 локализована в межмембранном пространстве митохондрий дрожжей (L.S. Field et al., 2003) и в клетках печени у крыс (A. Okado-Matsumoto et al., 2001). Для головного и спинного мозга данные по локализации мутантной формы белка SOD1 противоречивы. Имеются данные, что большинство митохондрия-ассоциированных, дисмутаза-неактивных мутантов связано с цитоплазматической поверхностью, в то время как дисмутаза-активные мутантные формы ассоциированы на поверхности митохондрий и в межмембранном пространстве (J. Liu et al., 2004).
Избирательная ассоциация мутантной формы супероксид-дисмутазы, не подвергшейся фолдингу, с мембранами митохондрий в нейронах спинного мозга подтверждает тот факт, что природа связи мутантной формы SOD1 с митохондриями неодинакова во всех тканях. Данный феномен указывает на тканеспецифичный, уникальный состав шаперонов, уникальные компоненты на поверхности мембраны митохондрий, или образования незрелой формы белка SOD1, уникальные для спинного мозга, и обладающие селективной аффинностью к мембранам митохондрий. Ряд исследований определяет взаимодействие амилоидогенных белков с клеточной мембраной в качестве главной мишени, влияющей на токсичность и мембранную проницаемость. Также в литературе имеются данные относительно связывания и накопления агрегатов белка SOD1 на мембране митохондрий у трансгенных мышей с фенотипом БАС (J. Liu, et al., 2004). Несмотря на обширные исследования, точный механизм патогенеза, связанный с агрегацией SOD1 и влиянием агрегатных форм белка на заболевание у человека неизвестны.
Клонирование продукта амплификации VEGF-FuP2A-FGF2 в плазмидный вектор pDONR221 (Invitrogen)
Для получения рекомбинантного аденовируса необходимо плазмидную ДНК pAd-VEGF165-FuP2A-FGF2 перевести из кольцевой формы в линейную с помощью эндонуклеазы рестрикции PacI. Расщепление векторы способствует взаимодействию левого и правого ITRs и удалению бактериальных последовательностей (а именно, участка начала репликации pUC и гена резистентности к ампициллину). Упаковка и репликация рекомбинантного аденовируса происходят в клетках линии HEK293A. Для реакции использовали 5 мкг плазмидного векторы pAd-VEGF165-FuP2A 66 FGF2. Реакционную смесь инкубировали в термостате в 3 часов при 37 С. Состав реакционной смеси представлен в таблице 8. Таблица 8 - Состав реакционной смеси для рестрикции Компоненты реакции Объем, мкл Фермент PacI (Thermoscientific) 1 10X буфер PacI (Thermoscientific) 5 Плазмидная ДНК (5 мкг) 20 mQ H2Q 15 Всего 50 Линеаризованную плазмидную ДНК очищали на колонке с использованием набора EZ-10 Spin column PCR Clean Up kit (BioBasic, США) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Очищенной плазмидной ДНК трансфицировали клетки HEK293A по методике, описанной ранее. Через каждые 48 часов производили замену среды на свежую до достижения цитопатического эффекта, который сопровождается изменением морфологии клеток (клетки округляются и открепляются от культурального планшета) и свидетельствует об эффективной вирусной продукции. Клетки соскребали в чистую 15 мл пробирку и подвергали нескольким циклам замораживания-оттаивания с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и фильтрации через поры 0,22 мкм. Грубый вирусный сток хранили при -80С. Амплификация и ультрацентрифугирование аденовируса Ad5 VEGF165-FuP2A-FGF2 Для получения препаративного количества рекомбинантного аденовируса Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2 проводили амплификацию вируса с последующим ультрацентрифугированием в градиенте хлорида цезия. Культуру клеток HEK293A высевали на 3 культуральные чашки (d=10 см) и культивировали по ранее описанной методике. При достижении монослоя 70% клетки инфицировали ранее полученным вирусным стоком. По достижении цитопатического эффекта суспензию клеток собирали в 15 мл пробирки и проводили несколько циклов замораживания-оттаивания с последующей фильтрацией. Очищенный супернатант использовали для концентрирования вирусных частиц.
Необходимые растворы: 10мМ HEPES (1,3 г HEPES в 500 мл дистиллированной воды); 2,2M CsCl (38г CsCl в 100 мл 10 мМ HEPES); 4,0 M CsCl (67г CsCl в 100 мл 10 мМ HEPES), насыщенный раствор CsCl (67г CsCl в 50 мл 10 мМ HEPES)
На 1 этапе центрифугирования использовали пробирки SW28 (Beckman). Для уменьшения поверхностного натяжения и для оптимального нанесения хлорида цезия внутреннюю часть пробирки обработали раствором БСА. Аккуратно наносили раствор 4,0 М CsCl (10 мл), затем 2,2М CsCl (5 мл), формируя градиент. В завершение наносили 20 мл очищенного вирусного лизата. Центрифугировали в ультрацентрифуге при 25000 об/мин в течение ночи при 4 С. После центрифугирования была обнаружена вирусная полоса между слоями 4М и 2,2 М хлорида цезия. Чтобы получить первичную фракцию вируса, вставляли иглу 21G непосредственно в пробирку около 0,5 см ниже белой вирусной полосы и получили 2,5 мл вируса (рисунок 5).
Получение первичной фракции аденовируса Смешивали 2,5 мл вируса с 2,5 мл насыщенного раствора CsCl. В пробирку SW41, предварительно обработанную БСА, последовательно наносили смесь вируса с насыщенным раствором хлорида цезия (5 мл), далее наносили 2мл 4М CsCl, затем 4 мл 2,2 CsCl. Центрифугировали при 35000 об/мин. в течение ночи при +4С. После центрифугирования, обнаруживали вирусную фракцию в середине слоя 2,2 М хлорида цезия. С помощью шприца вытягивали вирус и переносили в 1,5 мл пробирку.
Диализ аденовируса и определение вирусного титра Для последующих экспериментов in vivo необходима очистка аденовируса от ионов цезия путем диализа. Сначала диализную мембрану с размером пор 12 кДа кипятили в течение 10 мин в дистиллированной воде, после чего натягивали мембрану натягивали на 1,5 мл пробирку, содержащей 500 мкл концентрированного вируса. Аденовирус диализовали против фосфатно-солевого буфера в течение 2 часов при температуре +4С, после чего заменяли раствор на свежий. Второй этап диализа проводили 16 часов при тех же условиях.
Диализованный аденовирус использовали для определения вирусного титра и последующих опытов на животных. Титрование аденовирусов по оптической плотности Первоначально титр аденовируса Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2 определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 при оптической плотности 260 нм. Предварительно смешивали 10 мкл диализованного вируса, 20 мкл 0,2% SDS и 10 мкл PBS. Получали три значения оптической плотности, подсчитывали среднее значение. Соотношение для очищенного вируса при 260/280 составило 1,4. Вирусный титр определяли по формуле: значение при А260фактор разведения1,11012 вирусных частиц/мл. Определение вирусного титра по бляшкам 1. Для определения вирусного титра на шестилуночные культуральные планшеты высевали клетки линии HEK293A в количестве 1106 клеток/лунка. 2. В день инфицирования трипсинизировали клетки и производили подсчет в камере Горяева. 3.Готовили серийное разведение аденовируса в культуральной среде от 10-4 до 10-8. Общий объем смеси составил 1 мл. 4. Удаляли старую среду и наносили смесь, содержащую вирусные частицы в лунки культурального планшета. Инкубировали при +37 С в течение 12-16 часов. 5. Удаляли среду, содержащую вирусные частицы, и аккуратно покрывали лунки 2 мл среды DMEM c 4% содержанием агарозы (1 мл агарозы (t=+65 С) на 10 мл питательной среды DMEM). Смесь перемешивали пипетированием и наносили в лунки. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре, после чего возвращали в инкубатор с 5% содержанием CO2. 6. Через 48 часов покрывали лунки культурального планшета средой DMEM c 4% содержанием агарозы в объеме 1 мл. 7. Через 48 часов наблюдали образование бляшек. Лунки культурального планшета окрашивали 1 мл раствора Crystal Violet (Fermentas) в течение 10 минут, затем промывали дистиллированной водой. Подсчет бляшек проводили на микроскопе световом микроскопе AxyObserver (Carl Zeiss). 2.2 Получение мультицистронной конструкции на основе плазмиды pEGFP-N2, ко-экспрессирующей гены vegf165 и fgf2 Стандартную ПЦР-амплификацию проводили с использованием PS DNA Polymerase (TAKARA BIO INC.), которая оставляет концы амплифицированного фрагмента тупыми, что имело решающее значение при дальнейшей работе. В качестве ДНК – матрицы использовали плазмидную ДНК pBud-VEGF165-EGFP. Параметры ПЦР – амплификации представлены в таблице 9. Конечная концентрация ионов Mg2+ составила 1,5 мМ; праймеров – 25 мМ, нуклеотидные последовательности праймеров приведены в таблице 10.
Получение рекомбинантного аденовируса Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2
В результате ПЦР были получены ампликоны с длиной нуклеотидной последовательности 1200 п.н., что соответствует ожидаемому размеру целевой конструкции VEGF165-FuP2A-FGF2.
Продукты ПЦР-амплификации под номерами 12-14 были очищены из геля на колонке и использовались для дальнейшей ПЦР-амплификации с целью добавления attB-сайтов для дальнейшего клонирования в плазмидный вектор pDONR221 по технологии Gateway. Сайты attB сконструированы таким образом, что реакции рекомбинации между вектором-донором (в данном случае, ПЦР-продуктом) и вектором-назначения высоко специфичны. В участки attР-сайтов векторы pDONR221 внесены точечные мутации для элиминации стоп-кодонов. Для предотвращения образования вторичных структур в одноцепочечной ДНК в участки attB-сайтов также внесены точечные мутации в короткие фрагменты (5 п.н.). Первоначально ПЦР-амплификацию проводили с помощью градиентной ПЦР для оптимизации концентрации ионов Mg2+, а также поиска оптимальной температуры гибридизации праймеров. Результаты ПЦР-амплификации приведены на Рисунок 9. Рисунок 9 - Оптимизация ПЦР-амплификации с праймерами для создания фланкирующих сайтов. Градиентная ПЦР. Концентрация ионов Mg2+ 1мМ, 1,5 мМ, 2мМ (слева направо). Градиент температур: лунка (м.б. не лунка, а дорожка?) 1— 60С, лунка 2—59,6С; лунка 3—58,7С, лунка 4—57,1С; лунка 5—55,2С; лунка 6—53,6С; лунка 7— 52,5С; лунка 8—52С.
Таким образом, наиболее оптимальными условиями ПЦР амплификации являются температура отжига праймеров 52 С при 1мМ содержании магния в реакционной смеси (нужно пояснить, из чего это следует). Так, была получена кассета, содержащая кДНК генов vegf165 и fgf2, соединенных 2А-пептидной последовательностью вируса ящура. Схематичное изображение кассеты представлено на Рисунок 10. Схематичное изображение генетической кассеты, содержащей терапевтические белки, соединенные 2А-пептидной последовательностью вируса ящура После ПЦР-амплификации по вышеописанным условиям ПЦР-продукт был очищен на колонке и в дальнейшем использовался для рекомбинации в промежуточный вектор pDONR221. Реакция рекомбинации катализируется комплексом ферментов BP Clonase Enzyme mix. Рекомбинационной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli Top10. Наличие вставки проверяли методом ПЦР-скрининга колоний с использованием вектор-специфичных праймеров. Электрофореграмма представлена на Рисунок 11.
Селекцию клонов E. coli проводили по устойчивости к антибиотику канамицину. ПЦР-скрининг колоний выявил несколько клонов, содержащих целевую вставку длиной 1117 п.н. Для дальнейшей работы был выбран клон №15. Бактериальную колонию высевали в жидкую среду и выделяли плазмидную ДНК pDONR-VEGF165-FuP2A-FGF2 после 12-16 часов инкубации методом щелочного лизиса (процедура выделения плазмиды должна быть описана в методах).
Был проведен анализ первичной нуклеотидной последовательности образца плазмидной ДНК. Секвенирование ДНК подтвердило наличие трансгенной вставки генов vegf165 и fgf2 и отсутствие мутаций. Образец плазмидной ДНК pDONR-VEGF165-FuP2A-FGF2 №15 в дальнейшем использовали для проведения реакции LR-рекомбинации в экспрессионный аденовирусный вектор pAd/CMV/V5-Dest. Селекцию клонов проводили по устойчивости к антибиотику ампициллину. Рисунок 12 - Амплификация вставочного фрагмента с использованием вектор-специфичных праймеров. ПЦР-скрининг колоний в 1,5% агарозном геле. 1— отрицательный контроль, 2-32—исследуемые образцы, М-маркер GeneRuler DNA Ladder mix (Fermentas) Как видно из Рисунок 12, большинство клонов содержит трансгенную вставку размером 1200 п.н., что свидетельствует об эффективной рекомбинации в аденовирусный вектор. На основании результатов ПЦР-анализа было отобрано несколько клонов для выделения плазмидной ДНК pAd-VEGF165-FuP2A-FGF2. В дальнейшей работе использовали клон №2. Размер полученной конструкции составил около 37 т.п.н (Рисунок 13).
Рисунок 13 – Анализ выделения плазмидной ДНК pAd-VEGF165-FuP2A-FGF2 в 0,8% агарозном геле. М—маркер /HindIII (Fermentas), 1-3—образцы плазмидной ДНК pAd-VEGF165-FuP2a-FGF2 Для дальнейшей работы было необходимо получить препаративное количество плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК pAd-VEGF165-FuP2A-FGF2 проводили с использованием коммерческого набора GeneJet Plasmid Midiprep Kit (Thermoscientific) согласно инструкции производителя. Концентрация плазмидной ДНК составила 2205 нг/мкл.
В соответствии с целью исследования была поставлена задача: получить рекомбинантный аденовирус, кодирующий гены vegf165 и fgf2, соединенные между собой 2А-пептидной последовательностью вируса ящура в одной открытой рамке считывания.
Для получения аденовируса необходимо плазмидную ДНК pAd-VEGF165-FuP2A-FGF2 перевести из кольцевой формы в линейную с помощью гидролиза эндонуклеазой PacI, который обеспечивает удаление бактериальных последовательностей (точки начала репликации pUC и гена резистентности к ампициллину), а также создает концевые терминальные повторы. Очищенной смесью трансфицировали эмбриональную линию клеток почки человека HEK293A, содержащую Е1-промотор, который определяет раннюю транскрипцию вирусных генов и сборку аденовируса. Цитопатический эффект свидетельствовал об эффективной продукции вирусных частиц и сопровождался изменением морфологии клеток в сторону округления. Первичный вирусный сток получали проведением нескольких циклов замораживания-оттаивания с последующей фильтрацией через PVDF-мембрану с диаметром пор 0,22 мкм. Полученный сток использовали для амплификации и концентрирования вируса центрифугированием в градиенте хлорида цезия.
Для дальнейшей работы по исследованию иммуногенности белков VEGF165 и FGF2 в контексте мультицистронной конструкции in vivo полученный аденовирус диализовали против фосфатно-солевого буфера для удаления солей хлорида цезия. Титр аденовируса определяли методом прямого бляшкообразования в культуре клеток HEK293A с нанесением агарозного слоя, а также по оптической плотности. Подсчет титра аденовируса по оптической плотности проводили по формуле:
Титр аденовируса = OD260 фактор разведения 1,1 1012 вирусных частиц в 1 мл. – это должно быть в материалах Титр аденовируса Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2 составил 3,2109 БОЕ/мл при 1,61012 вирусных частиц/мл.
Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток из пуповинной крови человека трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза
Ранее, с использованием фуриновой протеазы Camper с соавторами сконструировали ретровирусный вектор, кодирующий тяжелую и легкую цепи иммуноглобулинов, для продукции моноклональных антител в клетках яичников китайского хомячка CHO (Chinese hamster ovary cells, CHO). Различные 2А-пептидные последовательности были подвержены гидролизу в разной степени, что коррелировало с уровнем синтеза моноклональных антител. Относительная эффективность гидролиза каждого 2А-пептида была схожей для экспрессии различных моноклональных антител в клетках CHO. (N. Camper, et al., 2011). Zhang с соавторами использовали 2А-пептидные последовательности с сайтом фуриновой протеазы для обеспечения эквимолярного биосинтеза белков CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) и TNF (tumor necrosis factor) для генерации конструкций в генной терапии ревматоидного артрита (W. Zhang et al., 2013).
В то же время, несмотря на большое количество работ по применению 2А пептидных последовательностей для экспрессии иммуноглобулинов (N. Camper, et al., 2011), репортерных белков (S.L. Appleby et al., 2013; E. Minskaia et al., 2013) и факторов транскрипции (K. Woltjen et al., 2009), в литературе отсутствуют данные по их применению для экспрессии комбинаций других типов терапевтических белков, например факторов роста.
Впервые нами были получены генетические конструкции, кодирующие гены сосудистого эндотелиального фактора роста и основного фактора роста фибробластов (VEGF и FGF2), соединенные между собой 2А-пептидной последовательностью и содержащие сайт гидролиза фуриновой протеазой. Сверхэкспрессия соответствующих терапевтических белков VEGF и FGF2 наблюдалась как в иммортализованной культуре клеток HEK293T, (в 70000 раз для VEGF и 53000 для FGF2), так и в первичных клеточных линиях— мононуклеарных клетках крови пуповины (в 1450 раз для VEGF и в 1666 раз для FGF2) и стволовых клетках из жировой ткани человека (в 2500 и 1100 раз соответственно), трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом Ad5 116 VEGF165-FuP2A-FGF2. Похожие результаты были продемострированы He c коллегами (B. He et al., 2011), где использование 2А-пептидных последовательностей вируса ящура обеспечивает эквимолярную ко экспрессию генов тяжелой и легкой цепи с дальнейшим формированием в процессе самосборки полноразмерной молекулы фактора коагуляции VIII. Поскольку использование конструкции, содержащей сайт гидролиза фуриновой протеазы, обеспечило полное удаление аминокислотных остатков на С-конце белка in vitro, эта экспрессионная система в дальнейшем использовалась для оценки однородности тяжелой цепи FVIII после доставки рекомбинантной ДНК in vivo. Также в литературе имеются данные, свидетельствующие об эффективном биосинтезе и -цепи гетеромерной молекулы Т-клеточного рецептора с лентивирусного вектора. Стехиометрический гидролиз обоих пептидов с формированием полноразмерной молекулы обеспечивался также благодаря введению сайта гидролиза фуриновой протеазой. Остатки на С-концевом домене -цепи не повлияли на функциональную активность Т-клеточного рецептора (S. Yang, et al., 2008).
Созданная нами конструкция на основе репликационно-дефектного аденовируса, содержащая сайт гидролиза фуриновой протеазой, также обеспечила эквимолярную сверхэкспрессию обоих терапевтических белков в первичных и иммортализованных клеточных культурах.
Для дальнейшего применения полученных конструкций в контексте генной терапии необходимым являлось исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков VEGF165 и FGF2 в составе плазмидного и аденовирусного векторов in vivo. Ввиду вирусной природы 2А-пептидных последовательностей велик риск их экспрессии в составе связанных ими белков с последующей экспрессией иммуногенных эпитопов, что значительно снижает жизнеспособность соответствующих генетически модифицированных клеток in vivo (C. Arber et al., 2013). При введении препарата плазмидной ДНК («голая» ДНК, ДНК+трансфицирующий реагент) нами была показана схожая динамика иммунного ответа на 2А-пептидный антиген. Статистически значимого иммунного ответа на антигены фактора роста сосудистого эндотелия и основного фактора роста фибробластов не наблюдалось как при введении плазмидной ДНК pVEGF165-FuP2A-FGF2-EGFP в комплексе с катионным раствором, так и при одиночном введении.
Нами были впервые получены данные, касающиеся иммуногенных свойств рекомбинантных белков сосудистого эндотелиального фактора роста и основного фактора роста фибробластов, соединенных между собой 2А пептидными последовательностями пикорновирусов в контексте аденовирусной экспрессионной системы. Методом иммуноферментного анализа была показана положительная реакция на антигены белков аденовируса и фактора роста сосудистого эндотелия. Примечательно, что в сыворотке животных не был зарегистрирован иммунный ответ на 2А пептидный антиген. Это свидетельствует об эффективном гидролизе 2А пептида фуриновой протеазой. Иммунный ответ к антигену сосудистого эндотелиального фактора роста свидетельствует о продукции антител в организме мышей в ответ на введение препарата аденовируса Ad5-VEGF165 FuP2A-FGF2.